Luận văn Nghiên cứu các thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây côm (elaeocarpus griffithi

late-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóa axit desoxyuridilique thành axit thymidilic. Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất 1.3.2.3 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome Girolline là một dẫn xuất 2-aminoimidazole. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng girolline có tác dụng ức chế tổng hợp protein và làm ngừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G2. Homoharringtonine là một alkaloid được phân lập từ cây Cephalotaxus harringtonia, thuộc họ (Cephalotaxaceae). Hợp chất này có khả năng ức chế tổng hợp protein bằng cách tác động sớm vào giai đoạn kéo dài peptide [30]. Hình 9: Ức chế tổng hợp protein 1.3.2.4 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme topoisomerase I và II Tác nhân đan xen vào chuỗi AND Doxorubicin tương tác với ADN bằng cách đan xen và ức chế sinh tổng hợp đại phân tử. [11] [18] Nhờ vào cấu trúc phẳng, doxorubicine có khả năng xen vào giữa các vòng xoắn được tạo thành giữa các bazơ của chuỗi ADN và như vậy ngăn chặn quá trình sao mã. Với cơ chế hoạt động tương tự, trong lớp chất này còn có actinomycin D. [27] Đây là một cyclopeptid có chứa phần cấu trúc phẳng được hình thành từ các vòng thơm. ơ Hình 10: Các chất đan xen chuỗi AND Ức chế enzyme topoisomerase I và II Topotecan là một dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin. Camptothecin là một sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ vỏ cây của loài Camptotheca acuminata. Topoisomerase-I là một enzyme có chức năng tháo xoắn một mạch. Khi topoisomerase-I tháo xoắn sợi đơn, topotecan xen giữa các bazơ của ADN. Sự đan xen này sẽ phá vỡ quá trình sao chép ADN và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào. Các tế bào động vật có vú không thể sửa chữa những sợi đôi bị phá vỡ này.[26] Trong nhóm ức chế enzyme topoisomerase-I, Irinotecan cũng là một trong những chất điển hình của nhóm này. Etoposide tạo thành một phức hợp với ADN và enzyme topoisomerase II, ngăn ngừa sự co xoắn của sợi ADN và dẫn đến phá vỡ sợi ADN.[13,12]. Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II 1.3.2.5 Gây độc trong quá trình phân bào Colchicine ức chế vi ống trên thoi gián phân bằng cách liên kết với tubulin, một trong những thành phần chính của vi ống. Tubulin là cần thiết để điều khiển quá trình phân bào và do đó colchicine có chức năng như một “chất độc phân bào hoặc chất độc của thoi” [36]. Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.)G.Don. Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián phân ở giai đoạn trung kỳ. Nhờ sự liên kết của thuốc với các vi cấu trúc hình ống khi gián phân, vincristine ức chế được sự tạo thành thoi gián phân. Trong tế bào ung thư, vincristine ức chế một cách chọn lọc cơ chế sửa đổi ADN ; và bằng cách ức chế ARN-polymerase phụ thuộc ADN, vincristine ức chế được sự tổng hợp ARN. Ở nồng độ cao vinblastine có thể hiện nhiều tác dụng phức tạp tổng hợp acid nucleic và protein [37]. Hình 12: Các tác nhân chống lại quá trình phân bào 1.3.2.6 Vacxin và kháng thể Một cách tiếp cận trong cuộc chiến chống lại ung thư là nghiên cứu vaccin hoặc các kháng thể đặc hiệu cho các thụ thể của tế bào ung thư. Phát triển trong lĩnh vực sinh học và công nghệ sinh học để xác định các yếu tố chịu trách nhiệm cho sự gia tăng của các tế bào khối u và sản xuất kháng thể đặc hiệu. Vaccin CDX-110 phòng chống các bệnh u thần kinh đệm, một loại u não ác tính và thường gặp nhất. Vaccin nhắm vào khối u, gây ra một phản ứng miễn dịch đặc hiệu để chống lại một loại protein ở trên bề mặt của các tế bào ung thư não, protein này là dạng thụ thể màng tế bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII, liên quan đến sự tăng trưởng của ung thư. Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ vừa nghiên cứu một loại vaccin mang tên Herceptin khả năng phòng ngừa tổng hợp lên tới khoảng 7 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư đường ruột và ung thư buồng trứngVaccin này có chứa một lượng nhỏ các protein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể, từ đó hệ miễn dịch có thể nhận biết sự xuất hiện của tế bào ung thư và hệ miễn dịch có thể chủ động tấn công [38]. Cevac là một loại vắc-xin chống lại bệnh ung thư đại tràng, là một kháng thể đơn dòng gây ra một phản ứng miễn dịch với CEA (Carcino Embryonic Antigen). Kháng nguyên CEA này hiện diện trong ung thư ruột. Mặt khác, việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị liệu làm tăng tỷ lệ sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho bệnh nhân kết hợp với fluorouracil-5 và leucovorin. Đề kháng với các chất chống ung thư là một trong những thách thức lớn của hóa trị liệu. Sự đề kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ. Yếu tố có thể là do: - Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase-β. - Giảm sự xâm nhập của thuốc vào trong tế bào (làm giảm nồng độ của thuốc trong các tế bào). - Sự gia tăng từ trong ra ngoài của các khối u tế bào đa kháng . - Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mang bệnh. - Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích. Điều trị ung thư bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ và đôi khi còn gây chết người. Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới chống ung thư là cần thiết và các phân tử từ tự nhiên luôn là nguồn tài nguyên quý giá. 1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thư Hiện nay, ung thư vẫn là bài toán khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất của con người do chưa có thuốc đặc trị. Vì thế, các nhà khoa học vẫn không ngừng kiếm tìm các hợp chất mới để tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các phương pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật...đều để lại tác dụng xấu, nhiều bệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển và diệt tế bào ung thư như Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford-Burnham, đứng đầu là Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là sceptrin được tìm thấy trong các loài bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế bào ung thư và có độc tính rất thấp. Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung thư trực tràng Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol-một hợp chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào ung thư như nhạy cảm hơn với xạ trị. Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm được những hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư 1.4 Các phương pháp nghiên cứu độ độc tế bào Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB. 1.4.1 Phương pháp MTT Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào. 1.4.2 Phương pháp SRB Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng. 1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực vật   Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Nhữn sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được viết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây thuốc phiện (họ Papaveraceate; cây canh kin a (họ Rubiaceae); cây cà độc dược, thuốc lá và khoai tây. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung trong lá. Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffeine, atropine, strychnine), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropine), một số tác dụng lên mạch máu, một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp. Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước. Terpên được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene. Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Cây Côm (E. griffithii) được thu hái vào ngày 5 tháng 2 năm 2004 tại Qùy Châu, Nghệ An và được ThS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Mẫu tiêu bản số VN 1249 được lưu trữ tại Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Vỏ cây tươi sau khi sấy khô, xay nhỏ thu được 1,4 kg nguyên liệu. 2.1.2. Các dạng tế bào Các dạng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB (Human epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào; và MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú. 2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 Merk, độ dày 0,2mm. Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 63- 100 mm Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 40mm - 63 mm Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau. Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml) Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. 2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào: AMEM và AMEM có bổ sung 1% insulin, trypsin-EDTA (Gibco, Hoa kỳ) Dung môi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO Tủ ấm CO2 (Innova CO-170); Tủ cấy vô trùng cấp I ( Labcaire), cấp II (SterilGard II); Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL) Tủ lạnh sâu -25oC, - 800C Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ) Máy quang phổ (GENios Tecan) Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp hóa học 2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng Dựa vào nguyên lý chiết và tài liệu tham khảo chúng tôi thực hiện ngâm chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần. Thực hiện ngâm chiết mẫu lần lượt với các dung môi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường. Mỗi loại dung môi tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h. 2.2.1.2. Sắc ký cột (Colum chromatography - CC) Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất dựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử. Trong nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là silica gel (hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc gel LH-20. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck loại 40 - 63mm với dung môi rửa giải thích hợp. 2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC) S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác định số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tách ra từ đó. Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ dịch chuyển khác nhau nên tách ra ở vị trí khác nhau. Đây là phương pháp vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ = 254 nm và λ = 366 nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2. Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn hệ dung môi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất. 2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS) Khối phổ là một trong các phương pháp được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát triển ra ion phân tử, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử. Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear magnetic resonance spectrometry - NMR) Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS là chất chuẩn nội. 2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử hoạt độc tính. Mẫu thô có IC50 £ 50 mg/ml; chất sạch có IC50 £ 30 mg/ml được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư. Thử độc tế bào: - Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 mg/ml; 32mg/ml; 8mg/ml; 2mg/ml; 0,5mg/ml. Bổ xung 200ml dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng. Giếng điều khiển có 200 ml dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h. - Sau 72h thêm 50 ml MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 ml DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. GI %=OD điều khiển-OD mẫuOD điều khiển x 100 GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. Thí nghiệm được lặp lại với n = 3 2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm 2.3.1 Thành phần hóa học 2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat Vỏ cây được thu hái, phơi khô trong bóng mát, sấy khô ở 40-50oC cho đến khi độ ẩm đạt ≤ 13% và nghiền nhỏ cân được 1,44 kg. Nguyên liệu này được ngâm chiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3 lần, mỗi lần 24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH. Các dịch chiết này được cất loại dung môi dưới áp suất thấp, kết quả thu được 52g cặn chiết etylaxetat và 172,8 g cặn chiết MeOH. Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu phần cặn chiết EtOAC. Quy trình tách chiết dịch etylaxetat được trình bày theo sơ đồ sau: Vỏ cây Côm (1,44 kg) Ngâm chiết trong Et (3 lần, mỗi lần 24h ) Cất loại dung môi dưới áp suất thấp Cặn chiết EtOAC (52 g) Cặn chiết MeOH (172,8) g) Bã Ngâm chiết trong MeOH (3 lần, mỗi lần 24h). Cất loại dung môi dưới áp suất thấp Bã Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Côm 2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần từ 0 - 30 %, thu được 5 phân đoạn được ký hiệu từ E1 – E5. Phân đoạn E1 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 50- 70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1-E1.24. Phân đoạn E1.7 được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 2- 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2. Phân đoạn E1.7.1 tiếp tục được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient (95:5) và giải hấp cột với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH gradient cho hợp chất F1 (12 mg). Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n-Hexan:diclometan (3:7) thu được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC) với hợp chất β-sitosterol chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm. Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất F2. Ngoài ra, dịch lọc được quay khô rồi tinh chế trên cột silica gel với dung môi rửa giải là CH2Cl2 / MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng. Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol glucoside dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC) với hợp chất β-sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm. Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1-E5.11. Tinh thể của phân đoạn E5.4 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 cho hợp chất F3 (7 mg). Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột sephadex LH-20 thu được hợp chất F4 (5 mg). Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Côm 2.3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từ dịch chiết etylaxetat Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đã nêu trong phần 2.2.2 Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độ đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thử tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấp hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 μl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thử nghiệm để được các nồng độ 128 mg/ml; 32mg/ml; 8mg/ml; 2mg/ml; 0,5mg/ml. Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong khuôn khổ dự án Pháp – Việt về “Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực vật Việt Nam”, cây Côm đã được thử sơ bộ hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Côm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB (ức chế 89,45 % ở nồng độ 1 µg/ml). Chính vì vậy vỏ cây Côm được tiến hành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.1.1 và mục 2.3.1.2 3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết etylaxetat Từ cặn chiết EtoAc chúng tôi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ 2.2. Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1-F4. Các chất này được xác định cấu trúc hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ của chúng với các dữ liệu phổ đã được công bố. 3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate) Trên phổ EI-MS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tại m/z 544. Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl ở trường cao δH 0,88 (t, J = 7 Hz, CH3-25’) và một nhóm methoxy (OCH3) ở δH 3,915. Ở vùng trường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm bị thế hệ ABX, ở δH 6,86 (d, J = 8 Hz, H-5), 7,05 (dd, J = 2 Hz và 8 Hz, H-6) và 7,08 (d, J = 2 Hz, H-2). Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hình trans (E) ở δH 6,39 (d, J = 16 Hz, H-8) và 7,61 (d, J = 16 Hz, H-7). Ngoài ra còn có tín hiệu của 24 nhóm methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton ở δH 4,10 (t, J = 6,5 Hz, CH2-1’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy. Trên phổ 13C NMR và DEPT của F1, ngoài các tín hiệu tương ứng với các nhóm đã được quan sát trên phổ 1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của nhóm cacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa ở δC 126,1, 147,4 và 148,5. Các cacbon ở δC 147,4 và 148,5 cho thấy chúng được liên kết với nguyên tử oxy. Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR, công thức phân tử của chất F1 được xác định là C35H60O4. Phân tich phổ 2D NMR cho thấy sự có mặt của 2 mảng cấu trúc của hợp chất F1: A) axit ferulic, B) pentacosan-1-ol. Việc kết nối giữa 2 phần cấu trúc này được thực hiện nhờ phân tích phổ HMBC. Trong đó tương tác giữa cacbon cacboxylate ở với proton của nhóm CH2-1’ ở được quan sát thấy trên phổ HMBC của F1. Điều này cho thấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan-1-ol. Như vậy hợp chất F1 được xác định là pentacosyl ferulate. Hợp chất này đã được phân lập trước đây từ loài Bauhainia manca. Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F1 trong DMSO Cno δC δH m (J, đơn vị Hz) Cno δC δH m (J, đơn vị Hz) 1 126,1 7 144,96 7,61 d (16) 2 109,92 7,08 d (2,0) 8 114,4 6,39 d (16) 3 147,4 9 167,8 4 148,5 1’ 64,37 4,10 t (6,5) 5 114,9 6,863 d (8,0) 2’-24’ 28,32 1,71 s (7,0; 7,5) 6 122,6 7,05 dd (2,0; 8,0) 25’ 13,438 0,88 (7,0) δC Độ chuyển dịch hóa học của C δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet 3.1.2 Chất F2 (Axit 3,3’,4’-tri-O-metyl-4-[O-β-D-(2”-acetyl)-glucopyranoside]-ellagic) Hợp chất F2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M+Na]+ ở m/z 571. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất F1, cho tín hiệu của 3 nhóm metoxy ở δH 3,91 (s, 3H); 3,97 (s, 3H); 3,99 (s, 3H) và tín hiệu của 2 proton vòng thơm ở δH 7,32 (s, 1H) và 7,71 (s, 1H). Ngoài ra, còn có tín hiệu của 1 nhóm axetyl ở δH 2,10 và các proton của đường nằm trong khoảng δH 3,39-5,36 trong đó proton anome H-1” ở δH 5,36 (d, J=8,0 Hz, 1H). Phổ 13C-NMR và DEPT xác nhận sự có mặt của các tín hiệu của 25 cacbon trong đó có nhóm đường [δC 60,4 (CH2-6”), 69,6 (C-5”), 73,5 (C-3”), 73,7 (C-2”), 77,4 (C-4”), 98,9 (C-1”)], 3 nhóm metoxy, 1 nhóm axetyl và 14 cacbon sp2. Độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu tại δC 157,6 (C-7’) và 157,8 (C-7) cho thấy nhiều khả năng đây là các tín hiệu của nhóm cacbonyl lacton. Các dữ kiện thu được cho phép giả thiết F2 là dẫn xuất của axit ellagic. Điều này được khẳng định nhờ phân tích phổ HMBC (Hình 14). Ngoài ra, trên phổ HMBC cho thấy H-1” của nhóm đường tương tác với C-4 của khung axit ellagic chứng tỏ nhóm đường gắn kết ở vị trí C-4. Tương tác giữa H-2’’ của nhóm đường với nhóm cacbonyl của axetyl chứng tỏ nhóm axetyl gắn với đường ở vị trí C-2’’. Tương tự, 3 nhóm OCH3 tại δH 3,99, 3,97 và 3,91 được xác