Luận văn Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, hiệu quả tạo củ khoai tây bi in vitro và trồng thử nghiệm tại Thái Nguyên

Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu in vitro 2.2.1.1. Phƣơng pháp nhân chồi, tạo củ * Ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đến khả năng tạo củ bi trong ống nghiệm Môi trường nhân chồi: MS cơ bản, bổ sung aga 1%, saccharose 2%, NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l, pH= 5,8 [39]. Sử dụng bình tam giác có thể tích 250ml, mỗi bình đều chứa 30ml môi trường nhân chồi như trên, chồi cấy vào các bình môi trường đã chuẩn bị với mật độ: 8- 10 chồi/bình 14-15 chồi/bình 10- 11 chồi/bình 16-17 chồi/bình 12-13 chồi/bình 18-19 chồi/bình Khi chồi khoai tây trong bình cao từ 5cm đến 7cm (sau 2-3 tuần) sẽ được sử dụng để tạo củ. Môi trường tạo củ tối thích đã được nghiên cứu với chất cảm ứng tạo củ là BAP 9,5mg/l, nền môi trường MS cơ bản, 15% nước dừa, saccharose 8%, pH= 5,8. Mỗi bình cây đều được bổ sung 100ml môi trường tạo củ và đặt trong buồng tối nhiệt độ 27  2 0C [39]. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi công thức 30 bình. Khả năng tạo củ được xác định sau 7 tuần nuôi cấy. * Ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt đối với khả năng sinh trưởng của chồi và tạo củ bi in vitro: Sử dụng môi trường nhân chồi và tạo củ tối thích đã được nghiên cứu [39]; các bình tam giác 250ml đều được đổ lượng môi trường nhân chồi như nhau và cấy chồi với cùng mật độ (14 chồi/bình), các bình thí nghiệm được cấy các đoạn chồi ở các vị trí khác nhau: đoạn cắt phần ngọn; đoạn cắt phần giữa thân; đoạn cắt gần gốc. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi công thức 30 bình. Khả năng sinh trưởng của chồi được xác định sau 20 ngày nuôi cấy, khả năng tạo củ được xác định sau 7 tuần nuôi cấy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.2.1.2. Theo dõi bảo quản củ bi trong phòng thí nghiệm và thời gian ngủ nghỉ của củ * Theo dõi mức độ hao hụt củ bi trong thời gian bảo quản: Củ khoai tây bi sau khi thu hoạch, đem rửa sạch, để khô, phân loại củ theo 2 loại kích thước (đường kính >0,5cm và <0,5cm) và bảo quản trong các bình tam giác thể tích 500ml. Các bình củ được bảo quản trong phòng nuôi cấy (nhiệt độ 27  2 0 C) mỗi bình bảo quản 200 củ. Mức độ hao hụt củ bi được xác định bằng tỉ lệ củ bị hỏng so với số củ theo dõi trong thời gian bảo quản là 3 tháng * Theo dõi thời gian ngủ của củ bi: Củ khoai tây bi sau khi thu hoạch, rửa sạch, để khô, phân loại kích thước, dải đều củ bi trên khay chứa cát và đặt trong buồng tối (nhiệt độ 27  2 0C).Thường xuyên tưới nước vào các khay cát và loại bỏ củ bị hỏng. Thời gian ngủ của củ bi được tính từ khi thu hoạch củ đến khi có 50% số củ theo dõi nảy mầm. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi công thức được tiến hành trên 150 củ. * Theo dõi tỉ lệ nảy mầm của củ bi: Sau khi qua thời gian ngủ nghỉ, củ bi được trồng trên đất ruộng và theo dõi tỉ lệ nảy mầm. Khả năng nảy mầm được xác định sau 15-20 ngày trồng. 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng 2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Các ô thí nghiệm có diện tích 10m2, khoai tây được trồng theo kiểu hàng kép, mật độ 9 khóm/m2. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trồng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và các yếu tố cấu thành năng suất của khoai tây trồng từ củ bi được tiến hành ở 3 thời điểm trồng 20/10/2007; 27/11/2007; 10/12/2007 với củ bi tạo ra từ giống Diamant, Solara và các giống đối chứng tương ứng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2.2.2. Trồng, chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh * Làm đất: Đất có cấu tượng nhẹ, tơi xốp. Dọn sạch cỏ, phay tơi xốp độ sâu khoảng 30cm, đánh luống đôi rộng 120 cm (cả rãnh), cao 15cm. Rắc đều trấu, vôi bột , phân chồng và thuốc chống kiến đều trên mặt luống sau đó đảo trộn đều với đất. * Trồng khoai tây: 1 tuần sau khi làm đất tiến hành trồng khoai tây. Rãnh được xẻ cách nhau 40cm và cách đều 2 mép. Chọn những củ bi mầm bắt đầu xuất hiện, không để mầm dài, sẽ khó trồng và khi trồng mầm phát triển yếu. Đặt củ giống vào hốc, phủ đất sâu đều tay khoảng 3- 4 (cm). * Chăm sóc: Chế độ chăm sóc các giống đối chứng và thí nghiệm là như nhau. - Xới + vun gốc khoai tây: Xới đất xung quanh gốc khoai tây tạo độ tơi xốp và thoáng khí cho cây phát triển. Sau khi trồng củ bi được 25 - 30 ngày - chiều cao cây 6 - 7cm (đối chứng được 15 ngày) tiến hành xới quanh gốc, bón thúc lần 1 và vun gốc. Sau khi cây củ bi được 40 - 45 ngày, chiều cao cây 19- 20cm (đối chứng được 30 ngày) tiến hành xới, bón thúc và vun lần 2 - Tưới nước: Tưới nước hàng ngày trong 60 ngày đầu . - Bón thúc phân và phun thuốc bảo vệ thực vật Bảng 2.1. Chế độ chăm sóc khoai tây trên đồng ruộng (vụ đông-2007) Chế độ Chăm sóc Thời điểm sau trồng (ngày) Chỉ tiêu Đơn vị tính Lượng Bón lót - Phân chuồng (phân gà) kg /100m2 100 Trấu hun kg /100m2 50 Vôi bột kg /100m2 8 Thuốc chống kiến Bón thúc lần 1 20 Đạm kg /100m2 1kg Kali kg/100m 2 1kg Bón thúc lần 2 35 Lân kg/100m 2 5 kg Phòng mốc sương (2 lần) 15 Ridomil Mancozeb (25gr) 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 2.2.2.3. Chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp theo dõi * Sinh trưởng và phát triển của khoai tây - Thời gian sinh trưởng (ngày): Là khoảng thời gian tính từ khi trồng đến khi thu hoạch (lúc có khoảng 1/3- 1/2 số lá trên cây khoai tây chuyển sang màu vàng). - Tỉ lệ khóm được thu hoạch (%): Tỉ lệ khóm có củ/ tổng số hốc trồng. - Chiều cao cây (cm): Được đo từ giao điểm rễ với thân đến điểm sinh trưởng của ngọn cao nhất. - Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây (cm/cây/ngày): Được xác định ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây. 2h1 h a n   Trong đó: a : là tốc độ tăng chiều cao cây (cm/cây/ngày). h1: là chiều cao cây vào cuối giai đoạn theo dõi (cm). h2: là chiều cao cây ở đầu giai đoạn theo dõi (cm). n : là khoảng thời gian của giai đoạn theo dõi (ngày). - Số lá/cây: Đếm trực tiếp số lá trên thân chính vào các thời điểm khác nhau. - Đường kính thân (cm): Được đo ở khoảng giữa các thân chính. - Độ phủ luống ( %): Đo trực tiếp độ phủ của từng cây. Các chỉ tiêu sinh trưởng theo dõi ở các thời điểm: 30, 45, 60 ngày sau trồng và khi thu hoạch. * Các yếu tố cấu thành năng suất: - Số củ/ khóm, khối lượng trung bình 1 khóm (gam), khối lượng trung bình 1 củ (gam) - Tỉ lệ củ thương phẩm (%): Củ có khối lượng >25(gam) - Phân loại cỡ củ sau thu hoạch (%): Khi thu hoạch tiến hành dùng thước kẹp đo chiều ngang nơi rộng nhất của củ rồi phân loại theo kích thước đường kính ( >5(cm); 4- 5(cm); 3- 4(cm); 2- 3(cm); <2(cm)). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 * Các chỉ tiêu về chất lượng củ đánh giá theo cảm quan thông qua quan sát: Màu vỏ củ, hình dạng củ, độ sâu mắt củ, màu ruột củ. 2.2.3. Phƣơng pháp hoá sinh 2.2.3.1. Xác định hàm lƣợng tinh bột Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp Bertrand được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs [2]. Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit, thuỷ phân hoàn toàn tinh bột thành glucose. Định lượng đường khử xác định được hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu. Khoai tây gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền kỹ trong nước cất, thêm 5ml HCl đậm đặc, đun cách thuỷ trong 4giờ. Để nguội sau đó trung hoà mẫu và khử tạp. Định mức bằng nước cất và lọc hoặc li tâm để loại cặn. Dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Đo glucose: Cho 20ml dung dịch Feling + 10ml dung dịch chiết + 20 ml dung dịch nước cất, đun sôi trong 3 phút đến xuất hiện kết tủa đỏ gạch Cu2O. Để nguội, rửa kết tủa Cu2O ba lần bằng nước cất nóng. Hoà tan kết tủa bằng Fe2(SO4)3. Chuẩn độ dung dịch trong bình (Fe ++) bằng KMnO4 0,1N. Hàm lượng glucose được tính theo công thức: %100(%)     av GV X Trong đó: V: Thể tích dịch dịch chiết. G: Số gam glucose tương ứng với số ml KMnO4 0,1N (Tra bảng) a: Số gam mẫu đem phân tích v: Số ml dung dịch mẫu đem phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức: 9,0(%)(%)  XT Trong đó: T: Hàm lượng tinh bột X: Hàm lượng glucose 0,9: Hệ số quy đổi từ glucose thành tinh bột. 2.2.3.2. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được mô tả theo tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [2]. Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành feroxianua kali với sự có mặt của gelatin, feroxianua kết hợp với sắt sunphát tạo thành phức chất màu xanh bền. Củ khoai tây gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Hàm lượng đường tan đo ở bước sóng 585 nm dựa trên đồ thị đường chuẩn glucose. Hàm lượng đường tan được tính theo công thức: %100(%)    m HSPLba X Trong đó: X: Hàm lượng đường tan (% khối lượng tươi) a: Nồng độ thu đuợc khi đo trên máy (mg/ml). b: Số ml dịch chiết HSPL: Hệ số pha loãng m : Khối lượng mẫu (mg) 2.2.3.3. Xác định hàm lƣợng protein Hàm lượng protein tan được xác định theo phương pháp lowry được mô tả theo tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [2]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Nguyên tắc: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và protein (phản ứng biure). Chất này có tác dụng với thuốc thử foling cho màu đặc trương, cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Củ khoai tây gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền nhỏ trong dung dịch đệm photphat citrat pH=10. Lắc 20 phút, để trong tủ lạnh 4 0C trong 24giờ. Ly tâm 12000vòng/phút trong 20 phút, thu dịch (lặp 2 lần), định mức lên 2ml. Lấy 0,25ml dịch + 0,25ml foling, định mức lên 2,5ml . Tiến hành lặp lại 3 lần. Đo hấp thụ quang phổ trên máy UV- Visible ở bước sóng 750nm. Hàm lượng protein được tính theo công thức: %100(%)    m HSPLA X Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng tươi) A: Nồng độ thu đuợc khi đo trên máy (mg/ml). HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu (mg) 2.2.3.4. Xác định hàm lƣợng Vitamin B6 Hàm lượng vitamin B6 được xác định theo tài liệu của Trương Công Quyền [22]. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 để tính tương quan giữa lượng vitamin B6 và NaOH 0,1N dùng chuẩn độ. Khoai tây gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tâm lấy dịch làm thí nghiệm. Hàm lượng vitamin B6 được xác định qua lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29   m bca X 100  Trong đó: X: Hàm lượng vitamin B6 trong 100gam mẫu tươi (mg/100g khối lượng tươi). a: Số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ mẫu. b: Lượng vitamin B6 ứng với 1ml NaOH 0,1N. c: Số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn không bạch (không chứa mẫu phân tích) m: Khối lượng mẫu phân tích ( 10gam mẫu tươi) 100: 100 gam mẫu tươi 2.2.3.5. Xác định hàm lƣợng vitamin C Hàm lượng vitamin C được xác định theo phương pháp Bacutrava được mô tả trong tài liệu của Bacutrava (1973) [1]. Mẫu gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền và định mức bằng HCl 2% lên 100ml. Lọc dịch và sử dụng để chuẩn độ bằng 2,6 DI. Công thức tính hàm lượng vitamin C: vA VTba X    100)( Trong đó: X: Hàm lượng vitamin C trong 100gam mẫu tươi (mg/100g mẫu) a: Số ml 2,6 DI chuẩn độ mẫu b: Số ml 2,6 DI chuẩn độ không bạch T: Số mg sinh tố C tương đương 1ml dung dịch màu 2,6 DI V: Tổng thể tích dung dịch mẫu (ml) v: Thể tích dịch mẫu đem phân tích (ml) A: Trọng lượng tươi của mẫu đem phân tích (gam) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 b a T   088,0 Trong đó: 0,088: Số mg sinh tố C tương đương với 1ml dung dịch iot 0,001N trong chuẩn độ (KIO3 0,001N) a: Số ml dung dịch KIO3 0,001N đã dùng chuẩn độ b: Số ml dung dịch chất chỉ thị màu 2,6 DI 2.2.3.6. Xác định hàm lƣợng khoáng * Khoáng tổng số Mẫu gọt vỏ, cân khối lượng, cho vào chén sứ đã sấy khô, đốt mẫu ở 300 0C trong 1 giờ, hút ẩm mẫu và tiếp tục đốt ở 550- 6000C trong 8 giờ. Hút ẩm mẫu và cân khối lượng. Hàm lượng khoáng tổng số được xác định theo công thức: (%)100(%)  B A X Trong đó: X: Hàm lượng khoáng (% khối lượng tươi) A: Khối lượng mẫu sau đốt (mg). B: Khối lượng mẫu trước khi đốt (mg). * Kali tổng số: Được xác định trên thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. Khoai tây gọt vỏ, cân khối lượng, nghiền nhỏ, thêm 10ml hỗn hợp 2 axit (HNO3 + HClO4), công phá ở 150 0 C- 200 0C đến khi dung dịch chứa mẫu trong, để nguội, định mức lên 100 ml, lọc dịch bằng giấy lọc, dịch lọc thu được sử dụng làm thí nghiệm. Hàm lượng kali được đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ở bước sóng 366,5nm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Hàm lượng kali được tính theo công thức: (%)100 )( (%)    m VBA X Trong đó: X: Hàm lượng kali (% khối lượng tươi) A: Nồng độ thu được của mẫu khi đo trên máy (mg/ml). B: Nồng độ của đối chứng (mg/ml) (Không chứa mẫu phân tích) V: Tổng thể tích dung dịch mẫu (ml) m : Khối lượng mẫu đem phân tích (mg). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiệu quả tạo khoai tây củ bi in vitro, đặc điểm sinh lí và tính toán chi phí sản xuất khoai tây củ bi trong phòng thí nghiệm 3.1.1. Ảnh hƣởng của mật độ chồi cấy đến hiệu quả tạo củ bi nuôi cấy in vitro Trên cơ sở môi trường nhân chồi và tạo củ tối thích đã được nghiên cứu [39], chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đối với sự tạo củ khoai tây để có thể tìm ra mật độ thích hợp cho hiệu quả tạo củ cao nhất. Thí nghiệm thực hiện trong bình tam giác với thể tích 250ml với 100ml môi trường nhân chồi. Theo dõi khả năng tạo củ sau 7 tuần, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đến khả năng tạo củ bi in vitro (Sau 7 tuần) Số chồi /bình Số củ/bình Tỷ lệ củ có kích thước < 0,5 cm (%) Tỷ lệ củ có kích Thước > 0,5 cm (%) Solara Diamant Solara Diamant Solara Diamant 8-9 25,88  0,11 25,25  0,25 17,62  0,33 16,43  0,05 82,38  0,33 83,57  0,05 10-11 33,26  0,07 32,14  0,12 18,73  0,08 18,65  0,12 81,27  0,08 81,35  0,12 12-13 39,43  0,27 38,88  0,10 19,78  0,11 19,47  0,08 80,22  0,11 80,53  0,08 14-15 44,07  0,25 43,65  0,09 20,79  0,06 20,07  0,04 79,93  0,06 79,54  0,04 16-17 46,29  0,16 45,25  0,16 32,50  0,23 31,49  0,21 68,50  0,23 68,53  0,21 18-19 47,53  0,09 47,21  0,22 40,13  0,17 39,50  0,07 59,87  0,17 60,43  0,07 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Kết quả cho thấy, mật độ chồi cấy trong bình ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng tạo củ và kích thước củ trong ống nghiệm. Số chồi/bình cao tổng số củ/ bình lớn hơn so với mật độ chồi cấy thấp. Mật độ chồi cấy từ 8 - 11 chồi/bình cho tỉ lệ củ có kích thước >0,5cm đạt từ 81,27% - 83,57%, nhưng thu được tổng số củ/bình thấp (25,25- 33,26 củ/bình). Trong khi đó, mật độ chồi cấy từ 14 - 19 chồi/bình cho tổng số củ/bình lớn (43,65 – 47,53 củ/bình), nhưng tỷ lệ củ có kích thước đường kính củ <0,5cm cao (20,07% – 40,135%), trong đó có nhiều củ có kích thước đường kính củ <0,2cm. Do vậy, mật độ chồi cấy thích hợp từ 13 – 17 chồi/bình sẽ cho hiệu quả tạo củ bi tốt nhất, củ thu được tương đối đồng đều. Không nên cấy với mật độ chồi dầy trên 19 chồi/bình tuy số củ thu được trong một bình tạo củ cao nhưng lượng củ kích thước nhỏ nhiều. a) 8 - 9 chồi/bình b) 10 - 11 chồi/bình c) 12 – 13 chồi/ bình d) 14 - 15 chồi/bình e) 16 - 17 chồi/bình g)18 - 19 chồi/bình Hình 3.1. Ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đến khả năng tạo củ bi in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 3.1.2. Ảnh hƣởng của vị trí đoạn cắt trên chồi đối với quá trình nuôi cấy in vitro 3.1.2.1. Ảnh hƣởng của vị trí đoạn cắt đối với sự sinh trƣởng của cây trong ống nghiệm Sau khi lựa chọn được mật độ chồi cấy thích hợp cho hiệu quả tạo củ bi cao nhất là 14 -15 chồi/bình, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt trên chồi khoai tây đến khả năng sinh trưởng của chồi khi cấy chuyển, các vị trí cắt khác nhau (phần ngọn, phần giữa thân, phần gần gốc). Kết quả thí nghiệm thể hiện qua bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt đối với sự sinh trưởng cây in vitro (sau 3 tuần) Vị trí đoạn cắt Giống Chiều cao thân chính (cm) Số lá/cây Số chồi/cây Phần ngọn Solara 7,00  0,07 13,05  0,58 3,13  0,02 Diamant 7,15  0,05 12,02  0,36 2,01  0,05 Phần giữa thân Solara 6,75  0,08 15,70  0,33 4,61  0,09 Diamant 6,76  0,09 13,48  0,45 3,45  0,03 Phần gốc Solara 6,50  0,08 15,88  0,50 4,95  0,06 Diamant 6,65  0,07 13,80  0,45 3,72  0,05 Kết quả nghiên cứu cho thấy, vị trí đoạn cắt có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi khi cấy chuyển, thể hiện qua các chỉ tiêu: Chiều cao thân chính, số lá/ cây và số chồi/cây. Sử dụng phần ngọn để cấy chuyển cho chiều cao của chồi lớn nhất. Các chồi cấy từ phần giữa thân và phần gần gốc có sự tăng chiều cao thấp hơn, tuy nhiên mức độ chênh lệch là không đáng kể. Số lá/cây và số chồi /cây của chồi được cấy từ phần giữa thân và phần gốc cao hơn so với phần ngọn, khi cấy bằng phần ngọn giống Diamant đạt 2,01 chồi/cây, giống Solara đạt 3,13 chồi/cây. Cấy bằng phần thân số chồi dao động 3,45-3,72 chồi/cây đối với giống Diamant, 4,61-4,95 chồi/cây đối với giống Solara. Giữa phần giữa thân và phần gốc có sự dao động không nhiều. Số lá/cây cũng có xu hướng biến động tương tự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 a) Phần ngọn b) Phần giữa thân c) Phần gần gốc Giống Diamant a) Phần ngọn b) Phần giữa thân c) Phần gần gốc Giống Solara Hình 3.2. Ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt đối với khả năng sinh trưởng của chồi 3.1.2.2. Ảnh hƣởng của vị trí đoạn cắt đối với hiệu quả tạo củ bi in vitro Do sự ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt trên chồi đến sinh trưởng của chồi khi cấy chuyển, nên hiệu quả tạo củ ở các vị trí chồi khác nhau cũng chịu ảnh hưởng của vị trí cắt. Sau khi nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí cắt đối với quá trình cấy chuyển chúng tôi tiếp tục tạo củ ở các bình thí nghiệm có vị trí đoạn cắt khác nhau để thấy được sự ảnh hưởng của vị trí cắt trên chồi đối với quá trình tạo củ bi in vitro. Kết quả thu được ở bảng 3.3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt đối với hiệu quả tạo củ bi in vitro Vị trí Giống Số củ/bình Tỉ lệ các cỡ củ (%) 0,8cm Phần ngọn Solara 35,50  1,21 15,80  1,33 55,70  0,90 28,50  1,00 Diamant 34,01  0,90 14,05  0,80 55,45  1,21 30,50  0,80 Phần giữa thân Solara 46,45  0,88 29,50  0,55 52,70  1,10 17,80  0,80 Diamant 46,25  1,20 26,50  0,80 55,50  0,90 18,00  0,50 Phần gốc Solara 47,25  0,92 30,40  1,01 54,10  0,89 15,50  0,50 Diamant 46,90  1,00 26,04  0,50 55,25  0,52 18,71  0,45 Hiệu quả tạo củ bi chịu ảnh hưởng rõ ràng của vị trí đoạn cắt trên chồi. Phần ngọn đạt 35,5 củ/bình, tương đương khoảng 76% số củ/bình của phần thân. Tỉ lệ củ bi ở từng kích thước đối với các vị trí đoạn cắt có sự khác nhau. Ở phần ngọn tỉ lệ củ đường kính >0,5cm cao hơn các vị trí khác, đạt 84,2% đối với giống Solara, 85,95% đối với giống Diamant. Trong khi đó ở phần thân số củ/bình cao hơn nhưng củ có đường kính <0,5cm chiếm tỉ lệ cao hơn ở phần ngọn, chiếm 29,5-30,4% đối với giống Solara, 26,04- 26,5% đối với giống Diamant. Các chồi cấy từ phần gần gốc có số củ/bình nhiều hơn ở các vị trí khác, tuy nhiên, tỉ lệ củ có đường kính <0,5cm lại cao. Như vậy, khi cấy chồi bằng phần thân thì cho tỉ lệ chồi/cây cao hơn khi cấy bằng phần ngọn do đó mà khi tạo củ cho số củ/bình cao hơn nhưng tỉ lệ củ nhỏ nhiều. Vì vậy, để tăng hiệu quả tạo củ bi và giảm bớt sự tiêu tốn môi trường nhân chồi và tạo củ, khi cấy chuyển nên cấy riêng các vị trí của chồi và cấy phần thân với mật độ thấp hơn phần ngọn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Phần ngọn Phần giữa thân Phần gần gốc Giống Solara Phần ngọn Phần giữa thân Phần gần gốc Giống Diamant 3.1.3. Mức độ hao hụt củ bi trong bảo quản, thời gian ngủ và khả năng nảy mầm của khoai tây củ bi in vitro Sau khoảng thời gian 7- 8 tuần tạo củ, cây khoai tây trong bình tạo củ có thân và lá héo, úa vàng, chúng tôi tiến hành thu hoạch củ. Củ bi sau khi thu hoạch được chia ra làm 2 loại kích thước đường kính củ (>0,5cm và <0,5cm) và bảo quản trong phòng nuôi cây (nhiệt độ 27  2 0C). Những củ bị hỏng chuyển sang thâm úa, vỏ nhăn nheo và bị mềm. Theo dõi thời gian ngủ nghỉ của từng giống theo 2 loại kích thước củ bằng cách giâm củ trên khay cát và tưới nước hàng ngày. Sau thời gian ngủ nghỉ của củ, chúng tôi tiến hành trồng Hình 3.3. Ảnh hưởng của vị trí đoạn cắt đến hiệu quả tạo củ bi in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 củ bi và theo dõi tỉ lệ nảy mầm ở 2 loại kích thước củ trong 15-20 ngày sau khi trồng. Kết quả thu được ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Thời gian ngủ và mức độ hao hụt của củ bi trong bảo quản Giống Củ có đường kính 0,5 cm Tỷ lệ hao hụt/bình (%) Tỷ lệ củ hỏng/bình (%) Thời gian ngủ (ngày) Tỉ lệ củ không nảy mầm(%) Tỷ lệ củ hỏng/bình (%) Thời gian ngủ (ngày) Tỉ lệ củ không nảy mầm (%) Solara 27,93  0,66 45 – 50 10,22  0,12 15,99  0,45 75 - 80 10,02  0,10 28,92 Diamant 25,91  0,09 45 – 50 9,01  0,05 12,99  0,16 82 - 85 8,45  0,22 24,75 Kết quả bảng 3.4 cho thấy, kích thước củ bi ảnh hưởng lớn đối với chất lượng củ trong thời gian bảo quản. Kích thước củ quá nhỏ sẽ khó khăn trong quá trình bảo quản, tỉ lệ củ bị hao hụt do khô héo và thối cao. Như vậy củ bi kích thước quá nhỏ sẽ bị hao hụt nhiều khi bảo quản nên để tăng hiệu quả sử dụng củ bi in vitro, trong quá trình tạo củ cần hạn chế sự xuất hiện củ có kích thước quá nhỏ <0,5cm). Tỉ lệ củ bi không nảy mầm không chịu ảnh hưởng rõ ràng của kích thước củ, tỉ lệ này dao động từ 8,45%- 10,22%. a) Nảy mầm của củ bi có kích thước <0,5cm (sau 50 ngày) b)Nảy mầm của củ bi có kích thước >0,5cm (sau 80 ngày) c) Cây con mọc từ củ bi in vitro (sau khi trồng 20 ngày) Hình 3.4. Khả năng nảy mầm của củ bi in vitro Theo nghiên cứu của chúng tôi, khoai tây bi có kích thước <0,5cm có thời gian ngủ nghỉ ngắn hơn khoai tây củ bi có kích thước > 0,5cm. Giống Diamant Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 luôn có thời gian ngủ nghỉ dài hơn giống Solara ở những củ có kích thước đường kính củ >0,5cm. Dựa vào kết quả của bảng 3.1 và bảng 3.4, chúng tôi tính toán tỷ lệ củ thu được trong một bình tạo củ có thể sử dụng trồng ngoài đồng ruộng từ 71,08% - 75,25%. * Nhận xét: Sử dụng môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu [39] chúng tôi nhận thấy: - Hiệu quả nuôi cấy cao nhất ở mật độ chồi 14-15 chồi/bình tam giác 250ml và có thể sử dụng mọi vị trí đoạn cắt trên cây khoai tây in vitro. - Giai đoạn nhân chồi: Với môi trường MS cơ bản + aga 1%+ saccharose 2% + NAA 0,2 mg/ + BAP 1,5 mg/l [39] và cấy với mật độ 14 – 15 chồi/bình, thời gian cần thiết cho sự sinh trưởng của chồi là 2- 3 tuần. - Giai đoạn tạo củ: Với môi trường MS cơ bản+ nước dừa 15%+ sacchaose 8%+ 9- 9,5 mg/l [39] và cấy với mật độ 15 chồi/bình thì thời gian cần thiết cho thu hoạch củ bi từ 7- 8 tuần. - Giai đoạn ngủ nghỉ: Với điều kiện bảo quản củ trong phòng tối nhiệt độ phòng 270C  2 0C và củ được dải trên khay cát thì thời gian cho giai đoạn là 45- 85 ngày tuỳ thuộc vào từng giống và kích thước củ bi. Như vậy, thời gian cho cả quy trình nuôi cấy in vitro để có củ giống trồng ngoài đồng ruộng (từ giai đoạn nhân chồi đến hết giai đoạn ngủ của củ) là 15- 23 tuần tuỳ vào giống và kích thước củ bi. 3.1.4. Chi phí sản xuất khoai tây củ bi trong phòng thí nghiệm 3.1.4.1. Chi phí về hoá chất để sản xuất củ bi trong phòng thí nghiệm (Tính cho 1lít môi trƣờng) Để thấy được hiệu quả kinh tế của việc sản xuất củ giống khoai tây củ bi so với sản xuất củ giống truyền thống, chúng tôi tính toán chi phí về hoá chất của các khâu sản xuất củ giống trong phòng thí nghiệm. Căn cứ vào đơn giá và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 lượng hoá chất cần thiết chúng tôi tính toán chi phí cho 1 lít môi trường nhân chồi và tạo củ bi in vitro. Bảng 3.5. Chi phí về hoá chất dùng để sản xuất củ bi trong phòng thí nghiệm Hoá chất Đơn giá Chi phí cho 1 lít môi trường nhân chồi Chi phí cho 1 lít môi trường tạo củ Số lượng