Luận văn Nghiên cứu công nghệ chế tạo các hạt vô cơ, hữu cơ được bọc bởi những polymer tương thích sinh học dung trong y học

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng 4

1.1.1. Vật liệu nano 4

1.1.2. Hạt nano từ 5

1.1.3. Ứng dụng của hạt nano từ trong lĩnh vực sinh y học 6

1.1.3.1. Tách, phân lập các tế bào và thực thể sinh học ra khỏi một môi trường hỗn hợp 7

1.1.3.2. Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích 8

1.1.3.3. Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng hưởng từ. 13

1.1.3.4. Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư 13

1.2. Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 20

1.2.1. Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân 20

1.2.2. Nguyên lý và kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 21

1.2.3. Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 25

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1. Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1. Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss 26

2.1.2. Một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành 26

2.1.2.1. Các dòng tế bào ung thư 26

2.1.2.2. Tế bào lành Fibroblast 27

 

doc83 trang | Chia sẻ: mimhthuy20 | Ngày: 22/09/2020 | Lượt xem: 241 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu công nghệ chế tạo các hạt vô cơ, hữu cơ được bọc bởi những polymer tương thích sinh học dung trong y học, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ược tác dụng điều trị bằng nhiệt độ đối với các tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu áp dụng với bệnh nhân Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan nhưng việc tiến đến áp dụng thử nghiệm trên cơ thể người vẫn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu do kích thước các thiết bị thường tương đối nhỏ và chỉ phù hợp với cơ thể động vật. Vào giữa những năm 1990, nhóm nghiên cứu của Jordan đã đẩy mạnh phát triển phương thức nhiệt-từ trị để bước đầu thử nghiệm trên cơ thể người [21, 22]. Mục tiêu của nghiên cứu là cố gắng đạt được lượng hạt từ có nồng độ đủ cao ở vùng khối u, và sau đó điều khiển chính xác nhiệt độ đốt bằng việc tính toán chính xác công suất toả nhiệt và phân bố hạt từ trong khối u. Trước tiên, các phân bố của các hạt từ phải được quan sát bằng các thiết bị như siêu âm, chụp xạ hoặc MRI sau khi tiêm vào trong cơ thể. Sau đó, sử dụng phân bố không gian và công suất toả nhiệt (SLP) của các hạt từ để tính chính xác khoảng tăng nhiệt độ trong vùng khối u. Nhiệt độ được đo với việc sử dụng các đầu dò quang học được đưa vào cơ thể. Quá trình đốt nóng có thể được điều khiển bởi các thông số như cường độ từ trường và thời gian chiếu. Tuy nhiên ngay cả với khối u có dạng hình cầu, đạt được sự phân bố đồng nhất các hạt từ cũng là rất khó khăn. Cho đến nay nhóm nghiên cứu của Jordan đã chế tạo một thiết bị tạo từ trường xoay chiều MFH – 300 F với tần số 100 kHz và cường độ 18 kA/m (hình 6) và bắt đầu thử nghiệm chữa trị một số loại ung thư trên cơ thể người [9, 10, 17-20]. Hình 6. Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng trong nhiệt – từ trị [21] Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 1.2.1. Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân Chụp cộng hưởng từ hay MRI (Magnetic Resonance Imaging) là một kỹ thuật chẩn đoán y khoa tạo ra hình ảnh giải phẫu của cơ thể nhờ sử dụng từ trường và sóng radio. Phương pháp này không sử dụng tia X nên có độ an toàn cao cho bệnh nhân. Máy chụp cộng hưởng từ là một thiết bị nhạy cảm và đa năng giúp ta thấy hình ảnh các lớp cắt của các bộ phận cơ thể từ nhiều góc độ trong một khoảng thời gian ngắn.  Chụp cộng hưởng từ là một phương pháp chẩn đoán hình ảnh hiện đại, hiệu quả và phổ biến trên thế giới. Ngày nay, MRI được sử dụng để kiểm tra gần như mọi cơ quan trong cơ thể. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị trong việc chụp ảnh chi tiết não hoặc dây cột sống. Kể từ khi MRI mang lại những hình ảnh 3 chiều, bác sĩ có thể nắm được thông tin về địa điểm thương tổn. Những thông tin như vậy rất có giá trị trước khi phẫu thuật chẳng hạn như tiểu phẫu não.  Nguyên lý cộng hưởng từ hạt nhân được Felix Block và Edward Puroel phát hiện vào năm 1946, cộng hưởng từ được ứng dụng rộng rãi từ năm 1950. Năm 1952, hai nhà vật lý Felix Block và Edward Puroell được trao giải Nobel Vật lý nhờ sự phát hiện và ứng dụng cộng hưởng từ. Năm 1980, chiếc máy cộng hưởng từ đầu tiên trên thế giới được đưa vào hoạt động để tạo ảnh cơ thể người. Năm 1987, MRI được ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý tim mạch bằng kỹ thuật cardiac MRI. Năm 1993, ứng dụng MRI để chẩn đoán các bệnh lý não, thần kinh. Ngày nay, kỹ thuật tạo ảnh cộng hưởng từ (MRI) đã trở thành phổ biến trong y học chẩn đoán hình ảnh trên thế giới cũng như tại các bệnh viện lớn của Việt Nam. Hình 7. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư 1.2.2. Nguyên lý và kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) Từ tính của hạt nhân nguyên tử Như chúng ta đã biết các hạt cơ bản của nguyên tử đều mang điện tích như proton mang điện dương, electron mang điện âm và với đặc tính tự quay quanh trục (tính chất spin) thì chúng đều sinh ra một từ trường. Hạt nhân của nguyên tử hydro chỉ chứa duy nhất một một proton (không có neutron) nên nó còn được gọi đơn giản là proton. Hydro chiếm một lượng lớn trong thành phần của nước và mỡ, những chất có mặt ở hầu hết các mô của cơ thể, vì thế nó đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tạo hình ảnh cộng hưởng từ. Khi không có tác dụng của từ trường ngoài, các proton quay quanh trục của nó với hướng các trục quay hoàn toàn ngẫu nhiên. Khi đó, từ trường của chúng sẽ triệt tiêu nhau làm từ trường tổng số bằng zero. Khi có tác động của từ trường ngoài, ký hiệu là B0, các proton sẽ chịu tác động của từ trường ngoài và định hướng lại trục quay của mình theo hướng từ trường ngoài B0, một số có trục quay cùng chiều với chiều của B0, một số lại có trục quay ngược chiều với B0. Thực tế đo đạc cho thấy, với một triệu proton trong cơ thể, số lượng proton cùng chiều với B0 chỉ nhiều hơn một hoặc hai so với các proton ngược chiều. Sự khác biệt rất nhỏ này được gọi là độ từ hóa thực M0, từ trường cơ sở để tạo ra tín hiệu cộng hưởng từ. Độ từ hóa thực tăng lên khi cường độ từ trường B0 tăng, có nghĩa là tín hiệu cộng hưởng từ tỉ lệ thuận với độ lớn của B0[1, 3, 12]. Tần số cộng hưởng Tốc độ quay của các proton đều giống nhau và phụ thuộc vào từ trường ngoài. Mối liên hệ giữa tấc độ quay của proton và cường độ từ trường được diễn tả bằng phương trình Larmor : f = γB f là tần số cộng hưởng B là cường độ từ trường γ là hằng số Larmor (42,58MHZ/T)[3, 12] Hiện tượng cộng hưởng từ Để mô tả hiện tượng cộng hưởng từ, chúng ta xây dựng một hệ trục tọa độ vuông góc với 3 trục xyz như trong hìnhTrục z là trục thẳng đứng theo chiều tác dụng của từ trường ngoài B0 và mặt phẳng xy vuông góc với trục z. Từ trường ngoài B0 gây ra một độ từ hóa thực M0 có vector hướng cùng chiều với B0, vì vậy độ từ hóa thực còn được gọi là độ từ hóa dọc. Các proton luc này đang quay với tần số γB0. Hình 8. Sự tạo thành vector từ hoá thực Lúc này, nếu phát một sóng radio (xung RF-xung kích thích) quay quanh trục z với tần số cộng hưởng γB0, tạo một từ trường B1 vuông góc vơi B0 với cùng tần số cộng hưởng γB0 của các proton. Như vậy với các proton, B1 là từ trương tĩnh. Dưới tác dụng của từ trường B1 trong một khoản thời gian nhất định, vector M0 thay đổi và lệch khỏi trục z một góc α (góc lật). Giá trị của α phụ thuộc vào độ lớn của B1 và thời gian phát xung. Khi α bằng 90o, độ từ hóa thực sẽ bị lật ngang vào mặt phẳng xy và lúc này độ từ hóa thực trở thành độ từ hóa ngang. Độ từ hóa ngang quay quoanh trục z làm xuất hiện một sóng radio có thể đo được, đó chính là tín hiệu cộng hưởng từ. Hình 9. Vector từ hoá ngang vuông góc với Oz Khi tắt xung kích thích RF, độ từ hóa ngang giảm dần rồi mất hẳn kéo theo tín hiệu cộng hưởng từ cũng giản dần rồi mất hẳn. Khoảng thời gian này gọi là T2. Trên thực tế, người ta coi T2 là khoảng thời gian tín hiệu mất khoảng 63% độ lớn so với ban đầu. Đồng thời với quá trình hồi dãn ngang, lúc này, khi đã tắt xung RF thì dưới tác dụng của từ trường duy nhất B0, các proton tương tác với từ trường dẫn đến khôi phục lại độ từ hóa dọc M0 ban đầu. Khoảng thời gian này gọ là T1. T1 được xem như khoảng thời gian cần thiết để độ từ hóa dọc khôi phục lại 63% độ lớn M0 ban đầu của nó [1, 3]. Các nguyên lí tương phản trong kĩ thuật chụp cộng hưởng từ Độ tương phản ảnh. Khi chụp ảnh cộng hưởng từ, sự khác biệt cấu trúc giữa các mô được xác định bằng sự khác biệt về cường độ tín hiệu giữa chúng. Thông thường, cường độ tín hiệu được biểu hiện trên hình bằng bằng mức độ đen trắng, cường độ càng cao thì cấu trúc càng trắng và ngược lại. Mức độ khác biệt đen trắng này được gọi là độ tương phản của hình. Để có được đủ dữ liệu cho một hình ảnh cộng hưởng từ, chúng ta cần phải phát xung kích thích nhiều lần, tương ứng với nhiều lần đo tín hiệu. Khoảng cách thời gian giữa hai lần phát xung kích thích được gọi là thời kích TR. Khoảng cách thời gian từ lúc phát xung kích thích đến lúc thực hiện đo tín hiệu được gọi là thời vang TE. Ngoài thời kích TR và thời vang TE, người ta có thể sử dụng một góc lật α nhỏ hơn 90o với mục đích chỉ làm lật một phần vector từ hóa dọc thành vector từ hóa ngang đủ tạo ra một lượng tín hiệu cần thiết, giảm bớt thời gian khôi phục hoàn toàn vector từ hóa dọc [3]. Nguyên lí chụp T1,T2. Trong kỹ thuật chụp cộng hưởng từ, nguyên lí chụp trọng T1 và nguyên lí chụp trọng T2 là các nguyên lí chụp cơ bản được sử dụng nhiều nhất. Trong nguyên lí chụp trọng T1 (còn gọi tắt là chụp T1), người ta dùng một thời kích TR ngắn để bộc lộ sự khác biệt cường độ tín hiệu của các mô có thời gian T1 khác nhau: mô có T1 ngắn hầu như đã khôi phục hoàn toàn độ từ hóa dọc, cho ra độ từ hóa ngang ở lần kích thích tiếp theo khá