Luận văn Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn

hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay [30]. Trước đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sống ngắn ngủi của các tương bào. Kháng thể chỉ thu được in vivo bằng cách tiêm một kháng nguyên cụ thể vào một động vật rồi chiết lấy kháng thể trong máu. Phương pháp này rất tốn kém nhưng chỉ thu được lượng kháng thể rất ít, không thuần nhất và bị ô nhiễm [30], [36]. + Kháng thể đa dòng: là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitop khác nhau trên một kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitop của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng. 1.5.2. Đặc tính và ứng dụng Kháng thể là một protein sinh học đặc thù, có cấu tạo phức tạp và có tác dụng đặc hiệu, do động vật cấp cao sản sinh ra. Nó là “chất miễn dịch” giúp cho cơ thể không mắc bệnh đối với tác nhân gây ra nó (kháng nguyên). Đối với động vật máu nóng, khoa học đã nghiên cứu về kháng thể từ rất lâu cùng với hỗ trợ của các tiến bộ sinh học phân tử, tuy nhiên vẫn còn nhiều câu hỏi chưa giải đáp được. Các nghiên cứu tập trung nhiều vào y học, thú y và đã có những thành tựu rực rỡ trong phòng bệnh và chữa bệnh cho người và gia súc [22]. Cơ thể động vật chỉ sinh ra kháng thể khi được tiếp xúc với kháng nguyên, mà các kháng nguyên ta đang quan tâm ở đây là các mầm bệnh như vi khuẩn, virut gây bệnh cho gia súc. Nếu chưa từng tiếp xúc với kháng nguyên thì cơ thể không sản sinh kháng thể, nghĩa là động vật chưa có miễn dịch và có thể bị mầm bệnh tấn công. Muốn phòng được bệnh, cơ thể cần có kháng thể, dựa trên cơ sở đó, khoa học đã dùng kháng thể để phòng bệnh và chữa bệnh [30]. Kháng thể thường lấy từ máu động vật đã được miễn dịch với kháng nguyên (mầm bệnh, vi khuẩn, virut,...) theo mục đích đã định. Kháng thể hòa tan trong phần dịch thể của máu động vật (trong huyết thanh). Người ta đã chế được huyết thanh có chứa kháng thể (kháng huyết thanh). Trong thú y, người ta đã chế tạo kháng huyết thanh chống bệnh tụ huyết trùng, bệnh đóng dấu lợn, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh dịch tả lợn.... được dùng để chữa bệnh và phòng bệnh rất tốt [30]. Tính ưu việt của kháng thể so với chất kháng sinh là: Kháng thể chống được virut, chống được cả độc tố (chất kháng sinh không làm được). Kháng thể thụ động có tác dụng kéo dài tới 2 tuần lễ (chất kháng sinh chỉ có tác dụng từ 6 -24 giờ). Kháng thể tác động đặc hiệu mầm bệnh, không tác động tràn lan ngoài ý muốn. Kháng thể không gây “kháng thuốc” nên không gây hậu quả cho sinh thái môi trường. Kháng thể cung cấp miễn dịch nhanh chóng trong vài giờ, được dùng phòng bệnh khẩn cấp khi cần qua lại vùng đang có dịch, điều trị bệnh cấp tính có hiệu quả tức thì. Kháng thể ngoài tác dụng phòng trị bệnh đặc hiệu, nó còn có tác dụng như một protein liệu pháp, giúp con vật sau khi sử dụng tăng trưởng tốt hơn. Rõ ràng kháng thể có tính ưu việt nổi trội về nhiều mặt trong phòng và chữa bệnh, đặc biệt với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho gia súc và cả con người. Tuy nhiên chế tạo kháng thể vô cùng phức tạp, có giá thành cao, khó ứng dụng mở rộng được vì lý do kinh tế. Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đề hấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loại kháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinh kháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó. Tuy nhiên, ta không thể có đủ lượng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhưng có một điều thú vị là kháng thể trong huyết thanh gà lại được truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà [36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh được các bệnh tật. Vậy ta có thể sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà không?. Các thí nghiệm đã chứng minh: trứng của gà được miễn dịch có chứa kháng thể chống lại các vi khuẩn, virut, độc tố mà người ta đã tiêm để gây miễn dịch cho gà. Kháng thể trong lòng đỏ cũng kết hợp đặc hiệu với các mầm bệnh tương ứng [42], [45]. Thời cổ xưa, con người cũng đã biết dùng lòng đỏ trứng gà để chống các bệnh do vi khuẩn, virut ở đường