Luận văn Nghiên cứu cố định Enzyme α-Amylase

tiếp xúc với chất xúc tác. Đối với phương pháp hấp phụ, quá trình cố định vừa đơn giản lại có tính kinh tế. Smiley và các cộng sự đã cố địn enzyme lên dẫn xuất DEAE-cellulose bằng phương pháp hấp phụ vật lý, hấp phụ một phần ion. DEAE-cellulose là một chất mang rắn chắc và enzyme bị hấp phụ chủ yếu bởi lực tĩnh điện, vì thế liên kết không chặt và khó để ứng dụng thực tế. Chính vì thế một số tác giả người Trung Quốc đã đề nghị DEAE-Saphadex là chất mang phù hợp nhất để hấp phụ glucoamylase. Gần đây, Caldwell và các cộng sự đã cố định glucoamylase bằng cách hấp phụ lên hexyl-Sepharose; hoạt tính còn lại sau khi cố định cao. Sự ổn định nhiệt của enzyme cố định thấp hơn của enzyme hòa tan, nhưng có một sự lưu ý là sự ổn định nhiệt tăng trong sự có mặt của cơ chất. Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase Phương pháp cố định Chất mang Hoạt tính còn lại Tác giả Liên kết hóa trị Cellulose, nylon hoặc thủy tinh 16 – 25% Baker và các cộng sự Nhốt Polyacrylamide 22% Gruesback và Rase Polyacrylamide 98% Beck và Rase N-polyvinylpyrolidone 45% Waton và các cộng sự Hấp phụ DEAE-cellulose 16 – 55% Smiley và các cộng sự DEAE-Saphadex 35 – 45% Nhóm người Trung Quốc Hexyl-Sepharose 68% Caldwell và các cộng sự Ngoài ra cũng có nhiều phương pháp khác để cố định glucoamylase được thực hiện, nhưng những phương pháp này vẫn chưa cho kết quả tin cậy. Mặc dù có một số nghiên cứu cố định glucoamylase có ý tưởng tốt, nhưng vẫn còn nhiều điều cần phải nghiên cứu thêm về quá trình thực hiện, các yếu tố mô tả sự ổn định của enzyme và sử dụng enzyme cố định. Dưới những điều kiện của quá trình thực tế rất khó khăn để thu được dextrose như glucoamylase hòa tan. Khi nồng độ enzyme cao, có sự tác động lẫn nhau của phản ứng thủy phân và transferase tạo thành isomlatose trong hệ thống cố định, điều này rất quan trọng và khá khác với kết quả của quá trình gián đoạn sử dụng glucoamylase hòa tan, ở đó nồng độ enzyme tương đối thấp trong suốt chu kỳ phản ứng. Nghiên cứu trong tương lai về những khía cạnh cơ bản của cơ chất phản ứng xúc tác bởi enzyme glucoamylase cố định có lẽ tạo ra những khái niệm mới, những khái niệm này cuối cùng sẽ cung cấp thông tin cơ bản cần cho công nghiệp sản xuất tinh thể dextrose. Pullulanase cố định Pullulanase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp. Ví dụ, trong công nghiệp tinh bột bao gồm sản xuất amylose khối lượng phân tử thấp và maltose tinh khiết cao, sử dụng pullulanase như những chất hỗ trợ hiệu quả trong quá trình ổn định dung dịch tinh bột độ nhớt thấp cũng như sản xuất maltotriose hiệu suất cao từ pullulan. Pullulanase cũng xuất hiện như là một carbohydrase sử dụng trong rượu bia từ ngũ cốc không phải malt. Quan tâm về tiềm năng của enzyme này và những ích lợi của enzyme cố định, Martensson and Mosbach liên kết hóa trị pullulanase vào bên trong polymer đồng trùng hợp của acrylamide và acrylic acid bằng cách sử dụng carbodiimide tan trong nước. Hiệu suất cố định đạt được 34%. Quá trình cố định trong sự có mặt của pullulan làm tăng gấp 5 lần hoạt tính khi cơ chất không có mặt. Tuy nhiên, điều này không làm tăng sự ổn định của enzyme. Pullulanase cố định được dùng trong cột để tách nhánh amylopectin tạo ra amylose có khối lượng phân tử thấp. Sử dụng pullulanase không tan ở quy mô lớn sẽ yêu cầu những nghiên cứu trong tương lai nhắm vào sự ổn định của enzyme pullulanase dạng cố định. Một ứng dụng của pullulanase cố định trong công nghiệp tinh bột là tách nhánh amylopectin thành amylose có khối lượng phân tử thấp, rồi sau đó có thể sử dụng β-amylase cố định để thủy phân thành maltose. Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase. Từ khi β-amylase và pullulanse được cố định vào chất mang acrylic (Bio-Gel GM 100) bằng liên kết hóa trị, chất mang được hoạt hóa bởi carbodiimide, điều này đã tạo điều kiện để thiết kế ra quá trình cố định hai enzyme vào cùng một bề mặt chất mang. Hệ thống hai enzyme cố định, trong đó các enzyme phối hợp thực hiện, sản phẩm của enzyme đầu tiên là cơ chất cho enzyme thứ hai, vì thế thuận tiện cho hoạt động của enzyme sau. Hơn thế nữa, sự gắn kết các enzyme vào cùng một bề mặt chất mang được ưu tiên, hơn là sử dụng hỗn hợp của hai quá trình cố định riêng lẽ, β-amylase cố định có sự ổn định cao hơn ở vị trí nồng độ protein cao. Quá trình cố định được thực hiện thành công trong hai bước bởi vì điều kiện cố định tối ưu khác nhau của hai enzyme. Hiệu suất cố định của protein β-amylase và protein pullulanase là 40% và 38%. Hoạt tính còn lại lần lượt của β-amylase và pullulanase là 22% và 32%. Điều kiện hoạt động tối ưu của hệ enzyme này là: pH 6, 45oC. Hệ thống vẫn hoạt động ổn định sau 50 giờ, ngược lại đối với enzyme tự do sau 20 giờ bị mất toàn bộ hoạt tính. Trong công nghiệp tinh bột, sử dụng hai enzyme này có khả năng biến đổi hoàn toàn tinh bột, tạo thành sản phẩm giàu maltose. CHITOSAN [5, 18, 25] Giới thiệu về chitosan Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử ᴅ-β(1,4) glucosamine. Chitosan là thành phần quan trọng trong vỏ của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn trùng và thành tế bào của nấm, nó có tác động tạo khung vững chắc và ổn định. Chitosan là dẫn xuất quan trọng của chitin, được thu bằng cách khử acetyl của chitin khi xử lý với dung dịch KOH hay NaOH đậm đặc, và vì vậy chitosan là một polymer đồng trùng hợp của N-acetyl-ᴅ-glucosamine và ᴅ-glucosamine, chứa một lượng tối đa 30% các nhóm acetyl. Công thức hóa học của chitosan (C6H11NO4)n với n trong khoảng 700 – 4500: Có 2 chỉ số quan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình. Độ deacetyl hóa là độ chuyển hóa chitin thành chitosan. Thông thường các chitosan có độ deacetyl hóa 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa khoảng 45 – 55% tan tốt trong nước nên gọi là chitin tan. Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê, nó được xác định thông qua độ nhớt dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ 10.000 – 500.000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau. Hai chỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan. Tính chất của chitosan: Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm Candida albicans. Chitosan có khả năng hấp phụ lớn. Chitosan không tan trong nước, nhưng nhờ sự có mặt của những nhóm amino làm cho nó có thể tan trong dung dịch acid loãng có pH thấp khoảng 6,5. Chứa các nhóm amino và hydroxyl hoạt động. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU Enzyme α-amylase Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme α-amylase của hãng Novo (termamyl 120L), dạng lỏng. Enzyme này là một α-amylase bền nhiệt, sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis. Enzyme α-amylase là một endo–amylase, thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong phân tử amylose, amylopectin tạo các dextrin có phân tử lượng thấp hơn, maltose và glucose. Tính chất: pHopt = 6 – 6,5. Topt = 90oC. Chitosan Nguồn gốc: Đại học thủy sản Nha Trang. Thông số hóa lý: Độ ẩm: 15,92%. Độ tro: 2,0675%. Chỉ số deacetyl hóa (chỉ số DD): 75%. Phân tử lượng trung bình: 5,187x104 đvC. HÓA CHẤT SỬ DỤNG NaOH, Na2CO3, CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6, thuốc thử Folin, Albumin, thuốc thử DNS, NaH2PO4, Na2HPO4.12H2O. Glutaraldehyde do Merck sản xuất có nồng độ ban đầu là 25%. DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic. Máy khuấy từ Magnetic Stirrer HANNA, BIBBY. Máy đo pH Mettler Toledo. Bể điều nhiệt Gallenkamp No.WF250. Cân 4 số lẻ OHAUS PA214, tủ sấy, tủ lạnh…. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ đồ nghiên cứu pHopt Topt Vmax, Km Hiệu quả tái sử dụng Thể tích enzyme Thời gian cố định enzyme Vận tốc lắc Kích thước chitosan Nồng độ glutaraldehyde TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CỐ ĐỊNH NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ENZYME CỐ ĐỊNH TỐI ƯU HAI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG NHIỀU NHẤT KHẢO SÁT NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH α-AMYLASE Phương pháp cố định enzyme Để tìm ra phương pháp cố định α-amylase thích hợp, chúng tôi đã tiến hành so sánh hai phương pháp cố định α-amylase sau: Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị. Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và kết hợp giữa các enzyme. α-amylase Glutaraldehyde Chitosan Hoạt hóa Ngâm Nước Rửa Cố định Rửa Chitosan đã cố định α-amylase Phương pháp 1: Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị Thuyết minh sơ đồ: Trong tất cả các thí nghiệm, khối lượng chitosan được lấy cố định là 1g. Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme. Hoạt hóa: Quá trình hoạt hóa nhằm tạo điều kiện để nhóm CHO của glutaraldehyde liên kết với nhóm NH2 của chitosan. Cho vào erlen chứa 1g chitosan 10ml glutaraldehyde 2%. Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Sau khi glutaraldehyde đã liên kết với chitosan, chúng tôi tiến hành rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết với chitosan. Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase liên kết với chitosan qua trung gian của cầu nối glutaraldehyde, ngoài ra vẫn xảy ra quá trình chitosan hấp phụ α-amylase. Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml rồi cho vào erlen chứa chitosan đã được rửa sạch. Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: sau khi đã gắn kết α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml. Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa. Từ đó sẽ xác định được hiệu suất cố định enzyme. Tiếp sau đó xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của α-amylase cố định. Phương pháp 2: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và tạo liên kết giữa các enzyme Chitosan α-amylase Cố định Ngâm Nước Glutaraldehyde Rửa Liên kết enzyme Rửa Chitosan đã cố định α-amylase Thuyết minh sơ đồ: Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme. Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase được hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan. Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml bằng nước cất. Cho dung dịch enzyme vào erlen chứa chitosan đã trương nở, lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Sau khi đã gắn α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml. Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa. Liên kết enzyme: Quá trình này nhằm tạo điều kiện để nhóm CHO của glutaraldehyde liên kết với nhóm NH2 của α-amylase. Cho vào chitosan đã hấp phụ α-amylase 10ml glutaraldehyde 2%, lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết. Xác định hiệu suất cố định α-amylase. Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của α-amylase cố định. Các thông số được chọn để so sánh: Hiệu suất cố định enzyme. Hoạt tính còn lại của enzyme cố định. Sau khi đã chọn được phương pháp cố định, chúng tôi tiến hành xác định: Khảo sát các yếu tố ảnh hướng quá trình cố định. Tối ưu hóa hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Xác định pHopt, Topt. Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme: Vmax và Km. Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme Quá trình cố định được thực hiện ở nhiệt độ 30oC, trong erlen 250ml. Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần để kiểm tra sự khác nhau có nghĩa theo phương pháp ANOVA. Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định gồm có: thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc, kích thước chitosan và nồng độ glutaraldehyde. Khối lượng chitosan được cố định là 1g. Để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố, ban đầu chúng tôi cho 5 yếu tố các giá trị sau: Thể tích enzyme: 0,5ml. Thời gian cố định: 2 giờ. Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút. Kích thước chitosan: 2,8mm. Nồng độ glutaraldehyde 2% Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, còn những yếu tố còn lại sẽ được cố định. Sau đó, khi khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tiếp theo, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, đồng thời lấy giá trị tối ưu của yếu tố vừa khảo sát và giữ cố định những yếu tố còn lại. Khảo sát thể tích enzyme sử dụng Thể tích enzyme thay đổi như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml. Giá trị các yếu tố khác được giữ cố định. Khảo sát thời gian cố định enzyme Lần lượt thay đổi thời gian cố định: 1, 2, 3, 4, 5 giờ. Thể tích enzyme lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định. Khảo sát vận tốc lắc đảo Lần lượt thay đổi vận tốc lắc đảo: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút. Thể tích enzyme và thời gian lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định. Khảo sát kích thước của chitosan Lần lượt thay đổi kích thước chitosan như sau: 0,35; 0,7; 1,4; 2,8 mm. Giá trị các yếu tố khác giữ cố định. Giữ cố định yếu tố về glutaraldehyde. Các yếu tố còn lại là những giá trị tối ưu của các thí nghiệm trước. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde Nồng độ glutaraldehyde thay đổi như sau: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước. Tối ưu hóa quá trình cố định Sau khi có kết quả về sự ảnh hưởng của 5 yếu tố công nghệ đến quá trình cố định, chúng tôi chọn ra 2 yếu tố tác động mạnh nhất đến hiệu suất cố định và tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2, có cấu trúc tâm. Phương trình hồi quy được xây dựng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 có tâm. Vì chúng tôi tối ưu 2 yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu nên số thí nghiệm được tính như sau: N = 2k + 2k + no Trong đó: k: là số yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu. 2k = 4: số thí nghiệm ở nhân phương án. 2k = 4: số thí nghiệm tại giao điểm của đường tròn với các trục. no = 1: số thí nghiệm ở tâm phương án cần phải có (tối thiểu bằng 1), Vì vậy tổng số thí nghiệm là: N = 2k + 2k + no = 22 + 2.2 + 1 = 9 Để kiểm tra sự khác không có nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy, chúng tôi thực hiện thêm 2 thí nghiệm tại tâm. Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố Số thí nghiệm Xo X1 X2 X1X2 X12 - λ X22 - λ Y Số thí nghiệm ở nhân: 2k 1 +1 -1 -1 +1 1- λ 1- λ 2 +1 +1 -1 -1 1- λ 1- λ 3 +1 -1 +1 -1 1- λ 1- λ 4 +1 +1 +1 +1 1- λ 1- λ Số thí nghiệm ở các điểm giao với trục 2k 5 +1 -α 0 0 α 2-λ -λ 6 +1 +α 0 0 α 2-λ -λ 7 +1 0 -α 0 -λ α 2-λ 8 +1 0 +α 0 -λ α 2-λ Số thí nghiệm ở tâm 9 +1 0 0 0 -λ -λ Số thí nghiệm ở tâm làm thêm 10 +1 0 0 0 -λ -λ 11 +1 0 0 0 -λ -λ Với: α: cánh tay đòn được chọn phụ thuộc vào số yếu tố k và số thí nghiệm ở tâm no Xo: là biến ảo ứng với hệ số bo. X1: là biến mã hóa của Z1 (Z1 là yếu tố ảnh hưởng thứ nhất). X2: là biến mã hóa của Z2 (Z2 là yếu ảnh hưởng thứ hai). Y: hàm mục tiêu, hiệu suất cố định protein enzyme (%). (-1): mức dưới (0): tâm (+1): mức trên Phương trình hồi quy có dạng: Y = bo + b1X1 + b2X2+ b12X1X2+ b11X12+ b22X22 Ngoài ra, còn có thể sử dùng phần mềm Modde 5 để thiết kế thí nghiệm, từ đó xác định phương trình hồi quy và giá trị cực đại. Xác định tính chất enzyme cố định: Xác định pH tối ưu: Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme tan và enzyme cố định ở nhiệt độ 50oC, ứng với pH có giá trị thay đổi như sau: 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Dung dịch tinh bột có pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm phosphate. Từ đó xác định pH tối ưu. Xác định nhiệt độ tối ưu: Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng cách đo hoạt tính α-amylase ở những nhiệt độ khác nhau tại giá trị pH tối ưu. Những nhiệt độ khảo sát: 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90. Những giá trị nhiệt độ này được điều khiển bằng bể điều nhiệt. Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme Tinh bột được chuẩn bị với nồng độ từ 5 – 25%. Quá trình thủy phân xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu. Từ đây chúng tôi sẽ xác định nồng độ tinh bột mà phản ứng thủy phân vẫn tuân phương trình Michaelis – Menten. Sau đó chúng tôi sẽ tiến hành thí nghiệm ứng với những nồng độ tinh bột mà phản ứng thủy phân tuân theo phương trình Michaelis – Menten để xác định Km và Vmax của α-amylase cố định và α-amylase tự do. Phương trình động học Michaelis – Menten có dạng: Trong đó: Km được gọi là hằng số Michaelis. V: là vận tốc phản ứng. Vmax: là vận tốc cực đại. [S]: là nồng độ cơ chất. Vì để biểu diễn theo phương trình này cần tiến hành nhiều thí nghiệm để đạt sự chính xác, nên Lineaweaver và Burk đã cải tiến phương trình này như sau: Phương trình có dạng đường thẳng, cắt trục hoành tại điểm và cắt trục tung tại điểm . Xác định hiệu suất cố định enzyme Hiệu suất cố định protein enzyme Hiệu suất của quá trình cố định được tính theo công thức sau: Với: P: là hàm lượng protein enzyme có trong thể tích enzyme ban đầu (mg) P1: là hàm lượng protein enzyme không liên kết (mg). Phương pháp xác định protein tan Để xác định nồng độ protein ta sử dụng phương pháp Lowry. Phương pháp này dựa vào phản ứng Biuret, trong đó các liên kết peptide của protein phản ứng với Cu trong môi trường kiềm để tạo ra Cu+, ion Cu+ tạo ra sẽ phản ứng với thuốc thử Folin tạo ra dung dịch màu xanh tím, cường độ màu phụ thuộc vào thành phần tyrosin và tryptophan trong protein. Trước tiên để xác định nồng độ protein tan trong mẫu thí nghiệm, ta sẽ phải xây dựng đường chuẩn bằng một loại protein tinh khiết thường là albumin. Từ đường chuẩn, khi có giá trị mất độ quang sẽ xác định được nồng độ protein tan. Giá trị mật độ quang được đo bằng máy quang phổ hấp thu UV – Vis tại bước sóng λ = 750nm. Phương pháp này được sử dụng chính xác nhất với những dung dịch có nồng độ protein từ 0,01 đến 1mg/ml. Xây dựng đường chuẩn: Hóa chất: Pha dung dịch albumin chuẩn có nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mg/ml. Dung dịch A: Cân 4g NaOH và 20g Na2CO3 pha trong 1000ml nước cất. Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha trong dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%. Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 50 : 1. Thuốc thử Folin pha loãng bằng nước cất tỉ lệ: 1:3. Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu và 5ml dung dịch C, để yên trong 10 phút. Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút. Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750nm. Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A). C (mg/ml) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 A Hình 2.1: Đường chuẩn albumin Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của enzyme α-amylase tự do và cố định Hoạt tính riêng của enzyme α-amylase Hoạt tính riêng của enzyme được xác định theo phương pháp dùng phản ứng với DNS, để định lượng đường khử tạo từ quá trình thủy phân tinh bột dưới hoạt động của enzyme. Từ đó xác định hoạt tính enzyme. Trong thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme, chúng tôi dùng tinh bột có nồng độ 1%. Cân 1g tinh bột cho vào 10ml nước cất và xử lý nhiệt ở 100oC cho đến khi tinh bột được hòa tan. Sau đó định mức dung dịch trên thành 100ml bằng dung dịch đệm phosphate pH 6. Cách tiến hành xác định hoạt tính enzyme hòa tan: Pha loãng enzyme. Cho vào erlen: 25ml hồ tinh bột 1% ở pH 6 ủ ở 50oC. Sau khi mẫu đạt 50oC cho vào 1ml enzyme đã pha loãng, ủ 10 phút. Sau khi thủy phân, rút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Cách tiến hành xác định hoạt tính enzyme cố định: Cho vào erlen: 1g chế phẩm α-amylase cố định ủ ở 50oC. Sau đó cho vào 25ml hồ tinh bột 1% ở pH 6 ủ 10 phút. Sau khi thủy phân, lọc để thu dung dịch đường, định mức lên 100ml. Rút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Xây dựng đường chuẩn: Hóa chất: Pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1mg/ml. Thuốc thử DNS. Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu và 2ml thuốc thử DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A). C (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A Hình 2.2: Đường chuẩn glucose Công thức tính hoạt tính riêng của α-amylase: Với: Ur: là hoạt tính riêng của α-amylase (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase) m1: hàm lượng đường khử trong mẫu sau khi thủy phân (mg). m2: hàm lượng protein α-amylase đã dùng để thủy phân (mg). Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định: Với: Urcđ là hoạt tính riêng của α-amylase cố định (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase cố định ). Urht là hoạt tính riêng của α-amylase hòa tan (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase hòa tan). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CHẾ PHẨM ENZYME α-AMYLASE TỰ DO Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính riêng (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase tự do) 50,09 20,86 CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau: % Hoạt tính còn lại (%) Hiệu suất cố định (%) Hình 3.1: So sánh hiệu quả các phương pháp cố định Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy hiệu suất cố định của phương pháp 2 cao hơn phương pháp 1 nhưng không nhiều, tuy nhiên hoạt tính enzyme cố định trong phương pháp 1 lại cao hơn phương pháp 2. Đối với phương pháp 1, ban đầu nhóm NH2 của chitosan sẽ được chuyển đổi thành nhóm CHO bằng cách hoạt hóa chitosan bằng glutaraldehyde, sau đó khi cho enzyme vào, thì nhóm NH2 trong phân tử α-amylase sẽ liên kết với nhóm CHO đồng thời phân tử enzyme cũng bị hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan. Hấp phụ Phản ứng cộng hóa trị Hình 3.2: Cố định enzyme bằng phương pháp liên kết hóa trị Ngược lại, trong phương pháp 2, ban đầu chất mang chitosan chỉ tương tác hấp phụ enzyme vào cấu trúc lỗ xốp, sau đó khi cho glutaraldehyde vào, thì nhóm CHO hoạt động của glutaraldehyde sẽ liên kết với nhóm NH2 của enzyme và của chitosan. Dẫn đến kết quả là giữa các enzyme sẽ liên kết với nhau, đồng thời liên kết với chitosan. Liên kết giữa các enzyme Hấp phụ Hình 3.3: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme Từ kết quả của quá trình cố định, chúng tôi nhận thấy rằng ở phương pháp 2, các enzyme liên kết chặt chẽ với chất mang hơn. Điều này rất có lợi trong quá trình rửa cũng như trong khi chế phẩm α-amylase cố định hoạt động sẽ hạn chế enzyme thất thoát ra khỏi hệ thống cố định. Đồng thời enzyme sẽ ổn định hơn trong suốt quá trình hoạt động. Nhưng vấn đề ở đây, do liên kết ở phương pháp 2 nhiều hơn so với phương pháp 1, điều này có thể dẫn đến sự thay đổi cấu hình không gian của enzyme, làm biến đổi trung tâm hoạt động của α-amylase. Điều này làm cho chế phẩm α-amylase cố định ở phương pháp 2 có hoạt định thấp hơn nhiều so với phương pháp 1. Vì lý do này, chúng tôi quyết định chọn phương pháp 1 – Cố định α-amylase bằng phương pháp cộng hóa trị. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH Trong phần này, chúng tôi sử dụng phương pháp thực nghiệm cổ điển để khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố công nghệ đến hiệu suất cố định. Quá trình được thực hiện theo mục 2.4.3. Từ đó chúng tôi sẽ thu được những giá trị phù hợp của từng yếu tố công nghệ. Khảo sát thể tích enzyme sử dụng Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase : Thể tích enzyme thay đổi: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5ml. Thời gian cố định: 2 giờ. Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút Kích thước chitosan: 2,8mm. Nồng độ glutaraldehyde: 2% Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau: Hiệu suất cố định (%) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Thể tích enzyme sử dụng (ml) Hình 3.4: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định Lượng enzyme gắn vào chitosan (mg) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Thể tích enzyme sử dụng (ml) Hình 3.5: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên lượng enzyme gắn vào chitosan Bảng 3.2: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thể tích enzyme sử dụng khác nhau Enzyme sử dụng (ml) Hoạt tính riêng (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase cố định) 0,1 10,05ab ± 0,1 0,2 10,19ac ± 0,15 0,3 9,97b ± 0,13 0,4 10,18ac ± 0,05 0,5 10,25c ± 0,09 Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có