Luận văn Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón. Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí nitrogen. Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A : dung dịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µl vào hệ thống HPLC. Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17] chỉ cần lấy 200 µl huyết thanh trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy. Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH). CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng và xác định giá trị sử dụng của phương pháp phân tích PQ trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau: Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương. Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu. Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu được từ mẫu máu, ly tâm lấy phần huyết tương. 2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 2.2.1 Chất chuẩn Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate của hãng Sigma - Aldrich độ tinh khiết 99,5%; Exp date: 14.Dec.2016. 2.2.2 Hoá chất Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN ....) của hãng Merck. KCl tinh thể, độ tinh khiết: 99,5% của hãng Merck. Acid trichloroacetic tinh khiết 98,5% của hãng Merck. Acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck. Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu của hãng Merck và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá. Dung dịch đệm pha động pH = 2,5 được chuẩn bị bằng cách sau: gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml triethylamine thêm nước xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH của pha động bằng H3PO4 đến các giá trị pH mong muốn. Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion. Pha dung dịch chuẩn gốc PQ: Hòa tan 100 mg chất chuẩn paraquat dichloride (C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,1 - 20 µg/ml trong nước. Trộn các nồng độ dung dịch chuẩn thứ cấp với huyết tương trắng để có nồng độ PQ 0,02 - 10 µg/ml để khảo sát và xác định giá trị sử dụng của phương pháp. 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ Thiết bị Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, gồm bơm trộn dung môi gradient áp suất cao, bộ đuổi khí trực tuyến bằng chân không, buồng ổn nhiệt, thiết bị tiêm mẫu tự động, detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng Diode, máy tính, máy in. Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm). Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001 g. Bể siêu âm. Model: S30/H. Hãng ELMA, Đức. Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00 Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút. Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức. Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức. Máy cất nước hai lần. Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart - Barloworld Scientific, 4 l/h, Anh. Bộ lọc nước siêu sạch. Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco, 115V, 60Hz, Mỹ. Dụng cụ Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml. Pipetman các loại từ 0 - 1000 µl. Bộ lọc dung môi của hãng Agilent, Mỹ. Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy. Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105oC trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat. 2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn Theo như tính chất đã biết của paraquat dichloride là tan tốt trong nước và ít tan trong dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH Tham khảo các tài liệu và so sánh về độ phân cực của nước và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nước để hòa tan PQ vì nước không độc hại, thân thiện với môi trường hơn EtOH, MeOH. 2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết bị phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyết tương như sau: Với 1 ml mẫu huyết tương, thêm dung dịch TCA để loại protein, lắc xoáy và ly tâm với nồng độ dung dịch TCA thay đổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thời gian lắc xoáy: 30 giây, 1 phút, 2 phút. 2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký. Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo. * Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không [3]. Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Dựa trên khảo sát các tài liệu tham khảo và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúng tôi sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên cứu này. * Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp thụ của PQ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD. * Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl. * Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng gồm các hệ pha động sau: - Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Tỷ lệ thể tích 2 kênh tương ứng là 90 : 10. - Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v). Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. - Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc. Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion. * Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần của pha động. Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2,5 đến 4,5. * Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl & polyethylenglycol. * Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu. * Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu của các chất phân tích (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phương pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 0,9 < AS < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhưng đảm bảo phải tách xa nhau. 2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương 2.3.2.1. Tính chọn lọc Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng không có PQ và mẫu huyết tương trắng có PQ. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu. 2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ PQ từ 0,02 - 10 µg/ml. Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 8 nồng độ PQ được them vào mẫu huyết tương trắng lần lượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml. Sau đó xử lý mẫu và tiến hành phân tích. 2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Tiến hành xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 0,01 - 0,1 µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy và xác định LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ. 2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại) - Độ đúng: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 5 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu. - Độ lặp lại: + Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký như phần độ đúng, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ. + Độ lặp lại khác ngày: tiến hành tương tự như trên nhưng làm ở 5 ngày khác nhau. 2.3.2.5. Độ ổn định Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và thời gian bảo quản. - Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml trong huyết tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng 5 giờ, xác định RSDr. - Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên, lấy 1 phần ra xử lý và tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản ở -30oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngày thứ 7, 14 và 21. 2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2015. Chẩn đoán ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn: Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ. Xét nghiệm định tính độc chất nước tiểu tìm thấy PQ. 2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân - Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan. - Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác. Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh. Tiến hành nghiên cứu: * Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá của bác sĩ điều trị): Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lượng PQ trong thuốc trừ cỏ, lượng PQ uống, thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị. Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng. Điều trị lọc máu hấp phụ được áp dụng. Các điều trị khác: than hoạt, ức chế miễn dịch, liệu pháp lipid. Các số liệu này được dùng trong đánh giá hiệu quả điều trị và mức độ nhiễm độc * Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và sau các lần lọc máu hấp phụ: Tiến hành lấy máu bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai ngay vào viện khi được chẩn đoán xác định ngộ độc PQ. Các bệnh nhân lọc máu hấp phụ được lấy máu ngay trước và sau lọc. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tương. Mẫu huyết tương được xử lý và phân tích bằng phương pháp HPLC đã xây dựng. Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần (n=3), tính kết quả trung bình. Phương pháp định lượng là phương pháp đường chuẩn. Kết quả nồng độ PQ trong mẫu (µg/ml) trong dung dịch thử được tính dựa vào đường chuẩn. * Thu thập kết quả điều trị. Tỷ lệ tử vong tại viện, sau 3 tháng: ghi số điện thoại của BN và người nhà, gọi điện thoại xác định tình trạng BN sống/tử vong sau 3 tháng. Các chỉ số nghiên cứu chính: * Tỷ lệ tử vong sau 3 tháng * Nồng độ PQ huyết tương khi vào viện, dùng nồng độ này tính điểm SIPP sửa đổi (severity index of PQ poisoning: chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ) – liên quan tỉ lệ tử vong. SIPP = [nồng độ PQ huyết tương (µg/ml)] × [thời gian từ khi uống đến bắt đầu định lượng (h)] * Hiệu quả lọc PQ của lọc máu hấp phụ (HP) (dựa vào nồng độ PQ huyết tương trước và sau các lần lọc máu hấp phụ) *Xử lý số liệu: bằng phần mềm SPSS for Windows 16.0. Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn, hoặc trung vị và tứ phân vị nếu phân bố không chuẩn, đánh giá giá trị tiên lượng tử vong của nồng độc Paraquat vào viện bằng cách tính diện tích dưới đường ROC, so sánh giá trị nồng độc Paraquat giá trị trước sau điều trị bằng test Wilcoxon. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao 3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục. Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích [4]. Paraquat là chất có tính hấp thụ quang tốt trong vùng UV do đó detector DAD (Diode - Array Detector) rất tốt cho việc định tính và định lượng chất phân tích. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của PQ trong dải bước sóng 210 tới 400 nm trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 với detector DAD. Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của PQ Kết quả trên cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 259 nm. Do đó chúng tôi chọn bước sóng phát hiện chất phân tích đối với PQ là 259 nm. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột Trên thực tế, một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãng chân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này; nếu lượng mẫu bơm vào cột quá lớn dẫn đến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng chân pic. Tuy nhiên, nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số sẽ rất lớn. Hệ thống HPLC Agilent 1200 có trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động do đó chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn thể tích mẫu tiêm vào cột sao cho hiệu quả tách là tốt nhất. Thể tích tiêm mẫu được khảo sát giới hạn trong khoảng 10 µl đến 50 µl. Quá trình khảo sát được thực hiện trong điều kiện cố định như sau: sử dụng pha động là ACN – dung dịch đệm pH 2,5 (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5,0 µg/ml. Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu a: 10 µl, b: 20 µl, c: 30 µl, d: 40 µl, e: 50 µl Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu Thể tích tiêm mẫu (µl) Thời gian lưu (phút) AS 10 11,42 0,72 20 11,77 0,91 30 11,75 0,75 40 11,74 0,77 50 11,76 0,88 Nhận xét thấy thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả phân tích. Nếu lượng mẫu tiêm vào cột nhỏ hơn 30 μl thì pic của PQ sẽ không đối xứng tốt, giá trị diện tích pic của các pic này nhỏ, chiều cao pic thấp không chính xác và dẫn tới kết quả phân tích sai. Còn với thể tích mẫu lớn hơn 30 μl thì pic bị kéo đuôi, điều này được giải thích theo thuyết tốc độ (thuyết Van Deemter), khi lượng mẫu tăng thì số đĩa lý thuyết (N) của cột giảm, độ phân giải giảm theo vì RS µ [10]. Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, với lượng mẫu tiêm vào cột là 30 μl thì cho kết quả tách tốt nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 30 μl cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.3. Khảo sát lựa chọn loại pha động Khảo sát khả năng phân tách PQ trong huyết tương trắng với các hệ pha động chuẩn bị như trong mục 2.3.1.3. Sắc đồ quá trình tách PQ ra khỏi nền mẫu khi sử dụng các hệ khác nhau thu được ở hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5 Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B (ACN và dung dịch đệm pH = 3 tỷ lệ 10:90, v/v). Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C (ACN - dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v). Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN - đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt và chọn lọc đối với PQ trong huyết tương, cho pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý. Do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột C8 và chọn hệ dung môi ACN - Đệm (5:95, v/v) làm pha động. 3.1.4. Khảo sát thành phần pha động Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hưởng tới những vấn đề sau trong phép tách sắc ký: Độ chọn lọc của hệ pha Thời gian lưu trữ của chất tan Hiệu lực cột tách (đại lượng Nef) Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh Độ rộng của pic sắc ký Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thường là nước có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu được dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp với quá trình tách. Căn cứ theo tài liệu số [3] ta có chỉ số độ phân cực của nước là 10,2 đơn vị, của ACN là 5,8 đơn vị, từ đó ta tính được độ phân cực của các hệ dung dịch pha động ACN và đệm ứng với các tỷ lệ thể tích khác nhau từ 3:97, 5:95, 10:90, 15:85 và 20:80. Công thức tính độ phân cực là: PI = %Vi x PIi/ 100 (CT 2) Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng C7H15SO3- để tạo phức liên hợp ion với ion PQ2+, phức chất này là chất không phân cực. Trong khi đó, pha tĩnh được chọn cũng là cột pha đảo kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì quá trình tách mới tối ưu. Kết quả khảo sát được cho trong bảng 3.2. Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ACN : Đệm %v/v a: 20:80; b: 15:85; c: 10:90; d: 5:95; e: 3:97 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic Tỉ lệ pha động (ACN: Đệm, v/v) PI (đơn vị) Thời gian lưu (phút) AS 20 : 80 8,16 -  -  15 : 85 8,67  - - 10 : 90 9,18 8,60 7,36 5 : 95 9,69 11,89 0,87 3 : 97 9,89 14,21 1,93 “-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu. Kết quả cho thấy khi tăng thành phần ACN trong pha động độ phân cực của pha động giảm, thời gian lưu ngắn hơn. Ở tỷ lệ thể tích 15:85 và 20:80, độ phân cực của pha động thấp, làm cho PQ không tách ra khỏi nền mẫu. Ở tỷ lệ 10:90, đã tách được PQ ra khỏi nền mẫu tuy nhiên tín hiệu đo thấp và pic không cân đối. Khi độ phân cực của dung dịch pha động tăng, chất bị giữ trong cột lâu làm cho thời gian lưu tăng dài, pic doãng. Ở tỷ lệ 5:95, pic chất cân đối AS: 0,87, thời gian lưu ngắn hơn, pic tách tốt ra khỏi nền mẫu. Do đó, chúng tôi chọn tỷ lệ thể tích 5:95 là điều kiện tối ưu. 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp là ACN - đệm tỷ lệ 5:95, chúng tôi khảo sát lại pH của pha động. Trong sắc ký lỏng pha đảo RP - HPLC, pH có vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng tới dạng tồn tại của chất phân tích, dạng tồn tại thay đổi thì thời gian lưu trữ chất phân tích trên cột cũng thay đổi. Do đó phải lựa chọn pH cho phù hợp với quá trình tách và sự an toàn của cột tách. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát pH trong khoảng từ 2,5 tới 4,5. Vì PQ có pKa ~ 9 – 9,5 trong nước nên cần duy trì pH < pKa để PQ tồn tại ở dạng ion dương RN+H, tạo liên hợp ion với natri heptanesulfonate. Tiến hành khảo sát tại các pH khác nhau sử dụng pha động là ACN - đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 30 µl. Kết quả khảo sát các giá trị pH được cho trong bảng sau: Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của pH a: pH=4,5; b: pH=4,0; c: pH=3,5; d: pH=3,0; e: pH=2,5 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic pH Thời gian lưu (phút) AS 2,50 11,89 0,870 3,00 12,75 - 3,50 12,36 - 4,00 12,90 0,280 4,50 12,69 0,360 “-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu. Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH pha động ở bảng trên, chúng tôi nhận thấy: Tại giá trị pH = 2,5, pic sắc nét và khá ổn định. Thời gian lưu thấp hơn so với các giá trị pH khác, hệ số đối xứng và độ phân giải tương đối ổn định. Khi pH tăng, các pic bị tách đỉnh dẫn tới pic không cân đối và độ rộng pic lớn, do ion PQ2+ bị chuyển thành dạng PQ(OH)2 (N+ trong phân tử PQ kết hợp với OH-) trong dung dịch pha động, vì vậy làm giảm khả năng tạo cặp ion với C7H15SO3- và khả năng hấp thụ ánh sáng của PQ. Do đó, để các pic tách nhau rõ ràng, tiết kiệm thời gian phân tích, và bảo vệ tuổi thọ của cột, chúng tôi chọn pH=2,5 cho pha động và giữ ổn định cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.6. Khảo sát thành phần dung dịch đệm Sau khi chọn được pH của dung dịch đệm, chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của các chất trong dung dịch đệm. Thành phần của các chất trong dung dịch đệm khác nhau thì khả năng tách chất của pha động là khác nhau. Do đó thành phần của dung dịch đệm ảnh hưởng rất lớn tới quá trình rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Vì vậy, phải tối ưu hóa nồng độ các chất trong dung dịch đệm để sự tách hiệu quả hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát 3 yếu tố chính: natriheptanesulfonate, PEG và KCl. 3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natriheptanesulfonate Trong nghiên cứu này, chất phân tích PQ là một cation, do đó natri heptanesulfonate được sử dụng để tạo cặp ion với chất phân tích PQ. Liên kết này giúp cho chất phân tích được giữ lại trong cột mà không bị rửa giải ngay sau khi được bơm vào cột. Nồng độ của natri heptanesulfonate ảnh hưởng lớn tới hiệu quả tách và thời gian lưu của chất, do đó phải khảo sát và chọn nồng độ tối ưu. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong khoảng 1 tới 1,25 %. Các khảo sát được thực hiện ở điều kiện : sử dụng pha động là ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu là 30 µl. Hình 3.8: Sắc đồ khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5 a: 1,00 mg/m; b: 1,05 mg/ml; c: 1,10 mg/ml; d: 1,15 mg/ml; e: 1,20 mg/ml Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ natriheptanesulfonate đến thời gian lưu, hệ số đối xứng pic Nồng độ (mg/ml) Thời gian lưu (phút) AS 1,00 10,74 0,67 1,05 10,86 1,01 1,10 11,89 0,87 1,20 12,06 2,72 1,25 11,86 0,89 Khi tăng nồng độ của natri heptanesulfonate thời gian lưu của PQ giảm tuy nhiên sự thay đổi này là không dáng kể. Khi nồng độ thay đổi tử 1,00 mg/ml tới 1,20 mg/ml, thời gian chênh nhau khoảng 1 phút lần lượt từ 10,74 phút đến 12,06 phút. Trong khi đó, hình dạng của các pic chất thay đổi rất lớn khi thay đổi khoảng nhỏ nồng độ của natri heptanesulfonate. Khi nồng độ ion C7H15SO3- thấp, các ion PQ2+ không được tạo cặp liên hợp ion hoàn toàn làm cho khả năng rửa giải PQ của phương pháp kém, tín hiệu quang thấp, các pic chất bị doãng và không cân đối như hình 3.8 a và b. Nhưng khi nồng độ của ion âm quá cao, làm cho phức hợp mang điện tích âm nên hiệu quả rửa giải thấp, pic chẻ và doãng chân như hình 3.8 d, e. Tại nồng độ 1,10 mg/ml hình dạng pic là cân đối sắc nét nhất, độ phân giải của pic tương đối tốt, thời gian lưu của PQ không quá dài (hình 3.8 c). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dung dich đệm 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, pH = 2,5 cho các bước tiếp theo. 3.1.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ KCl Sau khi chọn được nồng độ natri heptanesulfonate phù hợp 1,1 mg/ml, chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của KCl trong pha động. Chương trình rửa giải đẳng dòng đã được sử dụng và pha động ACN - đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng 0,5 ml/phút, nồng độ 5 µg/ml PQ, thể tích tiêm mẫu là 30 μl. Dung dịch đệm bao gồm: 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, nồng độ KCl trong khoảng từ 1 mg/ml tới 3 mg/ml, 0,2%(v/v) PEG, 0,05% triethylamine và 20%(v/v) MeOH. Hình 3.9: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của KCl trong pha động. a: 1,0 mg/ml; b: 1,5 mg/ml; c: 2,0 mg/ml; d: 2,5 mg/ml; e: 3,0 mg/ml Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic. Nồng độ (mg/ml) Thời gian lưu (phút) AS 1,00 13,54 1,19 1,50 13,21 3,23 2,00 11,88 0,87 2,50 9,76 0,8 3,00 9,16 0,67 Từ kết quả ở bảng 3.5 và các sắc đồ trong hình 3.9, nhận thấy: Khi tăng nồng độ của KCl thì thời gian lưu của PQ giảm. KCl được dùng để tạo môi trường điện ly cho dung dịch đệm do đó khi tăng nồng độ chất điện ly này làm các chất mang điện dễ hòa tan trong dung dịch pha động hơn làm cho chất phân tích bị rửa giải nhanh hơn . Tại nồng độ 1,00; 1,50; 2,50 mg/ml các pic chất xấu và không cân đối. Tại nồng độ 2,0 mg/ml hình dạng các pic tương đối cân xứng, độ phân giải các pic chất tốt. Tuy nhiên, tại nồng độ 3,00 mg/ml đường nền xấu và không ổn định. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ KCl 2,00 mg/ml cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ PEG Chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của PEG trong dung dịch đệm. Nồng độ của PEG được chọn để khảo sát là 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,3 % v/v. Các điều kiện chạy sắc ký bao gồm dung dịch pha động là ACN và dung dịch đệm với tỉ lệ tương ứng là 5 : 95 (v/v) với tốc độ dòng pha động là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 30 µl. Dung dịch đệm gồm 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, 2 mg/ml KCl, 20% v/v MeOH và các nồng độ khác nhau của PEG, các dung dịch được điều chỉnh tới pH = 2,50 bằng acid phosphoric. Hình 3.10: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của PEG trong pha động. a: 0,10 %v/v, b: 0,15 %v/v; c: 0,20% v/v; d: 0,25% v/v; e: 0,30 % v/v Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic. Nồng độ (%