Luận văn Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ tandem LC-MS/MS

ữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS. Đối với đầu dò huỳnh quang FLD, sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào đầu dò. Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha thuận) thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc đầu dò khối phổ MS/MS. Đối với đầu dò UV hay DAD bên cạnh việc phát hiện bởi tín hiệu bị dung môi chứa cấu tử rửa giải hấp thụ ở một bước sóng nhất định để định lượng. Đối 12 với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợp chất nào đó. 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột Phương pháp sinh hóa trên chuột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơn giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm khẳng định. Tuy nhiên đối với các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều hợp chất cùng nhóm). Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật. 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí phân tích ở mức trung bình. Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với mức giới hạn cho phép thấp (ppb). Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết. 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 13 Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. Kỹ thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng. 1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản 1.6.1.1. Chiều rộng pic Chiều rộng pic được đo bằng cách mở rộng hai bên pic xuống đường nền và đo chiều rộng ở đường nền. Tuy nhiên, người ta thường đo tại bán chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơn. 1.6.1.2. Thời gian lưu (tr) và thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’) Thời gian lưu là tổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh, có đơn vị đo thường dùng là phút. Tại một nhiệt độ cột và tốc độ dòng cố định, mỗi hợp chất tốn cùng một thời gian trong pha động. Thời gian trong pha động được xác định bằng cách tiêm một hợp chất không bị lưu lại vào hệ thống HPLC và đo thời gian lưu của nó. Thời gian lưu này được gọi là thời gian chết của cột và biểu thị là tm hoặc to. Bởi vì mỗi hợp chất tiêu tốn cùng thời gian trong pha động, sự khác nhau trong thời gian lưu là do bởi sự khác nhau thời gian tiêu tốn trong pha tĩnh. Nếu lấy thời gian lưu của một hợp chất trừ thời gian chết của cột (tm) ta sẽ có được thời gian tiêu tốn thật sự của một hợp chất trong pha tĩnh, giá trị này được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’) và được tính bởi: tr’ = tr - tm (0.1) Trong đó: tr : thời gian lưu tm : thời gian của pic không bị giữ lại hay thời gian chết của cột 1.6.1.3. Tỷ số phân bố Tỷ số phân bố k hay hệ số chứa (k’) cho biết thời gian một hợp chất nằm trong pha tĩnh bao lâu so với hợp chất khác. Nếu k = 0 thì ta nói là hợp chất không bị lưu giữ. 14 m mr t ttk −= (0.2) Tỷ số phân bố phản ánh độ lớn thật sự lưu giữ hợp chất hơn thời gian lưu. 1.6.1.4. Hằng số phân bố (KD) Hằng số phân bố được định nghĩa là tỷ số nồng độ của hợp chất trong pha tĩnh và pha động. m s D C CK = (0.3) Cs: Nồng độ hợp chất trong pha tĩnh Cm: Nồng độ hợp chất trong pha động Hằng số phân bố rất tiện lợi để mô tả và dự đoán những thay đổi khả năng lưu giữ dựa trên thay đổi kích cỡ và nhiệt độ cột. 1.6.1.5. Hiệu năng cột Hiệu năng tách của cột được biểu diễn bởi số đĩa lý thuyết (n). ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛=⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡= b r h r W t W tn 16545,5 2 (0.4) Wb = 1,699Wh: chiều rộng pic tại đáy tr : thời gian lưu của pic Wh: Chiều rộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơn vị với tr) Ngoài ra còn dùng số đĩa lý thuyết hiệu dụng N 2'2' 16545,5 ⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡=⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡= b r h r W t W tN (0.5) Một đại lượng khác dùng để đo hiệu năng của cột là tương đương chiều cao của một đĩa lý thuyết (h hoặc HETP). n Lh = (0.6) n : tổng số đĩa lý thuyết L : chiều dài của cột (mm) 15 1.6.1.6. Hệ số tách (α) Còn được gọi là độ chọn lọc, cho biết khoảng cách giữa 2 pic. 1 2 k k=α (0.7) k1: tỷ số phân bố của pic giải hấp trước k2: tỷ số phân bố của pic giải hấp sau 1.6.1.7. Độ phân giải (R) Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ − −= 21 1218,1 hh rr WW ttR (0.8) tr1: thời gian lưu của pic 1 tr2: thời gian lưu của pic 2 Wh1: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 1 (cùng đơn vị với tr) Wh2: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 2 (cùng đơn vị với tr) Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau. 