ruột, xoang miệng và dùng ngoài da, đó chính là ứng dụng phương pháp miễn dịch thu động. Lòng đỏ trứng gà có thành phần: 48% là nước, 17,8% protein và 30,5% lipid. Hầu hết (mỡ) lipid trong lòng đỏ trứng được kết hợp với protein (lipoprotein) hơn là ở dạng lipid tự do. Protein trong lòng đỏ trứng cũng có dạng không kết hợp với lipid, mà ở dạng protein hòa tan được trong nước. Kháng thể trong lòng đỏ trứng là loại protein hòa tan trong nước và cùng với lipoprotein tạo thành dạng nhũ dịch trong lòng đỏ [45]. Ngày nay, người ta đã chứng minh và có nhiều bằng sáng chế về sản xuất kháng thể trong lòng đỏ trứng, cho đến nay người ta đã được xác định được bản chất của kháng thể đó là IgY do các tài liệu khác còn gọi là: IgG gà (chicken IgG), IgG lòng đỏ trứng (Egg yolk IgG), hoặc 7S IgG. IgY - globulin miễn dịch có trong lòng đỏ trứng có thể có hàm lượng khoảng từ 5 đến 20 mg/trong 1 ml. Hàng loạt kháng nguyên đã được dùng để sản xuất kháng thể IgY và cho kết quả tốt như với Newcastle, E. coli, liên cầu khuẩn, nọc rắn v.v... IGY có khối lượng phân tử khoảng 180 kDa, mỗi chuỗi nhẹ khoảng 25 kDa, mỗi chuỗi nặng khoảng 65 - 68 kDa. Điểm đẳng điện 5,7 - 7,6 (6,6 ± 0,9). Gà mái có thể sinh ra các kháng thể nhận biết nhiều epitop khác nhau hơn so với các kháng thể do động vật có vú sinh ra [45]. IgY có chức năng tương tự như kháng thể của thỏ và động vật có vú khác, do đó nó có giá trị kinh tế hơn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (đặc biệt với việc sản xuất các kháng thể đơn dòng). 12 quả trứng gà chứa khoảng 1 gam kháng thể IgY, tương đương tổng số kháng thể IgG có trong 100ml huyết thanh, vì vậy 1 con gà mái có thể thay thế 12 con thỏ dùng sản xuất kháng thể trong 1 năm. Mỗi gà mái, một tháng có thể sản xuất 2,5 g IgY. Kháng thể đặc hiệu có thể chiếm từ 0,5 đến 10% tổng số IgY tùy theo việc sử dụng kháng nguyên miễn dịch [36]. Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thí nghiệm Mẫu phân, bệnh phẩm: phân lợn con bị tiêu chảy ở giai đoạn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Phân và bệnh phẩm lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi mắc bệnh phù đầu đã chết hoặc gần chết gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, gan, lách, phổi, phân trong trực tràng. 2.1.2. Động vật thí nghiệm Chuột bạch: 18 - 20 gam, khỏe mạnh; chuột lang trưởng thành; thỏ: 2,5-3,0 kg, khỏe mạnh, không mắc bệnh ngoài da; gà đẻ giống siêu trứng (Hyline, Leghorn): trung bình 2,5-3 kg/con. 2.1.3. Các loại hóa chất, môi trường, kháng huyết thanh 2.1.3.1. Các loại môi trường Bao gồm: thạch máu, thạch Mac Conkey, NB (nutrient broth), NA (nutrient agar), môi trường BHI, môi trường do hãng Oxoid (Anh) sản xuất. 2.1.3.2. Các loại hóa chất Các loại đường: lactose, sucrose, dulcitol, salicin, sorbitol, arabinose, raffnose, mannitol, rhamnose, xylose, maltose, trehalose. Thuốc nhuộm Gram, dung dịch PBS, dung dịch Kowacs, dung dịch Andrader do hãng Oxoid sản xuất. 2.1.3.3 Các loại huyết thanh chuẩn để định type E. coli Kháng huyết thanh chuẩn xác định nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh (serotype) của E. coli (Nhật Bản). 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ Máy móc, thiết bị: máy ly tâm (Eppendorf), máy lắc (Nhật), cân vi lượng (Sartorius, Đức), lò vi sóng, máy Vortex, nồi lên men (Trung Quốc), máy đo pH (Mỹ), máy đo OD, v.v... Dụng cụ: pipetman (Eppendorf), đầu côn 1000ml, 200ml (Greiner Bio-one), ống ly tâm kích cỡ 15ml, 50ml, phiến kính, bình tam giác thủy tinh các cỡ, v.v... Các dụng cụ phải được sấy hoặc hấp vô trùng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu phân được lấy từ trực tràng lợn con bị tiêu chảy cho vào ống nghiệm vô trùng đem về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Bệnh phẩm là phủ tạng lợn được lấy bằng cách đưa cả con lợn bị phù đầu đã chết hoặc gần chết về phòng thí nghiệm, mổ lấy bệnh phẩm gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, ruột, gan, lách, phổi trong trực tràng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. 2.2.2. Phân lập, giám định và xác định các yếu tố gây bệnh của E. coli 2.2.2.1. Phương pháp phân lập và giám định E.coli Quy trình phân lập và giám định E. coli được trình bày theo sơ đồ 1. Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân, bệnh phẩm ở độ pha loãng 10-5 trên thạch Istrati. Sau khi cấy và bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ đếm khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc có dạng S, có màu vàng đặc trưng trên môi trường thạch Istrati cấy sang môi trường Mac Conkey và môi trường Brilliant green agar bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chất mọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết. Nếu thuần khiết, cấy giữ giống trên thạch máu để tiến hành kiểm tra hình thái và giám định các tiêu chuẩn khác. Sơ đồ 1: Phân lập và giám định E. coli từ phân và bệnh phẩm Phân hoặc bệnh phẩm lợn bị tiêu chảy, phù đầu Brilliant green agar (Khuẩn lạc màu vàng chanh) Istrati(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S, màu vàng) Mac Conkey (Khuẩn lạc màu đỏ cánh sen) Khuẩn lạc thuần khiết Giữ trên thạch máu Tính chất sinh học Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Cấy trên các môi trường sinh hóa KIA, Mannitol, Ureindol, Simon Citrate pha loãng 10-5 2.2.2.2. Giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli phân lập được bằng phương pháp thường quy Từ các giống E. coli phân lập đã được thuần khiết, tiến hành giám định một số đặc tính sinh vật hóa học cơ bản như đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và các phản ứng lên men đường. - Kiểm tra hình thái học: từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra. - Kiểm tra khả năng di động: cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem di động của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo. - Kiểm tra tính chất mọc bằng cách nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, thạch máu, các môi trường đặc biệt như: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar. Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc. - Kiểm tra các đặc tính lên men đường của E. coli: Trên môi trường thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar) Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, ria một đường ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhưng không chạm vào đáy ống, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả (chậm nhất là 48 giờ). Môi trường KIA cho phép đọc các tính chất: Khả năng lên men đường lactose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose làm cho phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, ngược lại thì giữ nguyên màu. Khả năng lên men đường glucose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose thì chuyển phần thạch đứng từ màu hồng sang màu vàng rõ, vi khuẩn không lên men đường glucose thì giữ nguyên màu. Nếu sinh hơi thì phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong thạch đứng, có thể đẩy toàn bộ phần thạch lên cao, ở dưới là hơi. Khả năng lên men các loại đường khác Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth đã bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch đường cần kiểm tra, cấy vi khuẩn vào, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển màu hồng, âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu. Phản ứng sinh Indol Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, cấy E. coli cần kiểm tra, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 43 - 470C/24 giờ, nhỏ thuốc thử Kowacs vào. Phản ứng dương tính khi một vòng tròn đỏ xuất hiện ở trên cùng ống môi trường nuôi cấy. Phản ứng âm tính khi vòng tròn đỏ không xuất hiện. 2.2.2.3. Xác định serotype của E. coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính theo phương pháp thường quy - Vật liệu dùng xác định: Các chủng E. coli được lưu giữ trên thạch máu. Kháng huyết thanh chuẩn (nhóm và đơn giá), nước muối sinh lý 0,85%, phiến kính sạch. - E. coli có nhiều serotype, vì vậy để xác định serotype E. coli, tiến hành làm phản ứng với kháng huyết thanh nhóm (serogroup), sau đó mới tiến hành xác định serotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đã ngưng kết. Cách tiến hành như sau: Trên một phiến kính sạch, ở hai đầu nhỏ hai giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định serotype mọc trên thạch Mac Conkey hoặc thạch máu hòa tan vào hai giọt nước muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính. Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy kháng huyết thanh nhóm trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, huyễn dịch vi khuẩn bên kia phiến kính không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả phản ứng. Phản ứng dương tính khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn xuất hiện những hạt ngưng kết lấm chấm, mức độ ngưng kết được đánh giá theo thang bậc: +, ++, +++, ++++. Phản ứng âm tính khi huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn đục đều không có hạt ngưng kết xuất hiện như bên đối chứng âm. Chọn những khuẩn lạc có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiến hành làm ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm như đã tiến hành với nhóm. Nhận xét kết quả như đối với kháng huyết thanh nhóm. Nếu một vi khuẩn ngưng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng huyết thanh đơn giá thì phải tiến hành pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo hệ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,...), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng. Serotype nào ngưng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất thì đó là serotype của vi khuẩn. 2.2.2.4. Xác định độc lực của E. coli theo phương pháp của Cater (1984) [64] Mỗi chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột, liều 0,2 ml dịch nuôi cấy 24giờ/370C vào phúc xoang. Theo dõi số chuột chết và thời gian giết chết chuột của vi khuẩn trong 7 ngày. Chuột chết được mổ kiểm tra bệnh tích và lấy máu tim, phủ tạng nuôi cấy phân lập vi khuẩn. 2.2.2.5. Xác định khả năng dung huyết của E. coli bằng phản ứng gây dung huyết trên thạch máu bê 10% Giống E. coli thuần khiết được ria cấy trên môi trường thạch máu bê 10%, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đánh giá kết quả: Dung huyết hoàn toàn (b-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu to, rõ, có thể nhìn qua được môi trường. Dung huyết không hoàn toàn (a-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu nhỏ, có ánh xanh. Không dung huyết (g-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu. 2.2.2.6. Xác định các gen độc tố (LT, STa, STb và VT2e) bằng phương pháp PCR Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các gen độc tố của E. coli, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó. - Cách tiến hành: ADN mẫu: khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370C/24h. Hỗn hợp phản ứng PCR: Primers: 1 ml mỗi loại Dung dịch đệm (5 X): 5,0 ml Enzym (Taq polymerase): 0,5 ml Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25ml cho 1 phản ứng. Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo bảng 1. Chạy điện di: sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), được trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium bromide (1ml/ml) trong vòng 15 phút đọc kết quả. Bảng 1: Chu trình của phản ứng PCR Thành phần Chu trình thứ nhất 30 chu trình tiếp theo Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) ADN khuôn, primer, Taq polymerase, dNTP 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 - Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng ADN được so sánh với ADN chuẩn (ADN marker). 2.2.3. Phương pháp chế tạo kháng nguyên Dùng các chủng E. coli đã lựa chọn nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng riêng từng chủng ở 37oC/24 giờ, kiểm tra đậm độ vi khuẩn, kiểm tra thuần khiết, bất hoạt bằng nhiệt độ hoặc hóa chất, kiểm tra vô trùng, chia lọ để sử dụng. 2.2.4. Nghiên cứu qui trình miễn dịch để đạt hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà cao nhất Chúng tôi tiến hành thử nghiệm tiêm miễn dịch cho 3 đàn gà thí nghiệm, mỗi đàn theo một qui trình khác nhau, sau đó định kỳ hàng tuần kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà để tìm ra qui trình hợp lý, cho hiệu giá kháng thể trong máu gà cao nhất, ổn định nhất. 2.2.5. Phương pháp định tính hàm lượng kháng thể trong sản phẩm bằng khả năng bảo hộ của kháng thể chống lại E. coli trên động vật thí nghiệm Dùng chuột bạch thể trọng mỗi con 18 - 20g, khoẻ mạnh. Chia làm 2 nhóm: Nhóm 1: Mỗi con tiêm 0,4 ml kháng thể vào phúc xoang; sau 24 giờ tiêm lần hai cùng liều. Nhóm 2: Không tiêm, làm đối chứng. Sau 48 giờ kể từ khi tiêm kháng thể lần hai, công cường độc cho cả hai nhóm chuột với liều tiêm dưới da mỗi chuột 0,2 ml canh trùng 24 giờ của các chủng E. coli. Theo dõi chuột trong 7 ngày sau đánh giá kết quả. Tính hiệu số của số lượng chuột sống sót của nhóm 1 (nhóm được tiêm miễn dịch bằng kháng thể) và số lượng chuột sống sót của nhóm 2 (nhóm đối chứng). 