Luận văn Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-Loop) hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre

gian 1 phút. - Giai đoạn gắn mồi: điều quan trọng nhất khi thực hiện phản ứng PCR là việc lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của cặp mồi sử dụng để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55oC nên chúng tôi đã tiến hành thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ từ 50 - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 54 oC, qua đó chọn đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 54oC. Thời gian của giai đoạn gắn mồi là 1 phút 10 giây. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến 72oC để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thƣớc 1227 bp trong khi tốc độ tổng hợp của phản ứng vào khoảng 1000 nucleotide/ phút nên thời gian của giai đoạn này là 1 phút 20 giây. Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 94 oC 54 oC 72 oC 72 oC 4 oC Thời gian 4’ 1’ 1’10’’ 1’20’’ 10’  Số chu kỳ 1 35 1 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1) cho thấy các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí giữa băng 1,5 kb và 1 kb, nhƣ vậy sản phẩm PCR có kích thƣớc phân tử vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Do đó, có thể sơ bộ kết luận đây là vùng D-loop của hệ gen ty thể gà. Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu Dt: gà Đông Tảo, Ri: gà Ri, Tr: gà Tre M Dt01 Dt05 Dt09 Dt17 Ri03 Ri07 Ri14 Ri21 Tr06 Tr11 Tr18 1,5 1 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank Trình tự 609 nucleotide vùng D-loop từ vị trí 21 đến vị trí 629 trên mtDNA của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre, đƣợc xác định trực tiếp theo phƣơng pháp dideoxy sử dụng mồi L16725, bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên máy phân tích trình tự DNA tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer. Dữ liệu trình tự nucleotide sau khi đƣợc xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape® v2.6 và BioEdit v7.0.9 đƣợc so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản (thuộc phân loài Gallus gallus domesticus), trình tự này mang mã số AP003580 trên GenBank đƣợc Nishibori và đtg công bố năm 2003. Trình tự 609 nucleotide trong vùng D-loop của 71 mẫu cá thể thuộc 3 giống gà nghiên cứu đƣợc xử lý và so sánh nhƣ sau: 10 20 30 40 50 60 70 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CTCCCCTACT AAGTGTACCC CCCCTTTCCC CCCCAGGGGG GGTATACTAT GCATAATCGT GCATACATTT Dt-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-20 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 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Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 150 160 170 180 190 197 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CATTAATCTA TATTCCACAT TTCTCCCAAT GTCCATTCTA TGCATGATCC AGGACACACT CATTCACCCT Dt-18 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-19 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-20 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-21 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-22 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-01 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-02 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-03 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-04 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... 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