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) Hệ thống gồm 7 phần chính: ƒ Hệ thống bơm (Pump system) ƒ Hệ thống tiêm mẫu (Injection system) ƒ Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột) ƒ Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase) ƒ Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi) ƒ Đầu dò khối phổ (Detector) ƒ Hệ thống xử lý dữ liệu 16 Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 1.6.2.1. Hệ thống bơm Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp: - Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi) - Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min - Thể tích chết nhỏ - Trơ với dung môi của pha động - Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau 1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu: a. Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu: - Có tác dụng tiêm mẫu - Tự động tắt khi áp suất cao - Có thể bơm tuần hoàn mẫu b. Cấu tạo và sơ đồ hoạt động của van cao áp: - Vị trí nạp: mẫu được nạp vào ống chứa mẫu Hình 02 - Vị trí tiêm: van cao áp xoay 1 góc 60o và dung môi sẽ đẩy mẫu ở sample loop theo đường ống và đi vào cột (Hình 03) 17 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 1.6.2.3 Buồng cột Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích 1.6.2.4. Cột sắc ký Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích thước cột: Dài (L): 5-30cm, đường kính trong: 2-5mm, kích cỡ hạt: 1.7, 3, 5, 18 10µm. Có 2 loại cột thường dùng trong sắc ký lỏng đó lag cột pha đảo và cột pha thuận. a. Cột sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography - RPLC): Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol (Hình 04). Các chất phân tích có ái lực khác nhau với nhóm chức không phân cực: - Chất không phân cực: phần lớn dùng cột C18 - Chất phân cực: một số dùng cột C18 - Chất phân cực: Đa số dùng cột C8 Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. b. Cột sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC) Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino... (Hình 05) 19 Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. 1.6.2.5. Pha động Là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm, yêu cầu: - Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với MeOH/ACN) - Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh - Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc). 1.6.2.6. Đầu dò khối phổ MS Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường...). Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích). 1.6.2.6.1. Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI) 20 Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử Nguyên tắc của phương pháp ion hóa phun điện là dòng chảy từ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra với tốc độ 1-40ml/phút đi qua 1 ống capillary có đường kính cỡ mm và điện trường cao 1-6kV. Chất lỏng được phun ra dưới dạng hạt rất nhỏ mang điện ở áp suất thường. Các hạt này đi đến điện cực của nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API). Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơi nhanh biến các hạt rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi đưa đến buồng ion hóa. 1.6.2.6.2. Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI) Hình 07. Bộ ion hóa hóa học Mao quản Buồng hóa hơi Áp suất khí quyển Gia nhiệt Không khí khô Bơm chân không Chân không cao Chất lỏng Bộ phân phân tích Điện cực phóng điện Bộ lọc Khí nebulizer 21 Hỗn hợp khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm với 1 dòng ion dương (H2, CH4, H2O...) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các mảnh ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng cao do que Corona tạo ra. Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học. Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ: Vỏ ống dẫn khí Đầu kim dẫn mẫu Vùng phun điện (plasma) Vùng va chạm Bộ phận phân tích Block làm bay hơi bằng gia nhiệt Khí nebulizer Chất phân tích (M) và hơi dung môi Diễn giải vùng phun điện (plasma) Đầu kim dẫn mẫu (hiệu điện thế cao) 22 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC. Chúng làm cho các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm. Do đó chỉ các ion nhất định mới tới được bộ góp, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt tới bộ phận thu góp. Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy, độ chính xác. Đầu dò khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ). MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này. Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu. Nguồn Hiệu điện thế một chiều và xoay chiều Đầu dò Ion không cộng hưởng Ion cộng hưởng 23 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS 1.6.2.7. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng Các hợp chất phân cực, không phân cực, những hợp chất sinh học, dược liệu dễ bị phân hủy ở nhiệt độ sắc ký khí và những hợp chất có thể phản ứng với vật liệu dùng trong GC và cột tách của GC. 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột Có 3 yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tách trong cột đó là: - Tính chất hóa học của cột. - Tính chất của dung môi pha động. - pH của pha động. 1.6.4.1. Tính chất hóa học của cột Cột Silica C18 tách tốt hơn cột Silica C8 nhưng thời gian lưu của C18 dài hơn vì kích thước lỗ xốp của hạt lớn hơn cột C8 do có đầu kỵ nước dài hơn (18C so với 8C) dẫn đến sự tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh trong loại cột này cũng lớn hơn so với C8 (Hình 1010). Ion sơ cấp Ion thứ cấp Bề mặt photon va chạm 24 Đường kính cột càng nhỏ, lượng tiêu tốn dung môi càng ít, nhưng khó chế tạo. Cột càng dài, cỡ hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhưng thời gian chạy càng lâu và áp suất càng phải cao. Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18. 1.6.4.2. Tính chất của dung môi pha động - Độ pH của pha động: pH của pha động cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách giữa các chất. Tuy nhiên tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà ảnh hưởng của pH có thể làm tăng hoặc giảm khả năng tách của cột (Hình 11). Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất - Độ phân cực của dung môi Độ phân cực của dung môi ảnh hưởng mạnh đến quá trình sắc ký (Hình ) 25 Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. 26 Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC Độ phân cực Dung môi Khả năng tan trong nước Không phân cực Phân cực Hexan Iso-octan Petroleum ete Cyclo-hexan Cacbon tetra-hydrochlorit Cloroform Dicloro metan Tetra-hydrofuran Dietyl ete Etyl axetat Axeton Axetonitril Isopropanol Metanol Nước Axít axetic Không Không Không Không Không Không Không Có Không ít Có Có Có Có Có Có 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí: - Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. 27 - Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi cần ít. - Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh, giá thành thấp. Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất. 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số. [A]hc KA= (0.9) [A]n KA : hằng số phân bố [Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ. [An]: nồng độ của chất A trong pha nước. 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu). Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột. 28 Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp. Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu. Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút. Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích. Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút. Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị trường nhập khẩu trên thế giới. 29 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS . - Khảo sát các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp (giới hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặp lại, và so sánh kết quả phân tích trên LC- MS/MS với phương pháp HPLC-UV). - Thu thập và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở 12 vùng thu hoạch NT2MV tại Việt Nam. 2.2. Mô hình thực nghiệm Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dưới đây (Hình 1): Hình 14. Mô hình thực nghiệm 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: 2.3.1.1. Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức. Chọn dung môi chiết Chọn phương pháp chiết Chọn các thông số LC, MS/MS Chọn thành phần pha động, gradient Xây dựng qui trình chạy mẫu Xây dựng qui trình chiết mẫu Xây dựng phương pháp Kiểm tra độ lặp lại Kiểm tra độ thu hồi Tìm giới hạn phát hiện Xác định độ đặc hiệu Phân tích một số mẫu thật 30 2.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C8 kích thước cột 4,6x150mm kích thước hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức. 2.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc. 2.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ . 2.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ. 2.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức. 2.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức. 2.