lớn, trong khi đó mô có T1 dài chỉ khôi phục được một phần độ từ hóa dọc nên độ từ hóa ngang tương ứng ở lần kích thích tiếp theo sẽ nhỏ. Khi đó, nếu đo tín hiệu tại một thời điểm khá ngắn sau khi phát xung kích thích (thời vang TE ngắn), tín hiệu của mô có T1 ngắn sẽ cao (màu trắng) còn tín hiệu của mô có T1 dài sẽ thấp (màu đen). Cụ thể là dịch (nước) sẽ có màu đen, mỡ màu trắng nhất và các mô mềm màu xám [3]. Trong nguyên lí chụp trọng T2 (còn gọi tắt là chụp T2), người ta tận dụng sự khác biệt thời gian T2 giữa các mô, nghĩa là tốc độ suy giảm tín hiệu: mô có T2 càng ngắn, tấc độ suy giảm càng nhanh. Trước tiên người ta dùng thời kích TR đủ dài để độ từ hóa dọc của các mô đều khôi phục hoàn toàn, cho ra độ từ hóa ngang tốt nhất có thể khi có xung kích thích. Sau khi phát xung kích thích, ta đo tín hiệu tại một thời điểm khá dài sau đó (thời vang TE dài). Lúc này các mô có thời gian T2 ngắn hầu như đã mất hết tín hiệu, các mô có thời gian T2 dài chỉ mất một phần tín hiệu cho ra hình trọng T2, trong đó mô có T2 dài sẽ có tín hiệu cao (màu trắng) còn mô có T2 ngắn sẽ có tín hiệu thấp (màu đen). Cụ thể là nước sẽ có màu trắng nhất, các mô mềm có màu xám, các mô có tín hiệu suy giảm cực nhanh (T2 cực ngắn) như vỏ xương thì rất đen[3]. 1.2.3. Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) - Ảnh của cấu trúc các mô mềm trong cơ thể như tim, phổi, gan và các cơ quan khác rõ hơn và chi tiết hơn so với ảnh được tạo bằng các phương pháp khác. - MRI giúp cho các bác sĩ đánh giá được các chức năng hoạt động cũng như cấu trúc của nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể. - Sự chi tiết làm cho MRI trở thành công cụ vô giá trong chẩn đoán thời kì đầu và trong việc đánh giá các khối u trong cơ thể. - Tạo ảnh bằng MRI không gây tác dụng phụ như trong tạo ảnh bằng chụp X quang thường quy và chụp CT. - MRI cho phép dò ra các điểm bất thường ẩn sau các lớp xương mà các phương pháp tạo ảnh khác khó có thể nhận ra. - MRI có thể cung cấp nhanh và chuẩn xác so với tia X trong việc chẩn đoán các bệnh về tim mạch. - Không phát ra các bức xạ gây nguy hiểm cho con người[3]. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss Chuột nhắt trắng Swiss 8 tuần tuổi (trọng lượng 18 - 20g) dùng để gây u, được Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ổn định 25 – 27ºC, được cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ, đảm bảo khỏe mạnh khi bắt đầu thí nghiệm. Hình 10. Chuột nhắt trắng Swiss 2.1.2. Một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành 2.1.2.1. Các dòng tế bào ung thư Bảng 1. Một số dòng tế bào ung thư sử dụng trong luận văn và đặc điểm của chúng Dòng tế bào Sarcoma 180 H358 H460 MCF7 HepG2 Loại ung thư Ung thư mô liên kết Ung thư phổi Ung thư phổi Ung thư vú Ung thư gan Nguồn gốc Chuột S. Webster Người Người Người Người Hình thái Tế bào mô liên kết Tế bào biểu mô Tế bào biểu mô Tế bào biểu mô Tế bào biểu mô Cách thức phát triển Trôi nổi Bám dính đơn lớp Bám dính đơn lớp Bám dính đơn lớp Bám dính đơn lớp Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 + 5-10% FBS + 1% PeniSepto RPMI 1640 + 5-10% FBS + 1% PeniSepto DMEM + 5-10% FBS + 1% PeniSepto DMEM + 5-10% FBS + 1% PeniSepto DMEM + 5-10% FBS + 1% PeniSepto Môi trường bảo quản RPMI 1640 + 50% FBS +10% DMSO RPMI 1640 + 50% FBS +10% DMSO DMEM + 50% FBS + 10% DMSO DMEM +50% FBS + 10% DMSO DMEM +50% FBS + 10% DMSO Các dòng tế bào ung thư trên được cung cấp bởi nhóm Nghiên cứu Ung thư Thực nghiệm, bộ môn Tế bào – Mô – Phôi và Lý sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.2.2. Tế bào lành Fibroblast Tế bào lành được sử dụng để thử độc tính của dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng axit Oleic (H01) và dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene) (E6) là nguyên bào sợi (fibroblast) tách từ phôi thai chuột nhắt trắng (Mus muscullus) Nguyên bào sợi (Fibroblast) tách từ phôi của chuột được cung cấp bởi nhóm Nghiên cứu về Tế bào gốc, thuộc bộ môn Tế bào – Mô – Phôi và Lý sinh thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.3. Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ) 2 loại vật liệu nano từ được sử dụng là H01 và E6 H01 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng axit Oleic và gắn Curcumin. Hàm lượng sắt là 7.2 mg/ml, 10% Curcumin. E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene). Hàm lượng sắt là 10mg/ml. Hình 11. Ảnh SEM của mẫu E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt có kích thước khoảng 100nm H01 và E6 được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu vật liệu Nano Y sinh ở Viện Khoa học Vật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia. 2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 2.2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Gibco BRL (Mỹ) Môi trường nuôi cấy DMEM low/high Glucose của Gibco BRL (Mỹ) 2.2.2. Hóa chất FBS: Invitrogen, Mỹ PBS: Invitrogen, Mỹ Trypan Blue 0,4% của Merk Nước cất và nước khử ion đã được khử trùng Penicillin-Streptomycine 100 IU/ml của Invitrogen, Mỹ Trypsine: của Gibco BRL (Mỹ) Thuốc gây mê Thiopental Acid Sulfuric 98% và acid Perchloric 15% 2.2.3. Máy móc thiết bị Tủ hood của Esco, Mỹ Tủ ấm CO2 của Shell Lab, Mỹ Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40CFL của Carl Zeiss, Đức Kính hiển vi quang học của Carl Zeiss, Đức Pipette aid của Gilson Pipette man 1ml, 200µl, 100µl, 10µl của Gilson Máy li tâm Universal 320 Bình ổn nhiệt Gra Operation SS40-1, Đức Máy lọc khí IQAir Cleanroom, Thụy sỹ Nồi hấp ALP,Ltd, Nhật, Model CL-32L Tủ sấy Kottermann, Đức Máy ảnh Canon Máy votex WhirliMixer, Anh Tủ lạnh Hitachi, Nhật Bộ đồ mổ tiểu động vật Máy chụp ảnh cộng hưởng từ 1.5T (Philips) Máy phát từ trường xoay chiều RDO, Model HFI của Mỹ Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Shimazdu của Nhật 2.2.4. Vật tư tiêu hao Chai nuôi cấy T25, T75, đĩa Pettri các cỡ, đĩa 24 giếng của Corning (Mỹ). Ống ly tâm 1.5ml, 15ml, 50ml Đầu côn các loại, màng lọc vô khuẩn 0.22µm của Satorius Lam kính, lamen Que gạt tế bào 179693, Mỹ Bơm tiêm 1ml, 5ml, bơm tiêm Insulin 1ml Bình Kenđan, bình nón và bình định mức các loại 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180 Phương pháp tạo u rắn cho chuột nhắt trắng Swiss được tiến hành theo phương pháp thường quy của nhóm Nghiên cứu Ung thư Thực nghiệm: Trích báng chuột (đã giữ giống 10 - 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồi đem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS. Xác định mật độ tế bào và tỉ lệ chết (sau khi nhuộm với blue trypan) bằng buồng đếm Thoma dưới kính hiển vi quang học. Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106 tế bào/ml. 2.3.1.1. Tạo u rắn dưới da Tiêm 0.2ml huyền dịch vừa pha vào dưới da chuột (vị trí tiêm là phần ngực, lệch sang bên phải, trước khi tiêm tiến hành tẩy sạch lông chuột quanh vị trí tiêm) mỗi chuột (tương đương 1x106 tế bào ung thư/con). Sau khi cấy ghép tế bào ung thư, chuột được phân lô, đánh dấu, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u rắn đã tạo. 2.3.1.2. Tạo u đùi Tiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào bắp đùi mỗi chuột (tương đương 1x106 tế bào ung thư/con). Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u rắn đã tạo. Hằng ngày theo dõi sự phát triển của khối u bằng cách quan sát và đo kích thước, tính thể tích u. Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng của khối u bằng thước kẹp hoặc thước dây. Sau đó tính khối lượng của u bằng công thức: V(mg) = a x b2/2 Trong đó a là chiều dài của u (mm) b là chiều rộng của u (mm) 2.3.2. Phương pháp khảo sát độc tính của dung dịch nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi Để có thể xác định độc tính của H01 và E6 đối với các dòng tế bào, chúng tôi tiến hành ủ hạt từ với tế bào đang nuôi cấy trong 2 giờ với các nồng độ khác nhau, sau đó thu hoạch tế bào, nhuộm với Blue Trypan tỷ lệ 1:1 trong 5 phút, tế bào sống sẽ có màu sáng lấp lánh, tế bào chết sẽ có màu xanh của thuốc nhuộm. Đếm bằng buồng đếm Thoma, tính tỷ lệ tế bào sống. Qua đó xác định nồng độ độc ngưỡng của H01 và E6 đối với từng dòng tế bào. Nồng độ độc ngưỡng là nồng độ hạt từ khi ủ với tế bào đang nuôi cấy thì tỷ lệ sống của tế bào là trên 70%. Xác định số lượng tế bào và nạp vào các đĩa 24 giếng - Tiến hành tách rời các tế bào bằng Trypsin/EDTA. - Thu hoạch tế bào, xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma. - Nạp tế bào vào các giếng nuôi cấy của đĩa 24 giếng với mật độ 300.000 tế bào/1 giếng. - Ủ các đĩa trên trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ để tế bào ổn định. Chuẩn bị các mẫu thử để thử độc tính Mẫu chất lỏng từ H01 và E6 (được tính toán dựa trên hàm lượng Fe3O4 đã biết) được tra vào các giếng của đĩa đang nuôi cấy tế bào để ủ với các nồng độ hạt từ khác nhau (ng/1 tế bào hay ng/TB) H01 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 E6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Thời gian ủ các mẫu hạt từ với tế bào là 2 giờ Nhuộm, đếm và xác định tỷ lệ (%) tế bào sống - Sau khi ủ với hạt từ trong 2 giờ, tiến hành thu hoạch tế bào bằng cách dùng Trypsin/EDTA. - Lấy 50 µl dịch tế bào nhuộm với Blue trypan với tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Đếm tế bào để xác định tỷ lệ (%) tế bào sống. - Chụp hình tế bào bằng máy ảnh kĩ thuật số qua kính hiển vi (để minh họa). 2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) Để khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân, chúng tôi làm thí nghiệm trên chuột Swiss mang u đùi. Tiêm trực tiếp hạt từ H01 vào u đùi chuột, chụp ảnh MRI, quan sát và so sánh với hình ảnh chuột mang u nhưng không tiêm hạt từ. Từ đó kết luận là hạt từ H01 có khả năng gây tương phản ảnh hay không? Sau khi gây u đùi thành công trên chuột, chọn 2 chuột có kích thước đùi u tương đương nhau và 1 chuột bình thường: - Chuột A: Đối chứng sinh học - Chuột B: Đối chứng ung thư - Chuột C: Tiêm trực tiếp 200µl hạt từ H01 vào đùi u của chuột. Chuột C sau khi tiêm để trong thời gian là 10 phút để hạt từ có thể phân tán đều trong khối u. Sau đó cả 3 chuột được gây mê bằng Thiopental nồng độ 50 mg/1ml (mỗi con tiêm 150µl vào xoang bụng). Chuột A, B, C được chụp cộng hưởng từ hạt nhân trên máy MRI 1.5 Gyroscan Philips (Mỹ) tại bệnh viện Quân đội Trung ương 108. Sau khi chụp, phân tích hình ảnh và đưa ra nhận xét. Hình 12. Máy chụp cộng hưởng từ 1.5T (MRI 1.5 Gyroscan Philips) 2.3.4. Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch Để có thể tiến hành tiêm tĩnh mạch thuận lợi cần sử dụng dụng cụ cố định thân chuột vì bất kì cử động mạch nào của chuột cũng có thể làm trật đường kim. Thao tác tiêm như sau: - Sử dụng bông cồn 70% khử trùng đuôi chuột. - Làm giãn tĩnh mạch. - Dùng kim tiêm loại 1ml chọc vào tĩnh mạch theo góc thấp nhất có thể cho tới khi một nửa mũi kim nằm trong tĩnh mạch chuột thì đẩy từ từ dịch vào. - Nếu không thấy có lực cản thì tiếp tục đẩy hết lượng dịch cần thiết. Nếu thấy có lực cản thì dừng tiêm chỉnh lại mũi kim hoặc chọn một tĩnh mạch khác để tiêm. - Sau khi tiêm nếu đuôi chuột không bị trắng, và khi rút kim thấy máu trào ra theo mũi kim là đã tiêm thành công. Dùng bông cồn khử trùng rồi dùng bông khô bịt vào vết tiêm trên đuôi chuột cho đến khi chuột hết chảy máu. 2.3.5. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo 2.3.5.1. Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6 Pha 1ml dung dịch E6 theo các nồng độ khác nhau, chiếu từ trường trong 30 phút để khảo sát khả năng đốt nhiệt từ của mẫu này. Bảng 2. Nồng độ hạt từ E6 trong thí nghiệm khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ in vitro Mẫu Nồng độ (mg/ml) E1 1.0 E2 0.7 E3 0.5 E4 0.3 E5 0.1 Các mẫu sẽ được chiếu từ trường trong 30 phút, đo nhiệt độ trong quá trình chiếu, từ đó sẽ khảo sát được khả năng đốt – nhiệt từ của mẫu này. 2.3.5.2. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo 4 chuột có kích thước khối u dưới da tương đối đồng đều, không có dấu hiệu bị hoại tử và được tiêm như bảng bố trí thí nghiệm sau: Bảng 3. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt ex vivo khối u rắn dưới da trên chuột Swiss Chuột Kích thước khối u (mm) Lượng chất lỏng từ E6 (μg)/u Tiêm trực tiếp Tiêm ven M1 7 x 6.5 - - M2 7 x 7 300 - M3 7 x 6 400 - M4 7 x 6 - 1500 Đối với những chuột tiêm trực tiếp (M2 và M3), cần để thời gian là 10 phút, 30 phút đối với chuột tiêm tĩnh mạch (M4) cho hạt từ phân bố đều khắp khối u, sau đó dùng kéo tách lấy khối u cho vào ống eppendorf. Đưa ống eppendorf chứa u vào trong lòng cuộn cảm, bật máy phát từ trường và tiến hành chiếu từ trường 30 phút (hình 13). Đo nhiệt độ khối u trong quá trình chiếu từ trường để theo dõi quá trình thay đổi nhiệt độ. Hình 13.Hệ thống máy phát từ trường RDO, moel HFI (Mỹ) 2.3.6. Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phân bố của hạt từ E6 khi đưa dung dịch E6 vào cơ thể theo đường tĩnh mạch. 2.3.6.1. Bằng phương pháp đốt nhiệt từ Sự có mặt của vật liệu từ trong từ trường xoay chiều sẽ làm tăng nhiệt độ, dựa vào nguyên tắc này chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiêm tĩnh mạch hạt từ E6 vào chuột đã có u rắn dưới da, tách lấy nội quan và khối u, chiếu từ trường xoay chiều. Nếu nhiệt độ khối u và các cơ quan tăng lên thì chứng tỏ hạt từ E6 có mặt ở các cơ quan này, nhiệt độ càng cao thì lượng hạt từ càng lớn. Sau khi gây tạo u rắn dưới da thành công trên chuột, chọn 2 chuột có kích thước khối u tương đối đồng đều: Chuột A - Tiêm ven 2000 µg hạt từ - Để 60 phút - Tách gan, phổi, thận, lách và khối u, gia nhiệt và đo nhiệt độ Chuột B - Tiêm ven 2000 µg hạt từ - Để 180 phút - Tách gan, phổi, thận, lách và khối u, gia nhiệt và đo nhiệt độ 2.3.6.2. Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Cơ sở lí thuyết của phép đo AAS là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ. Vì vậy để có thể xác định được hàm lượng nguyên tố sắt có trong các cơ quan của chuột thì phải tro hoá mẫu, loại bỏ toàn bộ các chất hữu cơ, chỉ còn lại các chất vô cơ thành dạng dung dịch. Hệ thống nguyên tử hoá mẫu của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (Shimadzu – Nhật Bản) sẽ chuyển dung dịch tro hoá thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Chiếu chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố sắt qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố sắt trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó. Ở đây, một phần cường độ của chùm sáng đã bị nguyên tử sắt hấp thụ và phụ thuộc vào nồng độ của nguyên tố sắt trong môi trường hấp thụ. Từ đó có thể xác định được nồng độ sắt có trong mẫu. Sau khi gây tạo u rắn dưới da thành công, chọn 2 chuột có kích thước khối u tương đối đồng đều nhau: - Chuột A: Đối chứng ung thư - Chuột B: Tiêm tĩnh mạch 2000µg hạt từ E6, để trong 60 phút. Tách 5 cơ quan là u, gan, thận, lách, phổi của chuột A và B, tiến hành tro hóa. Sau đó đo nồng độ sắt có trong 1ml dịch tro hoá bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (Shimadzu – Nhật Bản) để xác định hàm lượng Fe có trong 5 cơ quan nói trên. Hình 14. Hình ảnh máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) (Shimadzu – Nhật Bản) Phương pháp tro hóa mẫu Cân 1g mẫu rồi cho vào bình Kenđan, cho thêm 10ml H2SO4 đặc (d=1.84). đậy bình bằng 1 chiếc phễu thủy tinh và đun cho tới khi ngừng thoát khói trắng mạnh. Lấy ra để nguội rồi cho thêm 4 giọt HClO4 70% (hay 1ml HClO4 15%), tiếp tục đun cho tới khi cặn có màu trắng. Lấy 1ml dịch mẫu vừa tro hóa đo bằng máy hấp thụ nguyên tử để xác định nồng độ sắt C (mg/l). Từ đó có thể tính được hàm lượng sắt có trong 1g nội quan đó theo công thức sau: a = (C x V) trong đó: C – nồng độ sắt có trong mẫu (mg/l) V – thể tích mẫu sau khi tro hóa xong (l) a – Hàm lượng sắt có trong 1g nội quan (g) 2.3.7. Liệu pháp gia nhiệt in vivo 6 chuột được cấy ghép với tế bào Sarcoma 180 để tạo u rắn dưới da được phân lô và bố trí thí nghiệm như bảng 4: Bảng 4. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt in vivo trên 6 chuột thí nghiệm STT Chuột Kích thước u (mm) Lượng E6 tiêm vào u (µg) Thời gian chiếu từ trường (phút) Số lần chiếu từ trường (2 ngày 1 lần) 1 A (ĐCSH) 0 0 30 3 2 B (ĐCUT) 6.0x7.0 0 0 0 3 C 6.4x6.9 0 30 3 4 D 6.5x7.0 400 0 0 5 E 6.5x6.5 300 30 3 6 F 6.6x6.7 400 30 3 Chuột A, B, C, D được chọn làm đối chứng, trong đó: Chuột A làm đối chứng sinh học, không có khối u nhưng được chiếu từ trường 3 lần, để kiểm tra chiếu từ trường có ảnh hưởng đến sức khoẻ của chuột bình thường hay không? Chuột B – đối chứng

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docluanvanthacsi_dinhdangword_135_2714_1869816.doc
Tài liệu liên quan