2.2.6. Phương pháp định lượng hàm lượng kháng thể trong sản phẩm bằng phản ứng ngưng kết giữa kháng thể trong sản phẩm với kháng nguyên E. coli tương ứng Có thể thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính hay ngưng kết chậm trong ống nghiệm theo thường qui. Pha loãng kháng thể bằng nước muối sinh lý theo các độ pha loãng khác nhau (theo cấp số 2). Lấy một lượng kháng thể đã pha ở mỗi hiệu giá và một lượng kháng nguyên E. coli bằng nhau, trộn đều, để ở nhiệt độ khoảng 250C. Nếu là ngưng kết nhanh trên phiến kính thì đọc kết quả sau 3-5 phút, nếu là ngưng kết chậm trong ống nghiệm thì đọc kết quả sau 6-12 giờ bằng mắt thường. Đối chứng âm làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể bằng nước sinh lý. Đối chứng dương làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể trong sản phẩm bằng kháng thể E. coli đã biết. 2.2.7. Phương pháp chế tạo kháng thể Thu hoạch trứng, tách lòng đỏ, cho vào làm đồng nhất bằng máy, bổ sung dung môi và chất bảo quản, ra chai, bảo quản. Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1. Phân lập E. coli, chọn E. coli có độc lực, có tính kháng nguyên 3.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm lợn ốm tiêu chảy và sưng phù đầu Các mẫu được thu thập ở 8 huyện của 5 tỉnh đại diện cho 3 miền Bắc - Trung - Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập được tổng số 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn ốm có triệu chứng mắc bệnh sưng phù đầu và tiêu chảy do E. coli gây nên. Các loại mẫu bệnh phẩm chúng tôi thu thập là: phân, lợn nguyên con, tim, gan, ruột và hạch ruột của lợn bệnh. Kết quả cụ thể trong bảng 2. Bảng 2: Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm lợn ốm tiêu chảy và sưng phù đầu Địa điểm Số cơ sở lấy mẫu Lợn nguyên con Phân Tim Gan Ruột, hạch ruột Tổng số mẫu Miền Nam 40 5 15 20 18 22 80 Miền Trung 40 14 20 21 22 23 100 Miền Bắc 80 30 35 37 30 28 160 Tổng cộng 160 49 70 78 70 73 340 3.1.2. Nuôi cấy đặc hiệu cho E. coli, sàng lọc vi khuẩn tạp Từ 340 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở các vùng, miền trên cả nước, bước đầu chọn lọc E. coli, chúng tôi dùng môi trường đặc hiệu cho E. coli là môi trường Mac Conkey. Kết hợp với các môi trường khác như là môi trường thạch máu, môi trường nước thịt, môi trường thạch thường, môi trường yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm giống với E. coli, loại được những vi khuẩn tạp (không phải là E. coli). Kết quả cụ thể được thống kê ở bảng 3. Qua bảng 3 thấy rằng: từ 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn có dấu hiệu mắc bệnh sưng phù đầu và ỉa chảy do E. coli gây nên, trên môi trường Mac Conkey phân lập được 266 mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với hình thái khuẩn lạc E. coli (màu hồng cánh sen), chiếm tới 78,24%. Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ 85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với E. coli. Bảng 3: Kết quả phân lập E. coli từ các mẫu bệnh phẩm STT Địa điểm lấy mẫu Số lượng mẫu Số lượng mẫu có E. coli Tỷ lệ % 1 Đồng Nai 80 68 85,0 2 Bình Định 50 37 74,0 3 Nghệ An 50 34 68,0 4 Hưng Yên 80 65 81,25 5 Hà Tây 80 62 77,5 Tổng 340 266 78,24 Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên tiêu bản khi nhuộm Gram: vi khuẩn có dạng trực khuẩn, hai đầu tròn, bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ. Từ 266 mẫu vi khuẩn thu được ở trên, chúng tôi chọn ra được 135 mẫu vi khuẩn để làm các công việc tiếp theo trong quá trình chọn lọc giống E. coli. Do tính chất rất hay thay đổi của