Luận văn Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa (xanthium strumarium l.)

hái Nguyên Mặc dù các axit béo mạch nhánh có mặt nhiều trong tự nhiên, nhưng chúng thường tồn tại như những thành phần phụ và hiếm khi chúng có số lượng đáng kể trong các axit béo tổng. Hầu hết kiểu nhánh chỉ là một nhóm metyl. Các axit với một nhóm metyl ở các vị trí hai hoặc ba [n-2 (izo axit), n- 3 (anteiso axit)], hoặc có thể ở vị trí khác. Các axit có nhiều hơn một nhóm metyl thường gắn với các nguyên tử cacbon chẵn. Đây là sự giải thích về mặt sinh tổng hợp cho hầu hết các cấu trúc chung của các axit béo mạch nhánh. Các axit béo có mạch vòng là các axit béo tồn tại trong tự nhiên mà trong phân tử có chứa cacbon mạch vòng gồm 3 nguyên tử cacbon (cyclo propan), chúng thường có mặt trong dầu hạt họ thông, tùng. Các axit béo cyclopropanyl cũng thường xuất hiện nhiều trong phốtpholipit màng vi khuẩn, chúng cũng thường đi kèm axit cyclopropenyl có trong thành phần axit béo của dầu các hạt thực vật. Trong tự nhiên các axit béo với nhóm chức khác nhóm cacboxyl và một hoặc nhiều dạng khác của axit béo không no thì thường gặp, tuy nhiên phổ biến hơn cả là dạng hydroxy axit và eproxy axit. Các epoxy axit và furanoic axit là các axit béo có chứa vòng epoxy hoặc vòng furan trong phân tử, chúng có mặt trong thành phần một số dầu hạt thực vật, thường tồn tại ở dạng triaxylglyxerol và trong cutin mà ở đó chúng tồn tại dưới dạng polyme của các hydroxy axit. Bảng 1.1. Các dạng axít béo no thường gặp trong tự nhiên [7] Số nguyên tử C Tên hệ thống khoa học Tên thông dụng Điểm chảy Mpt. ( 0 C) Phân bố trong tự nhiên 2 n-Ethanoic Acetic 16,7 Phổ biến dạng ancol acetate có 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nhiều trong thực vật và một vài triglycerit thực vật. Thường they trong dạ cỏ động vật dưới dạng muối 3 n-Propanoic Propionic -22.0 Thường thấy trong dạ cỏ động vật 4 n-Butanoic Butyric -7,9 Thường gặp trong dạ cỏ và sữa béo của động vật nhai lại 8 n-Octanoic Caprylic 16,7 Cấu phần thứ yếu trong mỡ động vật thực vật 10 n-Decanoic Capric 31,6 Cấu phần thứ yếu 12 n-Dodecanoic Lauric 44,2 Phân bố rải rác, là cấu phần quan trọng trong thành phần dầu 1 vài hạt thực vật, sinh vật biển 14 n-Tetradecanoic Myristic 54,1 là cấu phần quan trọng của các đối tượng trong thiên nhiên 16 n-Hexadecanoic Palmitic 62,7 Là cấu phần quan trọng hay gặp trong tự nhiên và là một trong những axít béo phổ biến nhất của quá trình sinh tổng hợp chất béo trong thực vật, động vật biển. 18 n-Octadecanoic Stearic 69,9 Là cấu phần quan trọng trong dầu béo thiên nhiên 20 n-Eicosanoic Arachidic 75,4 Là cấu tử thứ yếu đôi khi đóng vai trò rất quan trọng ở một vài 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên đối tượng như sinh vật biển 22 n-Docosanoic Behenic 80,0 Tham gia vào thành phần triglycerit của dầu một số hạt thực vật 24 n-Tetracosanoic Lignoceric 84,2 Khá phổ biến ở triglycerit của dầu hạt các loài thực vật biển 26 n-Hexacosanoic Cerotic 57,7 Phổ biến là cấu của dầu hạt thực vật và nhựa sáp của côn trùng, sâu bọ 28 n-Octacosanoic Montanic 90,9 Cấu phần quan trọng của một vài loài sáp thực vật, sinh vật biển Bảng 1.2: Các axít béo không no thường gặp trong tự nhiên [7] Số ng tử C Tên hệ thống khoa học Tên thông dụng Điểm chảy ( 0 C) Phân bố trong tự nhiên 16 Axít béo 1 nối đôi tran-3- hexadecenoic cis-5- hexadecenoic cis-7- hexadecenoic -Có trong lá cây thực vật, đặc biệt là cấu phần chính của phosphatidylglycerol -Có trong thực vật, khuẩn que -Có trong dong tảo, thực vật bậc cao, vi khuẩn 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên cis-9- hexadecenoic Palmitoleic -Phổ biến trong động vật, thực vật, tổ chức vi sinh vật, là cấu phần chủ yếu của một vài loài hạt thực vật 18 cis-11- hexadecenoic cis-9-octadecenoic cis-11-ctadecenoic Palmivacceni c Oleic Vaccenic 10,5 13,0 -Có trong dầu các hạt thực vật. -Phổ biến hầu hết trong các động vật, thực vật và tổ chức vi sinh vật -Có trong E-coli và các vi khuẩn khác 16 18 Axít béo 2 nối đôi cis,cis-7,10- hexadecadienoic cis,cis-9,12- hexadecadienoic cis,cis-6-9- octadecenoic cis,cis-9-12- octadecenoic Linoleic -5,0 Phổ biến trong thực vật, rong, tảo… -Cấu tử thứ yếu Cấu phần thứ yếu ở động vật sống. -Cấu phần chủ yếu trong lipit thực vật, ở động vật và con người, nó chỉ bổ xung vào qua con đường thức ăn rau quả hoặc dầu mỡ thực vật và sinh vật biển Axít béo 3 nối đôi 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 18 16 16 20 (Phân cách đều đặn bởi một nhóm metylen) all-cis-7,10,13- hexadecatrienoic all-cis-6,9,12- octadecatrienoic all-cis-9,12,15- hexadecatrionic Axít béo 3 nối đôi (nối đôi liên hợp) Cis-9,trans- 11,trans-13- octadecatrienoic