Luận văn Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (cratoxylum prunifolium kurtz)

đoạn và kết tinh lại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những tính chất vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H- NMR, phổ 13 C- NMR, tuỳ theo từng loại chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển SKLM: 1. n-Hexan - etylaxetat 90:10 Hệ A 2. n-Hexan - etylaxetat 95:10 Hệ B 3. Clorofom - metanol 90:10 Hệ C 4. Clorofom - metanol 50:10 Hệ D 5. Clorofom - metanol 20:10 Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 , sau đó sấy ở nhiệt độ trên 100 0 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức: 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy Eletronthermal IA - 9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410. - Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec. - Phổ khối ghi trên máy MS- Engine - 5989- HP ion hoá bằng va chạm eletron (LC- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/ WILLEY 250L. - Phổ 1 H- NMR và 13 C- NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, MeOD. 2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) 2.3.1. Các dịch chiết Lá cây đỏ ngọn đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol 90 0 ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi clorofom, etylaxetat, n-butanol, cuối cùng đuổi hết nước và hoà tan bằng metanol. Các dịch chiết trên được làm khô bằng Na2SO4 lọc và cất dung môi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 0 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Rf = Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Như vậy từ lá cây đỏ ngọn đã thu nhận được 04 phân đoạn cặn là: cặn trong clorofom (ĐC), cặn trong etylaxetat (ĐE), cặn trong butanol (ĐB) và cặn trong metanol (ĐM). Sơ đồ 2.1 1. Etanol 2. Cặn trong nước CHCl3 EtOAc BuOH MeOH Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) Khối lượng mẫu lá (gam) Cặn chiết Clorofom Etylaxetat n-Butanol Metanol 787,4 52,264 34,654 40,411 26,604 100% 6,63% 4,40% 5,13% 3,38% MẪU KHÔ Cặn CHCl3 (ĐC) Cặn BuOH (ĐB) Cặn EtOAc (ĐE) Cặn MeOH (ĐM) ĐC1 ĐE1 ĐC2 ĐC3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong hoạt tính sinh lí cao trong thực vật [3] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả được chỉ ra ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn Stt Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả 1 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++ 2 Glicozttim Kelle-Kiliani Vàng nâu - 3 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6]) 1% Xanh thẫm +++ 5 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++ 6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++ 7 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam - 8 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ Ghi chú: Dấu (+) là có phản ứng dương tính, (++) là có phản ứng tính rất rõ, (-) là không có phản ứng. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:  Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli.  Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu.  Vi khuẩn: Salmonella typhi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chúng tôi còn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết thô được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) Dịch chiết Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch(mm) Staphylococcus auresu Escherichia coli Salmonella typhi Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Cặn tổng (H2O) 30 + 26 + 27 + Cặn EtOAc 29 + 17 + 18 + Chú ý: Dấu (+) là phản ứng có hoạt tính. 2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn Từ 787,4g lá Cratoxylum prunifolium khô chiết nhiều lần bằng etanol 90 0 đến khi dịch chiết trong suốt không màu, loại bỏ bớt dung môi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 50 0 C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng xiro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với c lorofom đến khi thu được tất cả các chất có thể tan được trong CHCl3 đều được lấy ra hết, cô cạn dung dịch CHCl3 ở nhiệt độ thấp thu đuợc 52,264g chất (kí hiệu các chất ĐC). Phần cặn không tan trong CHCl3 được lắc nhiều lần với EtOAc cho đến khi dịch chiết EtOAc hoàn toàn không màu và trong suốt, cô cạn dịch EtOAc trong máy cất quay thu được 34,654g chất tổng số (kí hiệu là các chất ĐE). Phần không tan được trong EtOAc, được lắc với n-butanol sau đó cũng cô cạn trong điều kiện áp suất thấp được 40,410g chất (kí hiệu là các chất ĐB). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên cho tan trong MeOH thu đựoc 32,346g chất (kí hiệu là các chất ĐM). 2.4.1. Dịch chiết clorofom Từ 11g cặn từ dịch clorofom của lá đỏ ngọn kí hiệu (ĐC) được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan - c lorofom với các tỷ lệ tăng dần clorofom từ 0% đến 100% kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3. 2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) Rửa giải với các hệ dung môi n- hexan-clorofom (50:1), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi B và phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong dung môi trên thu được 21mg chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 278-280 0 C và cho các đặc trưng của một tritecpen. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 1720 (C=O); 1500 (C=C); 3050 (CH3); 2940 (CH). Phổ LC- MS, m/z (%) 424 [M + ]; 408 [M-O] + . PHổ 1 H- NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm) 0,762ppm (3H, s, CH3); 0,84ppm (3H, s, CH3); 0,885ppm (3H, s, CH3); 0,996ppm (3H, s, CH3); 1,011ppm (3H, s, CH3); 1,02ppm (3H, s, CH3); 1,07ppm (3H, s, CH3) 5,48ppm (1H, dd, 3,21 và 8,17Hz). Phổ 13 C - NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 38,35 (Cl); 33,08 (C2); 217,3 (C3); 47,56 (C4); 55,77 (C5); 19,91 (C6); 33,57 (C7); 38,87 (C8); 48,80 (C9); 33,57 (C10); 17,44 (C11); 36,67 (C12); 37,74 (C13); 157,59 (C14); 117,19 (C15); 34,12 (C16); 35,57 (C17); 48,70 (C18); 40,64 (C19); 28,79 (C20); 35,11 (C21); 37,69 (C22); 29,56 (C23); 21,57 (C24); 14,79 (C25); 25,56 (C26); 29,92 (C27); 26,12 (C28); 33,39 (C29); 21,47 (C30). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (50:5), sau khi cất loại dung môi cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi A, phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 29mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi, có nhiệt độ nóng chảy 152-155 0 C, Rf  100 =61. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3429,2 (OH); 2864,7 (C-H); 1651 (C=C). Phổ EI- MS; m/z (%): 412 [M + ] (7); 300 (7); 255 (11); 231 (4); 213 (8); 173 (7); 145 (20); 133 (20); 83 (49,3). Phổ 1 H- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 5,33 (1H, dd, j = 5Hz và 2H, H6); 515 (1H, dd, j22,23 = 15, Hz, j22,20= 5Hz, H-22); 5,01 (1H, dd, j23,22 = 15Hz, j23,24 = 5Hz, H-23). Phổ 13 C- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 36,4 (t, C1); 29,67 (t, C2); 71,8 (d, C3); 42,3 (t, C1); 139,2 (s, C5); 121,4 (d, C6); 37,3 (t, C7); 31,85 (d, C8); 51,15 (d, C9); 36,12 (s, C10); 24,35 (t, C11); 42,18 (t, C12); 31,4 (s, C13); 56,83 (d, C14); 25,38 (t, C15); 31,6 (t, C16); 55,9 (d, C17); 12,01 (q, C18); 18,95 (q, C19); 40,47 (d, C20); 21,03 (q, C21); 138,4 (d, C22); 129,2 (d, C23); 50,01 (d, C24); 33,9 (t, C25); 21,19 (q, C26); 19,79 (d, C27); 28,89 (q, C28); 12,22 (q, C29). 2.4.1.3. β- Sitosterol Tiếp tục rửa giải trên cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B, phát hiện nó bằng vanillin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại thu được 27mg chất rắn, tinh thể hình kim, nóng chảy 140- 141 0 C, Rf .100 = 71. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3450 vân rộng (H32, C3); 3010- 1650 (liên kết đôi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Phổ EI- MS; m/z (%): 414 [M + ] (20); 413 [M-H] + (41); 398 (28); 397 (100); 395 (32); 383 (11); 361 (11); 257 (3); 255 (6,3); 151 (5,6); 139 (11). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,81 (3H, d, j, 7Hz, CH3-26); 0,88 (3H, d, j, 7Hz, CH3-27); 0,83 (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 (3H, d, j, 10Hz, CH3-21); 3,52 (1H, m, H- 3); 5,42 (1H, d, j, 5Hz, H-6). Phổ 13 C- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 141,1 (s, C5); 121,8 (d, C6); 71,8 (d, C3); 56,8 (d, C14); 56,1 (d, C17); 50,2 (d, C9); 45,7 (d, C24); 42,5 (s, C13); 42,4 (t, C4); 39,8 (t, C12); 37,3 (t, C1); 36,5 (s, C10); 36,2 (d, C20); 33,9 (d, C8); 31,9 (t, C7); 31,7 (t, C2); 29,2 (d, C25); 28,3 (t, C16); 26,2 (t, C23); 24,2 (t, C15); 21,1 (t, C11); 19,8 (q, C26); 19,4 (q, C19); 19,1 (q, C27); 18,8 (q, C21); 11,9 (q, C29); 11,9 (q, C18); 23,2 (t, C28). 2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) Từ 15g cặn chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn (ký hiệu ĐE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi clorofom- metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, metanol 0% -100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu đựơc chất (ĐE1). * Axit gallic (ĐE1) Rửa giải trên cột bằng hệ dung môi clorofom- metanol (90:10), sau khi kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi C, cất loại dung môi, thu được cặn thô, kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 70mg chất rắn màu vàng, tinh thể hình kim, có tn/c khoảng 248- 258 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 1700 (C=O); 3100 (OH) rất tù. Phổ 1 H-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 7,092 (2H, C2 và C6). PHổ 13 C-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 121,960 (C1); 139,559 (C4); 110,349 (C2, C6); 146,345 (C3, C5); 170,364 (C7). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chương 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo. Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật: Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo. Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước. Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Cratoxylum prunifolium) được thực hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1). Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết. Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định nêu trong bảng (2.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn có chứa các axit hữu cơ, streroit, triterpenoit. Ở dịch chiết bằng etylaxetat của lá cây đỏ ngọn có chứa các hợp chất polyphenol, các hợp chất flavonoit, cũng ở phần dịch chiết này đã tách được axit gallic và dẫn xuất của nó. Trong dịch chiết n-butanol có chứa các tanin, các đường khử. Không phát hiện thấy có ancaloit, các xianua trong các dịch chiết của lá đỏ ngọn. Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 2.2. 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây đỏ ngọn Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng. Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây đỏ ngọn được thực hiện như trong sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một tritecpen và hai steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được axit gallic và hỗn hợp các xanthone với flavonoit. 3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) Chất ĐC-1 là chất rắn tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng chảy ở 278-280 0 C nó được tách từ phần cặn chiết clorofom. Bằng sắc kí cột Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 silicagen với hệ dung môi n-hexan:clorofom thu được chất ĐC-1, chất này cho các phản ứng định tính của terpenoit. Khối lượng phân tử của chất ĐC-1 được xác định bằng phổ khối LC- MS cho biết khối lượng phân tử của [M + ] m/z bằng 424,2 tương ứng với khối lượng phân tử bằng 424 u và tương ứng với công thức phân tử C30H48O. Trong phổ LC-MS còn xuất hiện pic m/z 408,2 điều này tương ứng với mảnh [M-O] + với m/z bằng 408 Phổ FT-IR: cho thấy các vân hấp thụ của nhóm xeton (C=O) ở νmax = 1720cm -1 , liên kết đôi (C=C) ở νmax = 1500cm -1 , các nhóm CH3 ở νmax = 3050cm -1 và các nhóm CH ở νmax = 2940cm -1 , không phát hiện thấy các vân hấp thụ của nhóm OH. Điều này có thể khẳng định được hợp chất ĐC-1 không có chức rượu mà là có chức xeton. Phổ 1 H-NMR và phổ DEPT: cho biết hợp chất ĐC-1 có tín hiệu của 8 nhóm CH3 đều ở dạng singlet (xem hình 3.2 và 3.4) có các độ chuyển dịch hoá học như sau: ở độ chuyển dịch δ = 0,762ppm (3H, s, CH3); δ = 0,841ppm (3H, s, CH3); δ = 0,847ppm (3H, s, CH3); δ = 0,885ppm (3H, s, CH3); δ = 0,996ppm (3H, s, CH3); δ = 1,011ppm (3H, s, CH3); δ = 1,021ppm (3H, s, CH3); δ = 1,07ppm (3H, s, CH3). Độ dịch chuyển hoá học ở δ = 5,48ppm (1H, d, J = 3,21 và 8,17Hz) là của proton liên kết tại cacbon ở liên kết đôi (nhóm = CH tại C15). Phổ 13 C-NMR: nhận thấy nguyên tử cacbon ở trạng thái lai hoá sp 2 thuộc nhóm =CH có độ chuyển dịch hoá học δ = 117,19ppm. Nguyên tử cacbon bậc 4 cũng ở trạng thái lai hoá sp 2 tham gia vào liên kết đôi với nguyên tử này có độ chuyển dịch hoá học ở δ = 157,59ppm. Phổ 13 C-NMR còn cho một tín hiệu ở trường rất yếu tương ứng với độ chuyển dịch hoá học δ = 217,43ppm đặc trưng cho cacbon trong nhóm cacbonyl tại vị trí C-3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Như vậy, phổ NMR hoàn toàn phù hợp với phổ FT-IR không thấy có vân đặc trưng của nhóm OH mà lại thấy xuất hiện vân đặc trưng của C=O. Các nguyên tử H đối với nhóm C=O thấy chỉ có 2H với δ = 2,50ppm (2H, dd, J = 7,1 và 11Hz), còn có 2 proton ở vị trí  của nhóm =CH (tại C16) có độ chuyển dịch hoá học δ = 2,27ppm (2H, dd, J = 3,3 và 4,08 và 6,39). Trên cơ sở phân tích các tính chất hoá học, nhất là phân tích các thông tin có được từ phổ LC- MS, FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR, phổ DEPT, phổ HMBC, HSQC, phổ H-H COSY và phần mềm ACD/HNMR ACD/CNMR mô phỏng phổ NMR cũng đã cho phép chúng tôi quy kết hợp chất ĐC-1 là một triterpen phải có công thức cấu tạo như sau: 27 O 29 30 28 23 24 25 26 1 3 5 6 8 9 10 15 18 20 22 13 19 21 7 11 14 16 2 4 12 17 Taraxeron (hay Frendoolean-14-en-3-on) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.1. Phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn Vị trí cacbon 13 C-NMR (δ-ppm) ACD/ 13 C- NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm) 1 38,35 38,4 Vùng (1,2 - 1,6) 2 33,08 34,1 2,5 (2H; dd; 7,1 và 11,0) 3 217,3 217,3 - 4 47,56 47,6 - 5 55,77 55,8 (1,99) 6 19,91 20,0 Vùng (1,2 - 1,6) 7 33,57 35,2 Vùng (1,2 - 1,6) 8 38,87 38,9 - 9 48,8 48,7 (1,78 - 1,87) 10 33,57 37,6 - 11 17,44 17,5 Vùng (1,2 - 1,6) 12 36,67 35,8 Vùng (1,2 - 1,6) 13 37,74 37,7 - 14 157,59 157,6 - 15 117,19 117,2 5,48 (1H; d; 3,21; 8,17) 16 34,12 36,7 2,27 (2H; dd; 3,3; 4;1; 6,4) 17 35,57 37,7 - 18 48,7 48,8 (1,78 - 1,87) 19 40,64 40,7 Vùng (1,2 - 1,6) 20 28,79 28,8 - 21 35,11 33,6 Vùng (1,2 - 1,6) 22 37,69 33,1 Vùng (1,2 - 1,6) 23 29,92 29,9 0,76 - 1,07 (24H của 8 nhóm CH3) 24 14,79 14,8 25 29,86 29,9 26 21,34 21,5 27 25,56 25,6 28 26,12 26,2 29 33,36 33,4 30 21,47 21,4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Hình 3.4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) Chất ĐC-2 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 152 0 -155 0 C, tách được từ dịch chiết clorofom, phân lập bằng sắc kí cột silicagen, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-clorofom (90:10). Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M + ] ở 412 m/z. Các phổ FT-IR, 1 H- NMR và 13 C-NMR đều khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl, phổ FT- IR có vân 3410cm -1 rộng, còn ở phổ NMR cho δH-3α = 3,47ppm và δC-3 = 71,6ppm). Phân tử có hai nối đôi không liên hợp (IR cho νmax ở 1622cm -1 ). Phổ 1 H-NMR của các proton thuộc nhóm metyl (CH) cũng đã khẳng định điều ấy, δH-6 = 5,33ppm (1H, dd, j =15Hz và 2Hz); δH-22 = 5,15ppm (1H, dd, j =15Hz và 5Hz); δH-23 = 5,01ppm (1H, dd, j =15Hz và 5Hz). Phổ 13 C- NMR cho thấy δC-5 = 139,2ppm; δC-6 = 121,4ppm; CC-22 = 138,4ppm và δC-23 = 129,2ppm. So sánh các số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất ĐC-2 với số liệu phổ NMR của stingmasterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.2. Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất ĐC-2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất Stingmast -5,22-dien- 24R-3β-ol. HO 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 18 12 13 16 17 19 21 22 24 26 27 28 29 11 14 15 23 2520 Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.2. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16] Phổ 13 C-NMR của Stigmasterol (ĐC-2) Phổ 13 C-NMR của Stigmasterol [16] Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) 1 36 1 37,28 2 29 2 31,66 3 71 3 71,78 4 42 4 42,31 5 140 5 140,76 6 122 6 121,69 7 37 7 31,91 8 31 8 31,91 9 51 9 50,18 10 36 10 36,52 11 24 11 21,09 2 42 2 39,70 13 40 13 42,22 14 57 14 56,88 15 25 15 24,38 16 30 16 28,92 17 56 17 55,97 18 12 18 19,40 19 19 19 12,06 20 40 20 40,50 21 19 21 21,23 22 138 22 138,31 23 129 23 129,29 24 50 24 51,25 25 32 25 31,91 26 21 26 21,09 27 21 27 19,00 28 19 28 25,41 29 12 29 12,25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Hình 3.6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Hình 3.7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Hình 3.8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) Chất ĐC-3 là chất rắn tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy 140- 141 0 C, nó được tách từ dịch chiết clorofom, trong hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10). Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M + ] = 414 (23), [M-1] + = 413 (41). Từ phổ EI-MS cho pic [M+] = 414 ứng với công thức phân tử C29H50O. Phổ hồng ngoại, phổ 1 H-NMR và phổ 13 C-NMR cho thấy trong phân tử có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm -1 rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3 = 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm -1 và 1650cm -1 ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1 H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ 13 C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 = 121,7ppm). So sánh các số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất ĐC-3 với số liệu phổ NMR của β-sitosterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.3. Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất ĐC-3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol. HO 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 18 12 13 16 17 19 21 22 24 26 27 28 29 11 14 15 23 2520 β-sitosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Bảng 3.3. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-3 và β-sitosterol [16] Phổ 13 C-NMR của β-sitosterol (ĐC-3) Phổ 13 C-NMR của β-sitosterol [16] Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) 1 37 1 37,27 2 31 2 32,54 3 71 3 71,77 4 42 4 42,29 5 140 5 140,75 6 121 6 121,69 7 32 7 31,92 8 32 8 31,92 9 50 9 50,15 10 36 10 36,51 11 21 11 21,10 12 40 2 39,80 13 42 13 42,23 14 57 14 56,78 15 24 15 24,31 16 28 16 28,25 17 56 17 56,08 18 12 18 19,39 19 19 19 11,89 20 36 20 36,16 21 19 21 18,80 22 34 22 33,96 23 26 23 26,11 24 46 24 45,85 25 29 25 29,18 26 19 26 18,82 27 19 27 19,05 28 23 28 23,08 29 12 29 11,99 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.9 Hình 3.9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Hình 3.11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Hình 3.12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) Các chất thu được từ dịch chiết etylaxetat (ĐE) được phân chia trên sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi clorofom- metanol với tỉ lệ metanol tăng dần từ 0% - 100% thu được nhiều phân đoạn khác nhau trong đó có phân đoạn CHCl3:MeOH (9:1) chứa một chất sạch đư