E. coli, chúng tôi tiến hành đông khô ngay các chủng đã phân lập được để đảm bảo tính nguyên vẹn của vi khuẩn, tránh những biến đổi trong quá trình cấy chuyển gây nên. 3.1.3. Tiến hành các phản ứng sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được 3.1.3.1. Kết quả kiểm tra đặc tính lên men các loại đường và khả năng sinh hơi Sau khi sơ bộ phân lập được 135 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm. Chúng tôi xác định đặc tính lên men các loại đường: sorbitol, arabinose, galactose, maltose, salicin, lactose, mannit, glucose, fructose, raffinose, saccharose, mannose. Đồng thời cũng xác định khả năng sinh hơi của 135 chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả cụ thể như sau: Bảng 4: Khả năng lên men các loại đường của 135 chủng vi khuẩn phân lập được Số mẫu N=135 Sor Ara Gal Mal Sal Lac Mat Glu Fru Raf Sac Man Gas Kết quả + + + + - + + + + + - + + Số mẫu 101 135 135 135 135 135 135 135 135 120 135 135 135 *Sor: Sorbitol Ara: Arabinose Gal: Galactose Mal: Maltose Sal: Salicin Lac: Lactose Mat: Mannit Glu: Glucose Fru: Fructose Raf: Raffinose Sac: Saccharose Man: Mannose Gas: Phản ứng sinh hơi (+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính Đặc điểm sinh hoá của E. coli là có khả năng lên men các loại đường glucose, đường lactose và một số đường khác, nhưng không có khả năng lên men đường saccharose cũng như đường salicin. Qua bảng 4, ta thấy tất cả các chủng phân lập được đều có đầy đủ các tính chất sinh hoá đặc trưng của E. coli, do đó các chủng này tiếp tục được xác định khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu. 3.1.3.2. Kết quả xác định đặc tính dung huyết của các chủng Chúng tôi tiến hành xác định khả năng dung huyết của các chủng theo phương pháp sau: các chủng E. coli được ria cấy trên môi trường Blood Agar Base có bổ sung 10% máu bê, nuôi cấy ở điều kiện 37oC/18 - 24giờ, đọc kết quả. Khả năng gây dung huyết được đánh giá theo 3 kiểu là a-haemolysin (ký hiệu: a) ; b-haemolysin (ký hiệu: b) và âm tính (ký hiệu: -). Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 5. Bảng 5 cho thấy, trong 135 chủng E. coli đã được chọn lọc ở trên chỉ có 50 chủng có khả năng dung huyết chiếm 37%, còn lại 85 chủng không có khả năng dung huyết (chiếm 63%). Theo các tài liệu nghiên cứu trước đây, các chủng có khả năng dung huyết là các chủng có độc tính, có khả năng gây bệnh trên lợn cao hơn so với các chủng không dung huyết (theo tài liệu nghiên cứu của: Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh và Đỗ Ngọc Thuý về kết quả phân lập E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị). Vì vậy chúng tôi đã chọn 50 chủng dung huyết trên để thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình chọn lọc E. coli Bảng 5: Đặc tính dung huyết của các chủng E. coli phân lập được STT Địa phương lấy mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu dung huyết Tổng số mẫu dung huyết Tỷ lệ dung huyết (%) Dạng a Dạng b 1 Đồng Nai 30 6 8 14 47 2 Bình Định 25 4 5 9 36 3 Nghệ An 28 5 4 9 32 4 Hưng Yên 27 4 6 10 37 5 Hà Tây 25 3 5 8 32 Tổng 135 22 28 50 37 Hình 1: Hình ảnh dung huyết của E. coli 3.1.3.3. Kiểm tra đặc tính di động Sau khi xác định khả năng dung huyết của các chủng, chúng tôi cấy 50 chủng này vào môi trường thạch bán lỏng trong ống nghiệm chữ U (cấy ở một đầu ống nghiệm) nuôi ở điều kiện 37oC, cứ sau 6 tiếng đọc kết quả 1 lần. Kết quả được đánh giá dựa vào khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường (có thể thấy rõ bằng mắt thường). Mẫu dương tính là mẫu mà vi khuẩn có khả năng phát triển ra môi trường xung quanh và phát triển sang nhánh bên của ống nghiệm chữ U. Còn mẫu âm tính là mẫu mà vi khuẩn không có khả năng phát triển ra môi trường xung quanh, chúng chỉ có thể phát triển tại vị trí cấy giống, sau đây là kết quả cụ thể. Bảng 6: Khả năng di động của các chủng E. coli phân lập được STT Địa điểm lấy mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu di động Số mẫu không di động 1 Đồng Nai 14 9 5 2 Bình Định 9 5 4 3 Nghệ An 9 6 3 4 Hưng Yên 10 7 3 5 Hà Tây 8 5 3 Tổng 50 32 18 Hình 2: Tính di động của E. coli Sau khi tiến hành xác định khả năng di động