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức. 2.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 2.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 2.3.1.11. Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 2.3.1.12. Ống tiêm nhựa loại 5ml. 2.3.1.13. Giấy lọc. 2.3.1.14. Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,... 2.3.1.15. Hệ thống LC-MS/MS, model Micromass API, hãng Waters – Mỹ 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích 2.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma). Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh. 2.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC), Merck – Đức. 2.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức. 2.3.2.4. Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. 2.3.2.5. Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. Cách thức pha hóa chất, chất chuẩn được thực hiện theo mục 3.7 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: Tiến hành thu thập 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu hoạch trong cả nước, chi tiết theo tại Bảng 02: Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu 1. Nghêu Bến Tre 03 Giao Thủy – Nam Định 20/7; 18/8; 09/11 2. Nghêu Bến Tre 03 Tiền Hải – Thái Bình 20/7; 18/8; 09/11 3. Tu hài 03 Vân Đồn - Quảng Ninh 20/7; 17/8; 09/11 31 TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu 4. Điệp 03 Phan Thiết – Bình Thuận 28/7; 18/8; 10/11 5. Sò anti 03 Tuy Phong – Bình Thuận 28/7; 18/8; 10/11 6. Nghêu Bến Tre 03 Bình Đại – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 7. Nghêu Bến Tre 03 Ba Tri – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 8. Sò huyết 03 Thạnh Phú – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 9. Nghêu Bến Tre 03 Cần Giờ - Hồ Chí Minh 28/7; 18/8; 10/11 10. Nghêu Bến Tre 03 Tân Thành – Tiền Giang 28/7; 18/8; 10/11 11. Sò Lông 03 Bà Lụa – Kiên Giang 20/7; 17/8; 09/11 12. Nghêu lụa 03 Hiệp Thạnh – Trà Vinh 20/7; 17/8; 09/11 Tất cả các mẫu được bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý. 2.5. Xác định các thông số tối ưu: 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau: - Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất. - Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng. 2.5.2. Cột: Để lựa chọn cột sử dụng, chúng tôi tiến hành như sau: sử dụng dụng dịch chuẩn ở nồng độ 5ppm và tiến hành kiểm tra khả năng tách và thời gian lưu. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ thực hiện khảo sát về khả năng tách, thời gian lưu trên cột C8 4,6x150mm 5µm và C18 4,6x150mm 32 5µm. Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài. 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau: - Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN - Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài. 2.5.4. Dung môi chiết: Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi: - Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1 - Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93 - Dung môi 3: MeOH: H2O: 2:1. Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chiết mẫu. Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu. Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm. Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0,45μm vào lọ thủy tinh vial 1,5 ml. Sau khi có kết quả, phương pháp được chọn phải là phương pháp loại đáng kể nhiễu nền có thể gây ảnh hưởng đến pic DA đồng thời độ thu hồi tốt. Nếu cả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa phương pháp đơn giản, giá thành thấp và phù hợp với điều kiện ở thực tế. 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: 33 Thiết lập bảng mẫu với thứ tự sau: - Mẫu chạy thử (pre-test). - 5 mẫu chuẩn sắp xếp từ nhỏ đến lớn. - Mẫu trắng và mẫu kiểm soát. - Các mẫu thử nghiệm. - Mẫu chuẩn Chương trình chạy rửa cột (50% MeOH:50%H2O, 1mL/phút, 50 phút) 2.5.6. Tính toán : Việc tính toán kết quả bằng phần mềm trên hệ thống xử lý dữ liệu – Masslynx 4.0. Dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn, lập đường cong chuẩn tuyến tính dựa trên diện tích pic và nồng độ của các mẫu chuẩn sau đó mẫu được tính theo đường hồi quy y=ax+b (xi = (yi-b)/a) với y là diện tích pic của mẫu còn x là nồng độ. Mẫu trắng, mẫu kiểm soát được dùng để tính toán độ thu hồi của mỗi đợt kiểm và xây dựng giản đồ kiểm soát. Sau khi xác định được các thông số tối ưu, tiến hành xác định khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện của phương pháp, độ lặp lại, độ thu hồi. 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: Để xác định khoảng tuyến tính c