Luận văn Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem (erythrina orientalis (l.) murr., fabaceae) và cây hậu phác (magnolia officinalis rehd. et wils, magnoliaceae)

o học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 15 3 à cánh NST số 5; M3 – à mộ NST ương ự (isochromosome) củ cánh ngắn NST số 5; M4 - gồm cánh ài NST số 11 à mộ cánh của NST số 19. Nhuộm băng G cho thấy tế bào He có một b n sao của M1, một b n sao của M2, bốn đến năm b n sao củ M3 à h i b n sao củ M4. He có ph n ứng ương ính ới keratin khi nhuộm immunopero i se à có chứ r nh ự di truy n củ irus u nhú 18 của người (human papilloma virus 18 – HPV-18); biểu hiện p53 thấp à pRB (retinoblastoma suppressor) ở mức b nh hường. 1.3.3. Dòng tế bào ung thư biểu mô vú ở người - MCF7 Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro MCF7 à ng ế bào ung hư biểu m ú hu ừ dịch màng ph i (vị rí i căn) của một phụ nữ sáu mươi chín tu i có đặc ính bám ính ới thời gi n nhân đ i à 29h rong đi u kiện in vitro. MCF7 có một số đặc ính của biểu m động vật có ú đã biệ hó b o gồm kh năng ử ý es r io h ng u các hụ thể estrogen trong tế bào chấ à h năng ạo khối cầu. MCF7 bị ức chế sinh rưởng bởi TNF-α. V mặt kiểu nhân h ng hường số ượng NST điển h nh củ MCF7 à 82 có hể o động từ 66 – 87 NST. D ng ế bào này có ho ng 29 – 34 marker NST, trong đó 24 – 28 m r er à uất hiện hường uyên ở kho ng 30% tế bào. Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 16 1.3.4. Dòng tế bào ung thư vú ở người - KPL4 KPL4 à ng ế bào ung hư ú ở người được phân ập từ dịch màng ph i ác ính của một bệnh nhân ung hư ú đã i căn s ng ung hư ạng iêm. D ng ế bào này biểu hiện Erb B-1, Erb B-2 à Erb B-3. KPL4 có h năng gây u ở chuột sạch miễn dịch. KPL4 được đánh giá à hữu dụng trong việc phá riển các chiến ược chống lại bệnh ung hư ú có biểu hiện uá mức các hụ thể họ Erb B. 1.4. Ch h H n Ma n De ne h c Taxol 1.4.1. Honokiol (H) và Magnolol (M) Vỏ cây à rễ củ các oài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng như mộ phương huốc c truy n ở Hàn Quốc, Trung Quốc à Nhật b n để đi u trị nhi u chứng bệnh hác nh u b o gồm chứng o âu đột quỵ o ăng huyế áp sốt hương hàn rầm uấ đ u đầu à các chứng iên u n đến thần inh hác. Trong số các hợp chấ ách chiế được từ các oài cây này các nhà ho học đặc biệ chú ý đến hai chấ Hono io à M gno o . Đây à h i đồng phân của một hợp chất chứa gốc pheno được ách chiết từ vỏ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd. Et wils, c n gọi à Hậu phác bắc. Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) Honokiol (3,5'-diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 1-5% trọng ượng vỏ cây à M gno o (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 2- Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 17 10% đ u có c ng hức cấu tạo à C18H18O2 với trọng ượng phân ử M = 266,33 Theo các nhà ho học, hoạ ính của hai chấ này có được à nhờ các nhóm chức hy ro y à y ic. M gno o hường được sử dụng để đi u trị đ u cấp ính ho chứng lo lắng à các chứng iên u n đến dạ ày. Các ết qu khoa học đã c ng bố cho thấy M gno o có hoạ ính háng hu n háng iêm chống o y hó chống ung hư b o vệ tế bào hần kinh vỏ khỏi đi u kiện thiếu oxy (hypoxia). Trong hi đó Honokiol - đồng phân của Magnolol - hác với Magnolol ở cách sắp xếp của một nhóm chức y rên ng pheno . Đây à mộ điểm quan trọng quyế định hoạ ính sinh học củ Hono io . Các nhà ho học cũng phá hiện thấy Hono io có ược ính rộng như háng iêm chống đ ng máu chống rối loạn nhịp tim, b o vệ thần kinh, chống o y hó . Các nghiên cứu hác cũng cho hấy Hono io có hể sử dụng như ác nhân chống stress, chất ức chế ung hư ti m năng à các hư hỏng do oxy hó gây r . Magnolol gây apoptosis ở nhi u ng TBUT như ung hư ph i CH-27, HL-60 ung hư ạ ày COLO 205 ung hư g n HepG2 rong hi Hono io gây apoptosis ở các ng TBUT buồng trứng SKOV3 ung hư máu Mo 4B ế bào ung hư ruột kết RKO, TBUT ph i CH27, tế bào nội m chuyển dạng SVR à có hoạt ính chống ung hư à ung hư m iên ết mạch SVR in vivo rên m h nh chuột nhắt [3, 17, 21, 45, 46]. Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu hơn v cơ chế c m ứng apoptosis của Magnolol các nhà ho học đã chỉ ra rằng ưới ác động củ M gno o F s được hoạ hó à cytochrome c được chuyển từ ty thể ra tế bào chấ h ng u chênh ệch nồng độ ion Ca2+ tự do trong bào ương à uá r nh đi u h âm của Bcl-2 (B-cell lymphoma 2). Th ng u sự hoạ hó F s và sự gi i phóng cy ochrome c, caspase-8 à caspase-9 được hoạ hó , từ đó éo heo chuỗi ph n ứng u i ng củ các c sp se à ẫn đến apoptosis. Xử ý ế bào ới ZB4 ( ác nhân àm gián đoạn cơ chế đáp ứng F s) cũng àm gi m ác động của caspase-8 c m ứng bởi Magnolol, từ đó àm gi m ác suất x y r pop osis. Tuy nhiên đến n y các nhà ho học vẫn chư Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 18 tr lời được liệu Magnolol hoạ hó F s rực tiếp h y nó ích hoạt hoạ động của một phối tử Fas rồi s u đó phối tử này mới hoạ hó F s [22, 38, 46]. Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn đến apoptosis của tế bào Trong hi đó Hono io được chứng minh à có ác động đi u h âm c-FLIP (FLICE- i e inhibi ory pro ein c n gọi à cFLAR) ở TBUT, dẫn đến àm TBUT mẫn c m hơn với các con đường apoptosis c m ứng bởi c TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) à F s. Chỉ sử dụng Honokiol sẽ ức chế ở mức độ vừa ph i sự ăng rưởng củ các TBUT ph i ở người trong khi nếu kết hợp với TRAIL, nó sẽ àm gi m mạnh mẽ kh năng sống của tế bào à c m ứng apoptosis tố hơn so với chỉ sử dụng TRAIL. Quá r nh apoptosis c m ứng bởi F s hi Hono io được sử dụng kết hợp với một phối tử Fas hoặc mộ háng hể háng F s cũng có ết qu ương ự. Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 19 Trong tất c các pro ein iên u n đến uá r nh pop osis đã được kiểm tra h c-FLIP à pro ein uy nhấ được đi u h âm nh nh chóng bởi Honokiol ở tất c các ng ế bào. Đi u này cho hấy đi u h âm c-FLIP à mộ bước chủ chốt của uá r nh ác động của Honokiol dẫn đến apoptosis c m ứng bởi thụ thể chết [2, 12, 15, 46]. Cấu rúc 2 ng phenol chứ 2 nhóm y giúp ăng ái ực của Honokiol với các ế bào nội m ; nó hoạ động như ác nhân chống o y hó ức chế sự o y hó của lipoprotein có tỷ trọng thấp à uá r nh pop osis c m ứng bởi glucose ở tế bào nội m củ người nhờ các hoạ ính mạnh trong việc àm sạch các gốc tự do [5-8, 20, 19, 22, 23, 25, 26, 33, 38, 42, 44]. 1.4.2. Derrone (D) Cây V ng nem c n được gọi bằng nhi u ên gọi hác à cây á V ng H i đồng b Thích đồng b có ên ho học à Erythrina orientalis L. Murr., thuộc họ Đậu Fabaceae. Loài này phân bố rộng từ Ð ng Á ới châu Phi. Ở châu Á oài này ph biến ở Ấn Độ, Trung Quốc Thái L n C mpuchi Lào Việt Nam, Malaixia, Indonesia à Philippin. Đây à một trong những vị thuốc ân gi n ở Việ N m à nhi u nước hác rên hế giới, có ác ụng n hần hạ huyế áp háng hu n à chống oãng ương. Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có c ng hức hó học à C20H16O5, M = 336,1 à hợp chất được ách chiết từ cây V ng nem Erythrina orientalis (L.) Murr.,. Trong c ng r nh nghiên cứu được c ng bố ào Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 20 háng 6 năm 2012 Hayet Edziri à cộng sự đã chứng minh Derrone có ác động háng hu n với vi khu n Pseudomonas aeruginosa à Escherichia coli với nồng độ trong kho ng từ 7,81 – 15,62 µg/mL. Ngoài r Derrone cũng hể hiện ính háng nấm mạnh với các oài huộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL à có ính độc với ng ế bào ung hư g n HepG2. Tuy nhiên các cơ chế chuyên sâu ác động của Derrone ên ế bào ẫn c n chư được biế rõ [10, 18]. 1.4.3. Taxol (Paclitaxel) Taxol (C47H51NO14, M = 853,906 g/mol) lần đầu iên được đ cập đến với ên gọi Caltuvocus – cây Thủy ùng ừ thời L Mã c đại. Một số bài huốc ân gi n cũng sử dụng các ịch chiế này như à chấ độc hoặc thuốc chữa bệnh. Lịch sử hiện đại nghiên cứu v Taxol bắ đầu từ năm 1962 hi iến sĩ Arthur S. Barclay thu thập vỏ của Taxus brevifolia à một trong số các mẫu củ oài này hể hiện độc ính ới tế bào. Năm 1967 Monroe E. W à M nsu h C. W ni huộc Viện ung hư Ho Kỳ ách chiết được chấ này ừ vỏ cây Taxus brevifolia à đặ ên à T o . S u này hi được phá riển hành hương ph m bởi Bristol-Myers Squibb (BMS), Taxol được đ i ên hành Paclitaxel. Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol Năm 1971 cấu rúc phân ử của Taxol được phá hiện nhờ các phân ích inh thể bằng tia X bởi chính Monroe à W ni. Năm 1979 iến sĩ Horwi z à cộng sự c ng bố các phá hiện của họ v ương ác giữa Taxol với các i ống: nó có h Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 21 năng húc đ y uá r nh h nh hành i ống bằng cách bám à àm b n vi ống, từ đó h y đ i lịch r nh đã định sẵn củ uá r nh phân bào gây r sự chết cho TBUT lẫn tế bào b nh hường. Các hử nghiệm âm sàng ới Taxol bắ đầu từ háng 4 năm 1984 à cho đến nay, Taxol đ ng được sử dụng để đi u trị ung hư ph i ung hư buồng trứng ung hư ú ung hư chuyển dạng Kaposi sarcoma [29, 35]. Các nghiên cứu chuyên sâu cho hấy Taxol có h năng iêu iệt TBUT h ng u các con đường độc lập với p53; ác động này sẽ được ăng cường hiệu qu với các ế bào bị đột biến p53 hơn à ới các ế bào có iểu gen p53 dại. Ngoài ra, Taxol có u hướng c m ứng chặn tế bào đi ừ G2 s ng M rong chu r nh ế bào à gây r pop osis ở các ế bào bị chuyển dạng, nhưng chỉ gây r ừng ở G1 với các ế bào h ng bị chuyển dạng. Tất c các đặc ính này giúp Taxol có hể ác động biệ hó ới các TBUT mà hại với các ế bào hường [35, 43]. V cơ chế ác động ên ế bào ẫn đến pop osis cũng như các ác nhân c m ứng apop osis hác cơ chế của Taxol cũng iên u n đến họ protein Bcl-2. Taxol có thể đi u chỉnh biểu hiện củ các hành iên rong họ pro ein này à gây r biến đ i sau dịch mã củ các phân ử Bcl-2. Taxol đi u h âm Bc -XL à đi u h ương B à B . Ngoài ra, Taxol cũng c m ứng sự phosphory hó Bc -2 từ đó c m ứng pop osis. Các nghiên cứu gần đây cũng cho hấy sự phosphory hó Bc -2 chỉ xuất hiện ở các ế bào đã được dừng ở phase G2/M sau khi xử ý ới Taxol. Đi u này gợi cho thấy sự phosphory hó Bcl-2 chỉ xuất hiện như à hệ qu của sự dừng phân bào tế bào. Các nhà ho học cũng chỉ ra rằng, hoạ hó JNK/SAPK cần cho gi i đoạn sớm củ uá r nh pop osis khởi phá bởi Taxol. Ngoài r Taxol cũng c m ứng apoptosis xuất hiện sau khi ngừng phân bào ới cơ chế u i ng sự n định các i sợi ubu in mà hiện nay vẫn chư được biế rõ [35, 43]. Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 22 Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin 1.5. Enzyme Aurora kinaza Aurora kinaza thuộc nhóm những pro ein đi u khiển uá r nh phân bào. Chúng b o gồm b pro ein hành iên có ên gọi Auror A Auror B à Auror C. Các pro ein này iên u n đến uá r nh h nh hành à phân chi rung thể uá r nh iên ế các inetochore với các i sợi (micro ubu e) à sự sắp xếp củ hoi sắc. V ậy, những pro ein này đóng mộ i r u n rọng rong uá r nh phân chi Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 23 của nhiễm sắc thể à sự n định v nhân ế bào [41]. Sự quan âm đến các pro ein này ăng ên hi các nhà ho học nhận thấy sự ương u n giữa sự biểu hiện uá mức củ các pro ein này rong rất nhi u loại ung hư ới sự bấ hường của bộ nhiễm sắc thể [2]. Gen uy định Aurora A nằm rên nhiễm sắc thể 20 củ người tại vị rí 20 13. Sự biểu hiện uá mức củ pro ein này ần đầu iên được phá hiện ở ung hư ruộ nguyên phá . Đây chính à bằng chứng đầu iên cho hấy mối iên u n giữ Auror à ung hư. Auror hoạ động như gen gây ung hư hi chuyển nhiễm ào các ng tế bào nguyên bào sợi Rat1 ở chuột cống hay NIH3T3 ở chuột nhắt. Gen Aror A h ng những được ăng cường trong nhi u ng ế bào mà c n ở 52% ung hư rực ràng nguyên phá à 12% ung hư ph i nguyên phá [13]. Auror B cũng biểu hiện uá mức ở các ng ế bào ách ừ ung hư ruột [9]. Hơn nữa, sự biểu hiện uá ngưỡng của Aurora B trong tế bào nu i cấy ích hích sự phân chi nhiễm sắc thể mộ cách bấ hường. Những tế bào h nh hành sẽ à những tế bào nhân uái ( neup oi y) à có hể húc đ y sự h nh hành ung hư ở chuột [31]. Tại kỳ giữ à ỳ sau củ uá r nh phân bào Auror B tạo hành phức hợp với các pro ein hách (p ssenger pro eins) như Sur i in INCENP TD60 à Borealin. Những pro ein này cũng biểu hiện vượt mức ở một số loại ung hư như ung hư rực ràng ung hư ruộ ung hư ú à một số ng ế bào chuyển dạng. Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng Sur i in à INCENP à cơ chất cho hoạ ính enzym củ Auror B đồng thời chúng cũng à ác nhân ích hích hoạ ính của pro ein này [37]. Như ậy rong các ng ế bào ung hư hoạ ính của Aurora B phụ thuộc ào sự biểu hiện củ chính b n hân nó à các pro ein iên u n. Aurora C biểu hiện uá mức ở ung hư uyến ti n liệ à một số ng ế bào ung hư hác [41]. Đi u đó chứng tỏ rằng nó có hể có i r rong ung hư ế bào soma. Mặc ù ậy, sự hiểu biết v chức năng củ pro ein này ần c n rấ nghèo nàn. Những đi u rên chứng tỏ Aurora kinaza à một mục iêu rong đi u trị ung hư à o ậy việc m iếm các chất ức chế hoạ ính của Aurora kinaza à rất cần thiết. Mộ ài chất ức chế đã được nghiên cứu à c ng bố như ZM447469 (2003) Luận văn cao học Tổng quan Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 24 Hesperadin (2004), VX-680 (2004) and PHA-680632 (2006), Benzo[e]pyridoindole (2008) (Hình 13). Trong số đó VX680 có ác ụng ức chế sự phá riển ung hư in vivo à hiện n y đ ng được em é để thử nghiệm âm sàng. Tuy nhiên những chất ức chế này có một số ác ụng phụ à ính đặc hiệu chư c o. VX680 à một chấ có nhi u triển vọng nhất hiện nay trong việc ức chế hoạ ính củ Auror nhưng đồng thời nó cũng ức chế FLT-3 LcK à kinaza đột biến BcrAbl T315I. Mặ hác hoạt ính của chấ này c n phụ thuộc ào p53. Hơn nữ rong uá r nh phá riển u hường xuất hiện các đột biến ung u nh các ị rí (si es) đi u khiển hoạ ính kinaza. Do vậy, việc nghiên cứu à m iếm các chất ức chế đặc hiệu hơn à rất cần thiết [16]. Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza ( ): các ạng khung cấu rúc củ các chất ức chế; (b): các chất ức chế đã c ng bố Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 25 CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đ ợn n h ên cứ - Các ng TBUT HCT116, He MCF7 à KPL4 o Nhóm nghiên cứu Ung hư hực nghiệm – Bộ m n Tế bào M Ph i à Lý sinh – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gi Hà Nội cung cấp. - Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) à Derrone (D) do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhấ ưu rữ ở nồng độ 20.000µg/mL rong ung m i DMSO. - Đối chứng ương T o ạng hương ph m 30mg/5mL ương đương 6.000µg/mL. 2.2. M y óc ụn cụ Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao Tên Hãn ản xuất Buồng đếm tế bào Thom s Đức Coverglass Trung Quốc Đĩ 96 giếng Corning, Mỹ Đĩ nu i cấy tế bào 35, 100mm Corning, Mỹ Lame, lamelle Trung Quốc Ống Falcon 15, 50mL Corning, Mỹ Ống y âm 1 5mL Corning, Mỹ Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 26 Pipet nhựa 1mL, 2mL, 5mL, 10mL Corning, Mỹ Tube b o qu n Corning, Mỹ Bảng 2: Thiết bị sử dụng Tên Hãn ản xuất Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss – Đức Kính hiển i ser ué LSM 510 Carl Zeiss – Đức Kính hiển i soi ngược Axiovert 40 CFL Carl Zeiss – Đức Máy đọc ELISA BioLab – Mỹ Máy y âm Uni ers 320 He ich Đức Pipett aid Gibson Tủ ấm 5% CO2 Shell Lab, Mỹ Tủ hood Esco Mỹ Tủ n nhiệt Gra Operation SS40-1 Đức 2.3. Hóa chất ử ụn Bảng 3: Hóa chất sử dụng Tên Hãn ản xuất Alexa antimouse 488 Invitrogen, Mỹ Anti-Histon H3PS10 Antibody Invitrogen, Mỹ Antitubulin antibody Invitrogen, Mỹ Blue trypan Mỹ BSA Merc Đức Ce Ti er 96®A ueous Non- Radioactive Cell Proliferation Assay Promega, Mỹ Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 27 DMEM Invitrogen, Mỹ Ethanol Trung Quốc FBS Invitrogen, Mỹ Hoestch 3334 Invitrogen, Mỹ Paraformaldehyde Merc Đức PBS Invitrogen, Mỹ Peniciline/Streptomicin Invitrogen, Mỹ Red Phalloidine Invitrogen, Mỹ Trypsin Invitrogen, Mỹ Tryton X Merc Đức 2.4. Ph ơn h h ạ hóa nhân n c c n b in vitro  Tế bào được cất giữ trong Nito lạnh đem rã đ ng rong ủ n nhiệt 37ºC. Chuyển dung dịch chứa tế bào ào ống falcon 15 mL đã có chứa dung dịch PBS, y âm 1000 rpm rong 5 phú bỏ dịch n i, thu cặn tế bào. Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng  Phân án ế bào ắng ào 5-7 mL m i rường nu i cấy hích hợp, sục đ u rồi cho ào đĩ pe ri 100 mm hoặc ch i nu i cấy T25 ủ trong tủ ấm 37ºC 5% CO2. Kiểm r hàng ngày, h y m i rường 2 ngày/lần, khi tế bào mọc ín Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 28 75-90% b mặ đĩ h hu hoạch hoặc tiến hành cấy chuyển tế bào s ng đĩ nu i cấy mới.  Thu tế bào ừ đĩ nu i cấy bằng cách ủ với dung dịch Trypsin-EDTA 1X rong 5 phú ở 37ºC 5% CO2. Trung h Trypsin bằng cách b sung với m i rường nu i cấy đã b sung FBS hú ịch ào ống y âm đem y âm 1000 rpm trong 5 phú .  Kiểm tra tỷ lệ tế bào chết bằng cách nhuộm với Blue trypan trong 3-5 phú rồi đếm rên buồng đếm tế bào. Nếu tỷ lệ chết < 10% t ng số tế bào h tế bào được xem à đủ khỏe mạnh ùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc ùng cho các mục đích hí nghiệm tiếp theo. 2.5. Ph ơn h hử đ c ính MTS Nguyên ý: MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - e r zo ium) hi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được tế bào chuyển hó , tạo ra một s n ph m form z n n rong m i rường nu i cấy tế bào hấp thụ ánh sáng ối đ ở bước sóng 490-500 nm rong đệm PBS. Lượng formazan tạo ra sẽ được định ượng bằng ượng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp thụ à ỷ lệ thuận với ượng tế bào sống rong m i rường nu i cấy đó. Phương pháp MTS hường được coi à phương pháp MTT 1 bước có ính iện lợi cao do chỉ cần b sung thẳng chấ ào m i rường nu i cấy tế bào mà h ng cần bất kỳ bước rửa hay chu n bị nào hác. Quy r nh hí nghiệm Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng Mẫu C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL) H, M, D 5 10 20 40 50 Taxol 0,003 0,03 0,3 3 30 (Tương ứng nồng độ DMSO cuối cùng ở giếng à 0,125%, lặp 4 lần/nồng độ) Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 29  Chu n bị tế bào: Với mỗi ng ế bào chu n bị dung dịch tế bào s o cho có 5.000TB/180 µL/giếng rên đĩ 96 giếng. Trộn nhẹ để tế bào phân án đ u rong các giếng u n sá iểm r ưới KHV đ o chi u, ủ ở 37oC, 5% CO2 rong 24h để tế bào n định à bám ào b mặ đĩ .  Chu n bị dung dịch thuốc rung gi n à ủ chất: Pha dung dịch trung gian ương ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng. B sung 20 µL dung dịch rung gi n ương ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân bố đ u trong giếng, ủ 48h ở 37oC, 5% CO2 u n sá à ghi ại h nh nh hàng ngày.  Ủ MTS à đo mậ độ quang học: Chu n bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20 MTS. Thêm 30 µL hỗn hợp rên ào mỗi giếng đ ng chứa 200 µL dung dịch m i rường nu i cấy đã được b sung thuốc à ủ với tế bào trong 48h. Ủ hỗn hợp rên rong 3h ở đi u kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mậ độ quang học ở bước sóng 490nm. Dùng phần m m Excel để xử ý số liệu ính chỉ số IC50 – Là giá rị nồng độ chất thử tại đó chất thử có h năng gây chết 50% tế bào.  Chỉ số IC50 của một chất với mộ ng ế bào được ính từ nghiệm phương r nh hồi quy biểu diễn ương u n giữ à nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó à y à chỉ số ăng sinh A (%) củ ng ế bào đó hi được ủ với chất thử ở các nồng độ hác nh u hi y = 50 (%).  A (%) được ính heo c ng hức: o A (%) = V/Vh x 100% V: Chỉ số OD đo được ở trong giếng hí nghiệm Vh: Chỉ số OD đo được ở trong giếng đối chứng ung m i Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 30 2.6. Ph ơn h hử đ c ính ên h nh spheroid  Tạo giá hể cho khối spheroid bằng agarose 1,5% cho ào các giếng của đĩ 96. Chờ g rose đ ng ại tiến hành ạo giọ reo rên nắp đĩ 96 ới mậ độ 5.000TB/giọt treo.  S u 2 ngày tạo giọt treo hi u n sá hấy các ế bào ưới ác ụng của trọng lực đã tạo hành cụm, tiến hành hạ giọ reo ào các giếng ương ứng đã có giá hể agarose 1,5% à m i rường nu i cấy phù hợp. Với hí nghiệm heo õi ốc độ sinh rưởng của khối spheroid  Theo õi hàng ngày à h y m i rường, chụp nh 2 ngày/ ần cho đến khi khối spheroi phân rã.  Đo ích hước khối spheroi à ính hể ích hối bằng phần m m AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng để biết quy luậ ăng rưởng của khối spheroid. Với thí nghiệm kiểm tra ác động của H ên h năng ạo khối spheroid  Sau khi tạo giá hể, tiến hành ạo giọ reo rên nắp đĩ 96 giếng với mật độ 5,000TB/giọt treo heo các nhóm mẫu hí nghiệm ương ứng bằng m i rường có chứa H nồng độ (NĐ) 5µg/mL à m i rường có chứa H NĐ 10µg/mL.  S u 2 ngày iến hành hạ giọt treo xuống các giếng chứ m i rường hoặc m i rường chứa H với nồng độ ương ứng.  Theo õi hàng ngày à h y m i rường, chụp nh 2 ngày/ ần  Đo ích hước khối spheroi à ính hể ích hối bằng phần m m AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng của khối spheroid ở ba mẫu hác nh u à so sánh sự hác biệt xem liệu H có nh hưởng đến uá r nh ạo khối spheroi h y h ng. Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 31 Với thí nghiệm heo õi ác động của H ên uá r nh ăng rưởng khối spheroid  Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo à hạ giọt treo ào các giếng ương ứng đã có giá hể agarose 1,5% à m i rường nu i cấy hường các hối spheroi h nh hành được nu i rong m i rường 37oC, 5% CO2.  S u 5 ngày hạ giọt treo, tiến hành chi các giếng có chứ các hối spheroi đồng đ u phá riển khỏe mạnh hành b nhóm mẫu: Đối chứng sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, à mẫu ủ H NĐ 20µg/mL.  Theo õi hàng ngày h y m i rường ương ứng à chụp nh 2 ngày/ ần  Đo ích hước khối spheroi à ính hể ích hối bằng phần m m AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng của khối spheroid, so sánh sự hác biệt xem H có ác động ên uá r nh sinh rưởng của khối spheroi h y h ng. 2.7. Ph ơn h nh ễn ịch h ỳnh an Nồng độ thuốc thử:  H: 10 µg/mL à 20 µg/mL (với hí nghiệm kiểm r ác động ên c in)  H, M, D: 10 µg/mL ( ới hí nghiệm kiểm r ác động ên Auror in z )  Taxol: 0,3 µg/mL Quy r nh hí nghiệm  Chu n bị 4 đĩ nu i cấy tế bào 35 mm, mỗi đĩ chứa 04 coverglass. B sung ào mỗi đĩ ung ịch chứa TBUT He nu i ới mậ độ 500.000TB/2,25mL m i rường. Các đĩ được chia hành 4 mẫu hí nghiệm ương ứng gồm: ĐCSH H NĐ 10µg/mL, H NĐ 20µg/mL à Taxol 0,3µg/mL  S u 24h nu i cấy cho tế bào n định, bám uống b mặt coverglass, tiến hành ủ thuốc với các nồng độ đã ự kiến. Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 32  Cố định mẫu khi thấy phần lớn các tế bào đã có biến đ i h nh hái rõ rệt ưới ác động của chất thử à ẫn đ ng bám ở rên đĩ .  Nhuộm mẫu heo các bước như s u: o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệ độ ph ng rong 10 phú . o Đục màng ế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệ độ ph ng rong 10 phú . o Block các iên ế h ng đặc hiệu à bộc lộ các iên ế đặc hiệu bằng cách ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệ độ ph ng rong 30 phú . - Với hí nghiệm kiểm r ác động ên i sợi actin: o Nhuộm háng hể 1 anti alpha-tubulin trong 1h ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. S u đó nhuộm háng hể 2 M488 rong 30 phú ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. o Nhuộm trực tiếp actin bằng Red-phalloidine trong 1h ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. o Nhuộm nhân bằng Hoechs 3334 rong 10 phú ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. o Qu n sá ưới KHV huỳnh u ng à ghi lại h nh nh phân ích. - Với hí nghiệm kiểm r ác động ên sự phosphory hó His one H3: o Nhuộm háng hể 1 anti histone H3 antibody trong 1h ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. S u đó nhuộm háng hể 2 M488 rong 30 phú ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phú ở nhiệ độ ph ng ránh sáng. o Qu n sá ưới KHV huỳnh quang à ghi ại h nh nh phân ích. Luận văn cao học K t quả và thảo luận Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 33 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. K ả hả đ c ính c a H n Ma n De ne ên h nh 2D 3.1.1. Với dòng HCT116 Sau 48h ủ với các chấ hí nghiệm, tiến hành chụp nh mẫu ưới KHV đ o chi u hu được kết qu như s u: các ế bào HCT116 có ích hước nhỏ h nh ạng ài. Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x) Kh ng có sự hác biệ đáng ể giữa mẫu ĐCDM ủ DMSO 0,125% với mẫu ĐCSH. S u 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhấ (5µg/mL) H đã có ác ụng rõ rệt: 80% các ế bào co r n ại. Ở nồng độ thứ h i (10µg/mL) các ế bào chỉ c n à các chấm Luận văn cao học K t quả và thảo luận Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 34 r n nhỏ à h ng c n sự hác