Axít béo 4 nối đôi all-cis-4,7,10,13- hexadecatrionic all-cis-5,8,11,14- eicosatetraenoic ó-Linoleic ỏ-Linolenic Elecostearic Arachidonic -11 44 -49,5 -Có ở thực vật bậc cao và rong tảo biển -Là cấu phần thứ yếu trong động vật và một vài loài rong biển.Là cấu thành rất quan trọng của một vài loài thực vật -Phổ biến ở thực vật bậc cao và rong tảo biển, là cấu phần đặc biệt của galatosyl diglycerit. -Có trong dầu hạt một số loài cây đặc biệt dầu trẩu -Là cấu phần quan trọng của lipit động vật và một vài rong tảo biển. Đặc biệt là thành phần chủ yếu của phospholipit Axit béo 5 nối đôi 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 22 All-cis- 7,10,13,16,19- Docosapentaenoic Axít béo 6 nối đôi All-cis- 4,7,10,13,16,19- docosahexanenoic clupanodonic DHA Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 CHƢƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu hái vào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên. Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc). Có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5]. Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-600 C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10% thu được 8.8kg mẫu khô. Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ khoảng 500 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhau như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Riêng cặn thô n-Hexan được metyl hoá (este hoá) bằng MeOH xúc tác HCl. Đun hồi lưu khoảng 8 tiếng, sau đó trung hoà bằng NaHCO3 cho đến pH = 7, chiết 3 lần bằng n-Hexan. Dịch chiết tổng cô khô và được đưa đi phân tích bằng thiết bị GC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Hình 2.1. Cây Ké đầu ngựa Hình 2.2. Quả Ké đầu ngựa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của quả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp : - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v...Sau đó sẽ tiến hành ghi các các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC- Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã được sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (2:1) Hệ A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2. n-Hexan-etylaxetat (5:1) Hệ B 3. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ C 4. Cloroform-metanol (9:1) Hệ D 5. Cloroform-metanol (5:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun bằng thuốc thử Vanilin 1% trong hỗn hợp metanol + H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C hoặc đưa vào buồng I2 để xác định thành phần cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm). Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là: - Cân phân tích. - Máy cất quay chân không. - Bộ chiết Shoxlet. - Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet - Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký Hoá chất:  Dung dịch axit sunfuric (H2SO4).  Dung dịch axit chlohiđric (HCl).  Dung dịch axit axetic (CH3COOH).  Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4).  Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit.  Dung dịch axit HCl 0,5N trong nước  Dung dịch KOH 0,5N trong cồn  Dung dịch KOH 0,1N trong nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22  Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950 (2:1 theo thể tích) 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L. Phổ FAB-MS(NaCH3COO) ghi trên máy LC- MS-Trap-00127. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) hoặc Bruker 200MHz, 400MHz AVANCE (Bruker) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3 , DMSO-d6 hoặc C5H5N-d5. - Phổ GC-MS ghi trên máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BFX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure cant: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min. Chương trình chạy nhiệt độ: 850(0/min.) -1500(10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). 2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 2.3.1 Các dịch chiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là: KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1). Kí hiệu: - KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan - KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc - KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu n-hexan EtOAc Mẫu khô nghiền nhỏ 1. n-hexan (KĐN.H) 2. Etylaxetat (KĐN.E) 3. Dịch cái 1.Etanol 2.Cặn + H2O 4. Metanol (KĐN.M) 1.Cô khô 2. Metanol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) Bộ phận Khối lượng mẫu (g) Cặn chiết n-hexan (g) EtOAc (g) MeOH (g) KĐN.H KĐN.E KĐN.M Quả 1600 62,7 14,8 93,2 2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity). * Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa), E. coli (Ec) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa). - Nấm men : Candida albicans (Ca). Chất tham khảo: Amphotericin B Amoxicilin *Phương pháp thử : Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml; 8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml; 4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết. Bước 2: Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành thử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370 sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trên máy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50. Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả Ké đầu ngựa STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Ec. Escherichia coli IC50 g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50 g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50 g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50 g/ml Ca: Candida albicans IC50 g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Nhận xét : Các mẫu thử không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên ở nồng độ < 256 g/ml. 2.3.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 2.3.3.1. Các ancaloit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân loại, thêm 5ml H2SO4 5%, khuấy đều lọc qua giấy lọc, sau đó lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit này. Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.3.3.2. Các sterol Lấy 0,01gam cặn chiết của các phân đoạn cho thêm 2ml NaOH 10% đun trên bếp cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn vào 2ml Clorofoc, sau đó thêm một giọt thuốc thử Liebermann - Burchard (hỗn hợp 1ml anhyđric axetic+ 1ml cloroform để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Nếu thấy giữa hai lớp chất xuất hiện các màu xanh nhạt (có thể có màu lục, cam, hồng hoặc đỏ) bền vững trong một thời gian là dương tính. 2.3.3.3. Các flavonoit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân đoạn, thêm 10ml Metanol , đun nóng cho tan hết rồi lọc qua giấy lọc . Lấy 2ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc. Đun trong bình cách thuỷ vài phút, quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là dương tính với các flavonoit. 2.3.3.4. Các saponin. Chuẩn bị các dung dịch thử như 2.3.3.3. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm cao 25cm, rồi thêm 25ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền của bọt (nếu bọt cao quá 3 - 4cm và bền trên 15 phút là có dấu hiệu dương tính). Dung dịch không tạo bọt là phản ứng âm tính. 2.3.3.5. Các Cumarin Dung dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.3.3. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội rồi mỗi ống lại cho thêm 5ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống nghiệm có kiềm trong hơn ống không có kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đặm đặc sẽ làm cho dung dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo kết tủa là dương tính. 2.3.3.6. Các tanin. Lấy 0,01gam chiết phẩm, thêm 10ml nước cất, khuấy đều, nhỏ 2 đến 3 giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh lục hoặc đen là dương tính. 2.3.3.7. Các glucozit trợ tim Cần thực hiện 02 phản ứng Phản ứng Kellere – Kaliani: Thuốc thử gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đậm đặc + 1mlFeCl3 5% Cách làm : Lấy 0,01 gam cặn chiết các phân đoạn cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ông nghiệm rồi cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ hay nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. Nếu không thấy xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim vì các glucozit tim luôn luôn có mặt các desoxysacarit. Phản ứng Legal : Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dịch thử , thêm vào 1 giọt dung dịch prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu thấy xuất hiện màu đỏ là dương tính với vòng butenolid. Bảng 2.3. Phát hiện định tính các nhóm chất STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + + 3 Flavonoit Xianidin - - - 4 Saponin Tạo bọt - + + 5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chiết n - hexan Chiết Etylaxetat Cất loại dung môi Cất loại dung môi GC - MS Sắc ký cột Silicagel Sắc ký cột Silicagel 6 Tanin FeCl3 5% - - + 7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - - 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L. Metyl hoá Dịch chiết n- hexan Dịch chiết Etylaxetat Dầu béo Cặn chiết Etylaxetat Xác định hàm lượng và TP axit béo Căn chiết n- hexan Chiết Shoxlet 1. n - hexan 2. Etylaxetat KĐN.H8 KĐN.E33 Quả Ké đầu ngựa sấy khô, nghiền nhỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.4.1. Phân tích thành phần các axít béo trong dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa trên GC. Hàm lượng lipit tổng: % (so với trọng lượng mẫu tươi) Thành phần axit béo được xác định dưới dạng metyl este trên sắc ký khí GC theo phương pháp tiêu chuẩn ISO/FDIS 5509:1998, LB Đức. Trong thực nhiệm 10mg dầu béo được hoà tan với 1ml n-Hexan lắc kĩ trong lọ nhỏ, nút kín. Bổ xung 25ml dung dịch CH3ONa trong metanol (2mol/l) và lắc kĩ trong 1 phút Bổ xung 1ml nước cất vào, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Hút lớp sáp không phản ứng ở dưới loại đi. Bổ xung 100 ml HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Loại bỏ kiệt lớp bẩn dưới đáy, lớp dung môi trên được làm khan bằng Na2SO4 và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Chuyển mẫu đã metyl hoá sang ống mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc kí khí . * Điều kiện phân tích GC mẫu methyl este axit béo: Máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BPX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure const: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min Chương trình nhiệt độ: 850 (0/min) -1500 (10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). Bảng 2.4. Kết quả thành phần axit béo 88 x100% = 4,4% 2000 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 (Phổ và điều kiện phân tích máy GC kèm theo) TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu(R1) Hàm lƣợng (%) 1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03 2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35 3 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28 4 C18:1(n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 5 C18:2(n-6) Axit 9,12-Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 6 C18:3(n-6) Axit 6,9,12-Linolenic Linolenic 28.39 38.60 7 C19:1(n-9) Axit 10-nonadecaenoic - 28.44 5.24 8 C22:5(n-3) Axit 5,8,11,14,17- Docosapentaenoic DPA 53.60 0.24 9 others 0.84 Tổng các axit béo no 4.2 Tổng các axit béo không no 94.96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-Hexan; Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột. 2.4.2.1.β – Sitosterol (KĐN.H8) Lấy 62,7g cặn chiết n- hexan đem tách trên cột có đường kính 1,5 cm dài 45 cm, với chất hấp phụ là silicagel khối lượng 100g, có kích thước hạt 60m – 100 m, dung môi rửa giải là n – hexan: etylaxetat với tỷ lệ etylaxetat tăng dần từ 0% - 100%. Các phân đoạn thu được từ cột được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là n – hexan: etylaxetat (8: 1), hiện màu bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 10%. Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất loại dung môi thu được 8 phân đoạn với nhiều cấu tử khác nhau. Các phân đoạn từ 1 đến 6 và phân đoạn 7 đều là hỗn hợp, riêng phân đoạn 8 (rửa giải cột bằng hỗn hợp n – hexan: etylaxetat (20: 1)) có Rf C là 32, cất loại dung môi thu khối chất rắn vô định hình màu vàng nhạt, kết tinh lại trong axeton thu được 0,9870g những tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 138-1400C. KĐN.H 62,7g Silicagel n-Hexan:EtOAc (20:1) KĐN.H8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Phổ FT-IR (KBr): ớmax(cm -1): 3426 (rộng, mạnh); 2983; 2932; 2868; 1651 (yếu); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (200MHz, CDCl3,  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C -NMR (50MHz, CDCl3),  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33). Lấy 14,8g cặn chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa đem tách trên cột silicagel với khối lượng 70g. Cột có đường kính 2,5 cm, dài 45 cm. Rửa giải cột bằng hỗn hợp dung môi Cloroform: metanol với tỷ lệ metanol tăng dần từ 0 – 100%. hệ dung môi chạy bản mỏng là Cloroform: metanol (5:1). Hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4 10%, thu được tất cả 33 phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa Phân đoạn 33 (rửa giải cột bằng cloroform: metanol (95:5)), sau khi cất đuổi dung môi và kết tinh lại trong etylaxetat/metanol, rửa lại bằng axeton thu được 0,007 g khối chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 273 - 2750C, Rf E=35 Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz,): (ppm) 0,71 (3H, s, Me-18); 0,77 (3H, s, Me-19); 5,36 (1H, H-6); Phổ 13C – NMR (125 MHz, DMSO – d6); (ppm): 140,41 (s, C-5) ; 121,12 (d, C-6); 100,76 (d, C-1’); 76,89 (d, C-3’); 76,73(d, C - 5’); 76,69 (d - C3); 73,42 (d, C - 2’); 70,01 (d, C- 4’); 61,06 (t, C - 6’); 56,13 (d, C - 14); 55,39 (d, C-17); 50, 53 ( d, C-9); 49, 56 (d, C- 24); 45, 11 (s, C – 13); 40, 92 (t, C – 4); 39, 76 (t, C- 12); 36, 78 (t, C – 1); 35, 43 (s, C - 10); 33, 31 (d, C- 20); 31, 37 (t, C- 22); 31, 32 (d, C- 8); KĐN.E 14,8g KĐN.E33 Silicagel Clorofom:metanol (95:5) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên