Luận văn Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

holderia phenoliruptrix AC110 (tên cũ là Burkholderia cepacia AC1100) [20]. Các gen tftA và tftB mã hóa hai dưới đơn vị (subunit) của enzyme 2,4,5-T oxygenase tham gia chuyển hóa 2,4,5-T sang 2,4,5-TCP (hình 1.5). Tiếp theo 2,4,5-TCP chuyển thành DCHQ nhờ gen tftC mã hóa enzyme monooxynase chứa putative flavin. Sau đó DCHQ chuyển hóa thành CHQ, maleylaxetat, oxoadipat, succinat và axetat bởi các gen tftCDEF [21]. Hình 1.5 Con đường phân huỷ 2,4,5-T bởi Burkholderia cepacia AC1100 [20] Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Một vi khuẩn khác có khả năng khoáng hóa hoàn toàn 2,4-D và 2,4,5-T đó là Nocardioides simplex 3E được phân lập bằng cách làm giàu với 2,4,5-T, vi khuẩn này có thể phân hủy cả hai hợp chất trên thành trihydroxylat benzen [45]. Nghiên cứu khác của Mai và cộng sự cho thấy quá trình đồng trao đổi chất của vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia PM. Vi khuẩn này cần mecoprop để đồng trao đổi chất 2,4,5-T [36]. La Thị Thanh Phương và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập chủng Pseudomonas sp. BDN15, chủng này có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung 2,4,5-T. Sau 90 ngày ở điều kiên nuôi tĩnh và nhiệt độ phòng chủng BDN15 đã phân hủy 39,37% với nồng độ ban đầu là 1000ppm 2,4,5-T đây cũng là nguồn năng lượng và carbon duy nhất trong môi trường nuôi cấy [6]. Nguyễn Thanh Thủy và cộng sự đã công bố chủng nấm sợi FDN41 có khả năng phân hủy 43,46% 2,4,5-T trong 20 ngày với hàm lượng 2,4,5-T ban đầu 905,34 μg/ml. Ngoài ra chủng này còn có khả năng sử dụng một số PAH như anthrancen, phenanthren .v.v. là nguồn năng lượng và carbon duy nhất [12]. Khác với số lượng ít của các vi khuẩn phân hủy 2,4,5-T, rất nhiều vi khuẩn phân hủy 2,4-D đã được phân lập từ nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau như đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải và đất nguyên thủy. Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D được xếp thành 3 nhóm dựa vào enzyme phân hủy và các đặc tính lý hóa của chúng. Nhóm thứ nhất nằm trong lớp β và γ- Proteobacteria như Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas. Những vi khuẩn này có chứa gen tfd thường nằm ở các plasmid và có thể chuyển được từ cơ thể vi sinh vật nọ sang cơ thể vi sinh vật kia. Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn nằm trong lớp α- Proteobacteria thuộc chi Sphingomonas. Chúng được phân lập từ môi trường có chứa clo. Nhóm thứ ba thuộc chi Bradyrhizobium trong lớp α- Proteobacteria. Các vi Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 khuẩn này được phân lập từ đất nguyên thủy ở Canada, Hawaii, Chile và một số khu vực khác [28],[ 44]. Trong số các vi khuẩn tham gia phân hủy 2,4-D, chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 là chủng được nghiên cứu khá kỹ về con đường chuyển hóa cũng như các gen mã hóa cho những enzyme tham gia phân hủy 2,4-D (Hình 1.6). Họ gen tfd gồm có 6 gen tfdA, tfdB, tfdC, tfdD, tfdE, tfdF mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D tạo thành axit succinic [44]. Hình 1.6 Con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 [44] Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Maltseva và cộng sự đã công bố chủng Halomonadaceae strain 1-18 có khả năng phân hủy 3000 mg 2,4-D/l trong 3 ngày trên môi trường có bổ sung 50 mg cao men [37], khi nghiên cứu sâu hơn, chủng Halomonadaceae strain 1-18 nhóm tác giả đã phát hiện ra con đường phân hủy 2,4-D của chủng này giống với con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus JMP134, ngoài ra Maltseva cũng tìm thấy sự có mặt của gen tfdA ở chủng này. Nhóm tác giả này đã công bố 5 chủng thuộc các chi Acinetobacter, Serratiamarcescens, Stenothrophomonas, Flavobacterium và Penicillium phân lập được từ đất ô nhiễm 2,4-D ở Brazin cũng có khả năng phân hủy 2,4- D [37]. Năm 2002, Kitagawa đã tìm thấy một số gen mới tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D. Các gen cadABC, cadK được tách dòng từ chủng Bradyrhizobium sp. strain HW13. Khi so sánh trình tự nucleotide của các gen cadABC với trình tự gen TftA, TftB của chủng Burkholderia cepacia AC1100 cho thấy các gen này có độ tương đồng 46%, 44% và 37% với nhau. Trình tự gen cadK cũng được so sánh với trình tự gen TfdK của chủng Ralstonia eutropha JMP134, kết quả cho thấy 2 gen này có độ tương đồng 60%. [33] Trong một nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự trên mẫu đất nhiễm độc chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng, nhóm tác giả đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn phân hủy 2,4-D đều thuộc chi Athrobacter có tên lần lượt là Athrobacter sp. DNB19, Athrobacter sp. DNB20 và Athrobacter sp. DNB21. Hai gen cadA và tfdA mã hóa cho các enzyme tham gia phân hủy 2,4-D của chủng Athrobacter sp. DNB19 đã được xác định với mức độ tương đồng 93 đến 94% với các trình tự gen tương ứng đã được công bố trên GenBank [8]. Theo Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự đã công bố chủng nấm FDN20 cũng có nguồn gốc từ mẫu đất nhiễm chất độc hóa học, có khả năng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 loại bỏ 72,92 μg/ml tương đương với 44,18% hàm lượng 2,4-D đưa vào ban đầu [4]. Ngoài 2,4,5-T, 2,4-D là thành phần chính của chất diệt cỏ còn có sản phẩm phụ của chất diệt cỏ là dioxin. Dioxin là thành phần rất độc với con người và môi trường vì vậy trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy dioxin bởi vi sinh vật. Lyama và cộng sự đã sử dụng Bacillus midousuji để phân hủy dioxin, sau 24h nuôi cấy, Bacillus midousuji đã phân hủy 34% 2,3,7,8-TCDD và sau 48h khoảng 70% dioxin đã bị loại bỏ [35]. Theo Hong và cộng sự chủng Sphingomonas sp. RW1 có khả năng chuyển hóa 2,7-DCDD và 1,2,3,4-TCDD thành 4-chlorocatechol và 3,4,5,6-tetrachlorocatechol. Sau đó chủng RW1 tiếp tục chuyển hóa 3,4,5,6- tetrachlorocatechol thành 2-methyoxy-3,4,5,6-tetrachlorophenol [27]. Habe và cộng sự đã công bố hai chủng Pseudonomas sp. CA10 và Terrabacter sp. DBF63 đều có khả năng sử dụng từ 10-35% 2,7-DCDD và 1,2,3-TrCDD với nồng độ ban đầu là 10 ppm [25]. Ngoài vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân hủy dioxin thì vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, vi khuẩn kị khí không bắt buộc cũng có khả năng chuyển hóa dioxin. Vi khuẩn kị khí có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa clo trong đó có dioxin. Rất nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo trong môi trường hoạt động của vi khuẩn khử sắt, vi khuẩn khử sunphát, và nhóm khử halogen v.v. Một số chủng vi khuẩn kị khí có khả năng khử clo đã được nghiên cứu như: Desulfitobacterium dehalogenans JW/IU-DC1 [34], Dehalococcoides ethenogens 195, Dehalococcoides sp. CBDB1 [30], Desulfitobacterium sp. PCE-1, Dehalococcoides sp. FL2 v.v. Trong số các vi sinh vật kị khí đã nghiên cứu trong hai thập kỷ qua thì các vi khuẩn thuộc chi Dehalococcoides được quan tâm hơn cả bởi chúng có khả năng loại khử clo Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 của rất nhiều hợp chất chứa clo như Trichlorethylene , Vinyl Chloride, Trichlorodibenzo-p-dioxins, Polychlorinated dibenzofurans v.v. [30]. Theo Bunge và cộng sự, chủng Dehalococcoides sp. 195, Dehalococcoides sp. CBDB1 đã được chứng minh là có khả năng phân hủy dioxin [19], chủng CBDB1 đã đề khử clo 1,2,3,4-TeCDD (46 µM ) trong 84 ngày nuôi cấy thành 2,3-DiCDD và 2-MCDD [19]. Chủng CBDB1 sử dụng clo trong dioxin là chất nhận điện tử, từ đó loại bỏ clo ra khỏi phân tử dioxin. Kết quả tạo ra sản phẩm ít độc hơn là 2,7; 2,8-DiCDD và 2-MCDD. Các hợp chất này sẽ dễ bị phân hủy sinh học bởi các vi sinh vật hiếu khí. Chủng CBDB1 còn có thể sử dụng 1,2,3,7,8-PCDD là chất có độ độc là 1 tương đương với 2,3,7,8-TCDD [19]. Tại Việt Nam, Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã công bố chủng FDN30 có khả năng phân hủy hiếu khí 2,3,7,8-TCDD. Đây là chủng vi nấm được phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học tại Đà Nẵng. Sau hai tuần, chủng này đã phân huỷ 59% dioxin chứa trong môi trường nuôi cấy [20]. Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, nhóm tác giả này đã phân lập được một số chủng vi sinh vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, từ đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng. Các vi khuẩn đã được phân lập là Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. SETDN1, Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN12 [1], [2], [10], [13]. 6. Phân loại vi sinh vật 6.1. Phân loại theo phƣơng pháp cổ điển Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lí- sinh hóa. Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, mầu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 hay dạng chùm, dạng chuỗi v.v. khả năng bắt mầu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không?, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào v.v. Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp v.v. Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng. 6.2 Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [7]. Bảng 1.2. Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần bazơ(%G+C) Chi Biến tính DNA:DNA Loài Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxome Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 RNA riboxom Trình tự nucleotid Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA Protein Trình tự amino acid Loài, chi và trên chi So sánh bằng phản ứng huyết thanh Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysaccharid Acid teichoic Màng Acid béo Loài và chi Lipid phân cực Acid mycolic Isoprenoid quinones Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [29]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 1. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 1.1 Vật liệu Mẫu đất từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất độc hóa học ở sân bay Đà Nẵng thuộc đề tài “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến” do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà là chủ trì đã được sử dụng để nghiên cứu phân lập chủng vi sạch vật có khả năng sử dụng 2,4,5-T và 2,4-D. 1.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao của các hãng Roche, Sigma, Merk v.v. Các dung dịch tách DNA plasmid (Sol I (glucose: 50 mM; tris - HCl (pH 8): 25 mM; EDTA (pH 8): 10 mM); Sol II (NaOH: 0,2N; SDS: 1%); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml; CH3COOH: 11,5 ml; H2O: 28,5ml). Vectơ pCR2.1 (Promega), đệm TAE 1X để điện di (Tris- acetate: 40 mM; EDTA: 1 mM). Loading dye 6x (bromophenol blue: 0,25%; xylen cyanol FF: 0,25%; glyxerol: 30%) v.v. Dịch chiết đất chứa hơn 99% là 2,3,7,8-TCDD, ngoài ra còn có các chất khác như 2,4,5-T, 2,4-D v.v. được chiết từ đất ô nhiễm của sân bay Đà Nẵng. Trình tự cặp mồi Mồi xuôi 27F: 5’ AGA GTT TGA TTC MTG GCT CAG 3’ Mồi nguợc 1492R: 5’ GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3’ 1.3 Thiết bị, máy móc Các thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen – Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Viện Công nghệ sinh học bao gồm Box cấy vô trùng, kính hiển vi, cân điện tử, nồi khử trùng, tủ sấy, máy nuôi lắc nhiệt độ 30oC, tủ nuôi ổn nhiệt 30oC, máy ly tâm, máy PCR, máy xác định trình tự gen ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy soi DNA, máy chụp ảnh Gel-Doc, máy điện di Bio- Rad, tủ lạnh các loại 4oC, -20oC, -80oC, các dụng cụ thí nghiệm như bình tam giác, pipet, đầu typ, ống ly tâm v.v. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) - KH2PO4 0,5 - K2HPO4 0,5 - MgSO4 2 - NaCl 1 - NH4Cl 1 - NH4NO3 1 - CH3COONa 1 - CaSO4 1 - Lactat Natri 1 ml - Axít Butyric 10 µl - Axít Propionic 10 µl - Axít Isobutyric 1 µl - Axít Succinic 3,5 µl - Và các chất bổ sung khác 2.1.2 Môi trường SH1 thạch Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng có bổ sung 18g agar/l. 2.1.3 Môi trường muối khoáng (g/l) KNO3 3 MgSO4 0,4 KH2PO4 0.3 Na2HPO4 0,7 NaCl 0,4 pH 7-7,2 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.1.4 Môi trường LB dịch (g/l) NaCl 10 Tryptone 10 Cao men 5,0 Nước cất vừa đủ 1 lít pH 7 2.1.5 Môi trường LB thạch (g/l) Công thức các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 18g agar/l. 2.1.6 Nước muối sinh lý (0,85%) NaCl 8,5g Nước máy vừa đủ 1 lít 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật Vi khuẩn được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T. Cân 5g đất từ bioreactor cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trương SH1/5 có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T, nuôi lắc 5- 7 ngày ở 30oC. Chuyển 10% giống ở lần làm giàu thứ nhất sang bình làm giàu lần hai chứa môi trường SH1/5 bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Quá trình làm giầu này được lặp lại 3. 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Từ mẫu làm giầu lần thứ 3, pha loãng từ 101 đến 107, sau đó bơm 100μl dung dịch pha loãng có chứa vi khuẩn lên các đĩa môi trường SH 1/5 thạch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Sau 5 đến 7 ngày nuôi ở điều kiện tối 30oC, những Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch được tách và chuyển sang nuôi cấy trong bình tam giác chứa 20 ml môi trường SH 1/5 dịch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T sau đó nuôi lắc 200vòng/phút 7 đến 10 ngày ở 30oC. 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 2.3.1 Nhuộm Gram Nhỏ một giọt môi trường nuôi cấy có chứa vi sinh vật vào giữa lam kính, giàn đều dịch, cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiếp theo, nhỏ dung dịch tím kết tinh (crystal violet) lên mẫu, để 1 phút. Mẫu được rửa bằng nước cất 2 lần, thấm khô, sau đó nhỏ dung dịch lugon lên mẫu, để yên mẫu trong 1 phút. Cố định mẫu bằng cồn 900 trong 30 giây sau đó để bay hơi tự nhiên đến khô bề mặt. Tiếp theo, nhỏ dung dịch safarin lên mẫu, để yên trong 1-2 phút và rửa lại mẫu bằng nước cất 2 lần, để khô tự nhiên. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần. Vi khuẩn gram âm bắt mầu hồng, vi khuẩn gram dương bắt mầu xanh. 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét Vi khuẩn được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường CNSH1 dịch có chứa dịch chiết đất. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ cặn bẩn rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Sau đó rửa lại sinh khối bằng nước cất 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hũa trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm phosphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Tiếp theo, lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106- 108 tế bào/ ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới. Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, T-butyl. Sau đó, các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ vàng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.4 Phƣơng pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T Bước 1 Lấy 22 ml mẫu bổ sung thêm 2 gam NaCl, 30 ml n-hexan và lắc trong 30 phút. Bước 2 Chiết lấy tương hữu cơ và chất chuyển hóa, cho isopropanol và một hai giọt H2SO4 đặc, rửa bằng nước cất đến pH = 7, thổi khô mẫu bằng N2 sạch đến 1 ml. Bơm dịch vào máy sắc ký khí (GC) với detechter ECD. 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật Màng tế bào được phá bằng enzyme lyzozym. Enzyme protease K được dùng để loại bỏ protein. Việc bổ sung thêm các hóa chất như phenol, chloroform, isoamylalcohol nhằm loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa DNA. Thu hồi DNA bằng cách tủa trong cồn hay isopropanol và ly tâm. Các bước được tiến hành theo thứ tự sau: Bước 1: Thu sinh khối tế bào vào eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400µl dịch đệm lysis. Thành phần đệm: 20 mM Tris-Cl (pH 8) 50 mM NaCl 10 mM EDTA Bước 3: Bổ sung lyzozyme, ủ ở 37oC trong 15-30 phút. Bước 4: Bổ sung protease K, ủ ở 56oC trong 1 giờ. Bước 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bước 6: Bổ sung chloroform : isoamylalcohol (tỷ lệ 1: 1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bước 7: Hút dịch phía trên chuyển sang eppendorf mới. Tủa DNA bằng ethanol 100% giữ ở -20oC trong 2-3 giờ. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bước 8: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu kết tủa DNA. Bước 9: Rửa DNA bằng cồn 70%. Bước 10: Làm khô, hoà tan trong nước khử ion vô trùng. Bước 11: Loại RNA bằng RNase (10 mg/ml), ủ 37oC trong 2 giờ. 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi là một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại. Thành phần phản ứng Buffer MgCl2 2,5 µl dNTPs ( 10mM ) 2,5 µl Mồi xuôi 27 F 1 µl Mồi ngược 1492 R 1 µl Taq polymeraza 0,2 µl DNA 1 µl MgCl2 ( 10 mM ) 3 µl H2O 13,8 µl Tổng thể tích 25 µl Chu trình nhiệt độ Bước 1 95oC trong 5 phút Bước 2 94oC trong 1 phút Bước 3 55oC trong 1 phút Bước 4 72oC trong 1 phút 30 giây Bước 5 Lặp lại 30 lần từ bước 2 đến bước 4 Bước 6 72oC trong 8 phút Bước 7 4oC để qua đêm Trình tự cặp mồi Mồi xuôi 27F: 5’ AGA GTT TGA TTC MTG GCT CAG 3’ Mồi nguợc 1492R: 5’ GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3’ Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là những đại phân tử luôn tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương. Trong các thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose 1%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và tiến hành soi DNA dưới ánh sáng tử ngoại. 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA Sản phẩm PCR đặc hiệu được gắn vào vector pCR2.1 nhờ T4 DNA ligase. Phản ứng thực hiện ở 14oC trong 18 giờ. Thành phần phản ứng như sau: Nước đề ion vô trùng 4,0 µl Đệm T4 DNA ligase 1,0 µl Sản phẩm PCR 2,5 µl Vector pCR 2.1 (25mg/µl) 1,5 µl T4 DNA ligase 1,0 µl Đảo trộn rồi cho vào tủ lai 14oC trong 18 giờ. 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli Bước 1: Cho 1,5 µl dịch vector pCR2.1 đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa 50 µl tế bào khả biến Escherichia coli INVαF’, ủ trong đá 30 phút. Bước 2: Sốc nhiệt ở 42oC trong 30 giây. Bước 3: Bổ sung 250 µl môi trường SOC, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ. Bước 4: Cấy gạt dịch sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/ml và X-Gal 50 mg/ml). Bước 5: Nuôi ở 37oC trong 18 giờ. Bước 6: Bảo quản ở 4oC để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Trên môi trường LB có bổ sung X-gal, những khuẩn lạc có màu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai. 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) Sau khi nuôi khuẩn lạc đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, khuẩn lạc tròn màu trắng đã được chọn ra để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi 27F-1492R nhắm xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen quan tâm hay không. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 14.75 2 Buffer PCR (NH + 4) 2.5 3 Mgcl2 3 4 dNTPs 2.5 5 Mồi xuôi 27F 1 6 Mồi ngược 1492R 1 7 Taq polymerase 0,25 8 Template Khuẩn lạc Tổng 25 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( O C) Thời gian Chu Kỳ 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 1 phút 32 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas Bước 1: Cho 1,5ml dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn được chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Bước 2: Đổ dịch, úp eppendorf trên giấy thấm. Bổ sung 250l đệm P1 vortex cho đến khi sinh khối tan hết. Bước 3: Bổ sung 250l đệm P2 và đảo nhẹ 15 lần cho tới khi dịch trở nên trong. Bước 4: Bổ sung 350l đệm N3 và đảo nhẹ 15 lần. Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 6: Chuyển dịch sang cột QIAprep, cột đặt trên eppendorf 2ml. Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 8: Bổ sung 500l đệm PB và ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 9: Bổ sung 750l đệm PE, để trong 3 phút. Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 11: Ly tâm lại một lần nữa 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước 12: Chuyển cột sang eppendorf mới, bổ sung 60ul nước deion. Để trong 1 phút. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa