Luận văn Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

hương, cần đánh giá tiền lâm sàng bằng các thử nghiệm trong labo về tác động của chúng đối với các tế bào da như nguyên bào sợi và tế bào sừng. Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng. Tế bào gốc trung mô có các dấu ấn bề mặt và dấu ấn gen tương tự như tế bào gốc trung mô tủy xương. Điều thuận lợi hơn là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xương. Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng được ứng dụng rộng rãi trong sửa chữa và tái tạo mô. Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thương da, chúng tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tương tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của người có thúc đẩy sự tăng sinh và di cư không. Hơn nữa, sự tiết collagen được đánh giá và hoạt động di cư của nguyên bào sợi cũng như tế bào sừng được nghiên cứu trên mô hình vết thương thực nghiệm in vitro. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ADSCs: tế bào gốc được phân lập từ mẫu mô mỡ. 30 mẫu mô mỡ được thu từ bệnh nhân di chứng bỏng cần phẫu thuật ghép da. Tế bào sừng và nguyên bào sợi đã được phân lập từ mẫu da thu từ phẫu thuật cắt bỏ bao quy đầu của 05 trẻ em. Các bệnh nhân hoặc người nhà bệnh nhân này đều đồng ý hiến phần mỡ hoặc phần da bỏ đi dùng cho nghiên cứu và được chấp nhận bởi ban đạo đức nghiên cứu y sinh bệnh viện. Tiêu chuẩn người hiến mô đạt yêu cầu về sàng lọc HIV, HBsAg, HCV và giang mai với test nhanh âm tính. Tiêu chuẩn về pháp lý: Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân đồng ý hiến phần mô bỏ đi trong các phẫu thuật điều trị di chứng bỏng. Các mẫu hồ sơ hiến mô được ghi chép theo quy định của Bộ Y tế được hội đồng đạo đức trong nghiên cứu sinh y của Viện Bỏng Lê Hữu Trác thông qua. 2.1.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu - DMEM và DMEM-F12 do hãng Gico/Life tech cung cấp - Huyết thanh bào thai bê (FBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp - Collagenase do hãng Gico/Life tech cung cấp - Epilife do hãng Gico/Life tech cung cấp - EDGS do hãng Gico/Life tech cung cấp - Antibiotic/Antimycotic do hãng Gico/Life tech cung cấp - Trypsin/EDTA do hãng Gico/Life tech cung cấp - Phosphate bufferd saline (PBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp 2.1.3. Trang thiết bị và vật tư - Máy ly tâm, bể ổn nhiệt - Tủ ấm CO2 (Incubator) hoạt động ở 370C, CO2 5% - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu - Kính hiển vi đảo ngược - Thiết bị để thanh trùng khô, thiết bị thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực) - Ống ly tâm falcol thể tích 15ml, 50ml, falcol do hãng Corning cung cấp - Đĩa petri đường kính 60mm, 100mm do hãng Corning cung cấp - Pipet aid, đầu pipet loại 5ml, 10ml, 25ml - Găng tay vô trùng - Các dụng cụ khác 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào Mô mỡ dưới da được lấy vô trùng từ phòng mổ và bảo quản ngay trong tube môi trường, giữ ở 40C và vận chuyển về labo. Môi trường bảo quản mô mỡ bao gồm DMEM có 500U/ml penicillin, 500microgam/ml streptomycin và amphotericin B. Xử lý mô mỡ và phân lập tế bào gốc tại labo nuôi cấy tế bào: - Rửa mô mỡ 3 lần bằng PBS để loại bỏ các cấu trúc thuộc mạch máu, da... - Mô mỡ được phân tách bằng Collagenase, nồng độ collagenase trong tube mô mỡ là 0.15%. - Đặt tube hỗn dịch trên vào incubator khoảng 30 phút, cứ sau 10 phút lại lắc một lần, sau 30 phút thêm FBS để dừng tác dụng của enzym - Ly tâm tốc độ 1500rpm trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi và thu được tế bào lắng dưới đáy tube. - Đếm số lượng tế bào thu được trong buồng đếm Nauebaer để xác định nồng độ tế bào có trong hỗn dịch thu được. - Cấy vào đĩa petri sao cho đạt 20.000 TB/cm2 bề mặt nuôi cấy. - Mỗi đĩa d=100mm sau đó được bổ sung ít nhất đủ 8ml môi trường DMEM/1% kháng sinh/10% FBS - Đặt đĩa vào incubator ẩm, nhiệt độ 370C và CO2 5% - Quan sát tế bào và tiến hành thu tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin khi mật độ tế bào đạt 80% diện tích che phủ. - Các tế bào thu được sau đó được đếm xác định số lượng. Sau đó, bảo quản lạnh sâu hoặc cấy trở lại đĩa nuôi với mật độ 5000 TB/cm2 cho tới thế hệ thứ 5 để cung cấp cho nghiên cứu tiếp theo. 2.2.2. Nhân rộng tế bào - Kiểm tra tình trạng tế bào, đánh giá mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy (độ che phủ đạt khoảng 70% có thể cấy chuyển làm thí nghiệm) - Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa bằng dung dịch đệm PBS - Thêm dung dịch Trypsin/EDTA 1X với thể tích 0,1ml/cm2, đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm với tiêu chuẩn nhiệt độ 370C, CO2 5% trong 5 phút. Sau khi lấy ra ngừng quy trình trypsin bằng 0,1 ml/cm2 môi trường nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lượng tế bào. - Ly tâm ở tốc độ 1600 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm và bổ sung môi trường nuôi cấy. - Khối tế bào thu được cấy chuyển sang đĩa khác để gia tăng số lượng tế bào hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Xác định số lượng tế bào: Phương pháp này sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer. Sau khi tiến hành quy trình trypsin, lấy 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin pha tỷ lệ 1:1 với chất nhuộm màu Trypan-blue. Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm màu bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi. Số lượng TB được tính theo công thức: C = n/v n: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm v: thể tích đếm (ml) C: mật độ tế bào (TB/ml). Buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3 = 1.10-4 ml do đó công thức tính là: C = n x 104/ml 2.2.4. Xác định khả năng tạo dòng (colony) của tế bào Để xác định tính gốc của tế bào thông qua khả năng tự đổi mới của chúng, hỗn dịch các tế bào đơn lẻ được chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có đường kính 60mm ở mật độ là 50 TB/cm2. Đĩa nuôi cấy sau đó được duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony. Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó được cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào được xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào. Khả năng tạo dòng được tính toán theo tỷ lệ % số colony đạt được so với số tế bào được cấy. Cụ thể các bước tiến hành như sau: Bước 1. Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa có đường kính 60mm với mật độ tế bào 50TB/cm2, mỗi đĩa cho 4mm môi trường nuôi cấy, thay môi trường sau mỗi 3 ngày. Bước 2. Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về: Hình thành colony chưa? Mỗi colony có khoảng bao nhiêu tế bào? Hình thái tế bào? Bước 3. Nhuộm giemsa sau 3 tuần Bước 4. Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào được cấy, mỗi colony khi đó được xác định là có từ 50 tế bào trở lên. 2.2.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và di cư của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng được đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các loại tế bào nhưng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán. Hình 2. Mô phỏng thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ bằng phương pháp đồng nuôi cấy Tế bào gốc mô mỡ được cấy trên insert chứa màng polycarbonate của đĩa transwell, màng polycarbonate có kích thước lỗ là 0,45micromet và được tráng collagen, nguyên bào sợi và tế bào sừng được cấy ở khoang phía dưới. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mỡ đến hai loại tế bào da nuôi cấy này được đánh giá qua sự tăng sinh tế bào da và khả năng di cư của chúng theo cách thức mô tả dưới đây. 2.2.5.1. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104 TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm DMEM/1%FBS/1%AB. Nguyên bào sợi được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh. Tế bào MSC được cấy trên insert với mật độ 5000 TB/cm2 và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 11 ngày trước khi đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi, khi đó MSC đạt 70-80% độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa. Tấm tế bào gốc trung mô chứa cả insert sau đó được đặt vào các giếng nguyên bào sợi và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy MSC mới. Thí nghiệm đối chứng gồm: Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào. Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x103TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 6 ngày trước khi đồng nuôi cấy. Tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, các giếng nguyên bào sợi được trypsin và đếm số lượng tế bào cũng như xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu được. 2.2.5.2. Đánh giá ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mô mỡ lên khả năng di cư của nguyên bào sợi Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104 TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) được bổ sung 2mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B (Invitrogen/GIBCO), 10% FBS (PAA). Nguyên bào sợi được cấy trong 6 ngày (đạt 90% độ che phủ) trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di cư làm liền vết cạo. Mô hình thí nghiệm đồng nuôi cấy MSC nuôi cấy trong insert trong 11 ngày, mật độ cấy 50TB/cm2 Nguyên bào sợi/ tế bào sừng nuôi cấy trong giếng trong 6 ngày, mật độ cấy 50.000TB/giếng Môi trường nuôi cấy MSC Đồng nuôi cấy, nguyên bào sợi/tế bào sừng và tấm MSC Tạo vết cạo nguyên bào sợi - Phân tích thời gian liền vết cạo - Đếm số lượng tế bào Từ các thí nghiệm phân tích chúng tôi xây dựng được quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ như sau: Lô A Lô B Lô C D1 Tạo tấm tế bào gốc mỡ bằng cách cấy 5000 TB/cm2 trên insert của transwell DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi 2 ngày Tạo tấm nguyên bào sợi bằng cách cấy 5000 TB/cm2 trên insert của transwell DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi 2 ngày D2 Cấy nguyên bào sợi vào khoang dưới giếng transwel với số lượng 50.000TB/giếng trong môi trường DMEM/1%FBS/1%AB Cấy nguyên bào sợi vào khoang dưới giếng transwel với số lượng 50.000TB/giếng trong môi trường DMEM/1%FBS/1%AB Cấy nguyên bào sợi vào khoang dưới giếng transwel với số lượng 50.000TB/giếng trong môi trường DMEM/1%FBS/1%AB D5 Đồng nuôi cấy, đặt insert có TB gốc mỡ vào giếng Đồng nuôi cấy, đặt insert có nguyên bào sợi vào giếng Đồng nuôi cấy, đặt insert không có tế bào vào giếng D7 - Trypsin nguyên bào sợi ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin - Trypsin nguyên bào sợi ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin - Trypsin nguyên bào sợi ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin 2.2.5.3. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tăng sinh tế bào sừng Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3×104 TB/giếng trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS trong 24 giờ để tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy. Sau đó tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS. Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh. Tế bào gốc mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm2 và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80%-90% độ che phủ. Tấm tế bào gốc mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM chỉ có 2% FBS. Thí nghiệm đối chứng gồm: Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào. Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x103 TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy. Tại các thời điểm 24, 48 giờ và 72 giờ, các giếng tế bào sừng được trypsin và đếm số lượng tế bào cũng như xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu được. 2.2.5.4. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến sự di cư tế bào sừng Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di cư. Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3x104 TB/giếng và duy trì trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS. Môi trường nuôi cấy được thay thế sau mỗi 2 ngày và theo dõi cho đến khi tế bào sừng đạt 100% độ che phủ (3 ngày) thì dùng đầu pipet cạo bề mặt tế bào để tạo các khoảng trống tương tự nhau, rửa tế bào bằng PBS. Sau đó, tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS. Tế bào gốc mô mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm2 và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80%-90% độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa. Tấm tế bào gốc mô mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng. Khoang trên là tấm tế bào gốc mô mỡ được bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2% FBS. Khoang dưới là tế bào sừng với vết cạo đồng kích thước được duy trì trong môi trường Epilife đơn thuần. Thí nghiệm đối chứng gồm 1/ nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào, 2/ insert có tế bào là nguyên bào sợi da và duy trì trong môi trường tương tự với tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2% FBS. Cứ sau mỗi 24 giờ, các vết cạo ở khoang tế bào sừng được chụp ảnh và phân tích khoảng cách thu hẹp do tế bào sừng di cư. A B C D Hình 3. Tạo vết thương in vitro. Nguyên bào sợi được nuôi cho đến khi đạt 100% độ che phủ (A), tạo vết cạo với kích thước đồng nhất 2mm bằng dụng cụ nhựa (B). Tế bào sừng được nuôi cho đến khi đạt 100% độ che phủ (C). Tạo vết cạo với kích thước đồng nhất 2mm bằng dụng cụ nhựa (D).(50X) Từ các thí nghiệm phân tích chúng tôi xây dựng được quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc đến tế bào sừng như sau: Lô A Lô B Lô C D1 Tạo tấm tế bào gốc mỡ bằng cách cấy 5000 TB/cm2 trên insert của transwell với DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi 2 ngày Tạo tấm nguyên bào sợi bằng cách cấy 5000 TB/cm2 trên insert của transwell DMEM/10%FBS/1%AB Thay môi trường sau mỗi 2 ngày D2 Cấy tế bào sừng vào khoang dưới giếng transwell với số lượng 30.000TB/giếng trong môi trường Epilife Cấy tế bào sừng vào khoang dưới giếng transwell với số lượng 30.000TB/giếng trong môi trường Epilife Cấy tế bào sừng vào khoang dưới giếng transwell với số lượng 30.000TB/giếng trong môi trường Epilife D5 Đồng nuôi cấy, đặt insert có TB gốc mỡ vào giếng Đồng nuôi cấy, đặt insert có nguyên bào sợi vào giếng Đồng nuôi cấy, đặt insert không có tế bào vào giếng D7 - Trypsin tế bào sừng ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin - Trypsin tế bào sừng ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin - Trypsin tế bào sừng ở khoang dưới và đếm số lượng - Chụp ảnh trước khi trypsin 2.2.6. Phương pháp chế tạo tấm tế bào gốc mỡ cho thí nghiệm đồng nuôi cấy Tế bào gốc được cấy trên các giá đỡ là các tấm vật liệu nuôi cấy hoặc che phủ vết thương. Khi tế bào bám dính và đạt mật độ yêu cầu, tấm vật liệu được sử dụng trong phân tích và đánh giá tác dụng. Các bước cụ thể như sau: - ADSCs được tinh lọc và nhân rộng nhờ các lần cấy chuyển đến P5 thì sử dụng để chế tạo tấm tế bào gốc. - Tế bào được cấy trên màng polycarbonat có kích thước lỗ 3µm và được tráng collagen typ I. Mật độ tế bào cấy ban đầu là 50TB/cm2. - Duy trì tế bào trong môi trường nuôi cấy ADSCs như đã mô tả bao gồm: DMEM có 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B. - Các đĩa nuôi cấy được đặt trong tủ ấm ẩm ở 370C có 5% khí CO2. - Môi trường nuôi cấy được thay sau mỗi 3 ngày và theo dõi sự phát triển của tế bào qua kính hiển vi đảo ngược. - Khi tế bào đạt 90% độ che phủ thì coi như tấm tế bào đã được chế tạo và bắt đầu cho các thử nghiệm tiếp theo. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào Xử lý mô mỡ để phân lập tế bào gốc trung mô A B C 3 2 1 D Hình 4. Tách mô mỡ bằng enzym collagenase. (A) Thu mô mỡ. (B) Rửa sạch mô mỡ theo quy trình. (C) Cắt lọc mô mỡ. (D) Mô mỡ sau khi tách bằng enzym collagenase phân thành 3 lớp đặc trưng sau khi ly tâm: (1) lớp mỡ, (2) dịch nổi, (3) sinh khối tế bào. Bảng 1. Số lượng tế bào thu được từ mô mỡ Chỉ tiêu Giá trị Min-Max ± SD Số lượng tế bào thu được/gam mô 2,4x106 - 2,7x106 2,46x106 ± 1,4 Tỷ lệ % tế bào sống 96,3 - 97,2 96,4 ± 1,7 Nhận xét: Với các mẫu mô xử lý và phân lập thành công, số lượng tế bào thu được sau khi xử lý mẫu mô trung bình là 2,4x106 ± 1,4/gram mô. Tỉ lệ tế bào sống trung bình là 96,4± 1,7%. Tế bào cơ bản có hình dạng tương tự như nguyên bào sợi có hình sao với các nhánh bào tương dài. Các tế bào thuộc loại tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy của đĩa nhựa, và chỉ tạo đơn lớp, không thấy có sự chồng lấn lên nhau kể cả khi đã đạt 100% độ che phủ. Tế bào gốc mỡ bắt đầu dính xuống bề mặt nuôi cấy sau khoảng 4-6 giờ khi đĩa nuôi được đặt trong tủ ấm 370C và 5% khí CO2. Đầu tiên, hình dạng tế bào là hình tròn nhỏ hoặc hình không xác định được quan sát thấy cùng với một số tế bào máu đơn nhân. Dần dần, các tế bào bẹt và giãn rộng ra xung quanh và có hình thoi dài hoặc ngắn và sau đó là hình nhiều góc cạnh ở thời điểm 48 giờ. A 2 1 B Hình 5. Đĩa tế bào sau 48h nuôi cấy. Mẫu số 2, 50X. - (5.A )Một số tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy, dịch nổi có nhiều mảnh vỡ của mô, tế bào và cả mỡ. - (5.B)Sau khi thay môi trường nuôi cấy mới, quan sát rõ các tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy (1), không bào mỡ (2). A B Hình 6. Tế bào sau 4 và 10 ngày nuôi cấy. Mẫu số 2, 50X. - (6.A) Sau 4 ngàyTế bào mọc nhiều hơn, không còn các mảnh vỡ tế bào. - (6.B)Tế bào phát triển mạnh, sau 10 ngày, độ che phủ đạt 80% trypsin để cấy chuyển. A B Hình 7. Tế bào gốc mỡ trên kính hiển vi đảo ngược 50X(A) và 100X(B). (A)(B). Đặc tính của tế bào gốc mô mỡ. Tế bào bám dính, có hình dạng nguyên bào sợi, mọc đơn lớp. Hình thái tế bào ở ngày thứ 7. Tế bào phát triển có độ che phủ đạt khoảng 20% A B Hình 8. Hình thái tế bào gốc mỡ sau khi nhuộm Giemsa. (100X) Quan sát trên kính hiểm vi đảo ngược 100X ở hình 8 (A)(B) ta thấy tế bào có hình sao, bào tương trải rộng với nhiều nhánh, có nhánh dài. Nhân tế bào hình tròn và hình trứng, ranh giới bờ nhân rõ rệt, nhân bắt màu kiềm đậm. Khi nhuộm giemsa, tế bào bắt màu hồng nhạt, nhân hình trứng và bắt màu kiềm đậm thể hiện tế bào có khả năng phân chia mạnh. Tế bào từ các mẫu mô đều có hình dạng tương tự, không có nhân quái nhân chia. 3.2. Khả năng tạo dòng của tế bào (CFU-F) Bảng 2. Khả năng tạo dòng của tế bào mới tách ra từ mô mỡ (n=5) Thế hệ tế bào Số tế bào Số CFU -F tối thiểu Số CFU-F tối đa %CFU-F Khối tế bào mới tách từ mô mỡ thử nghiệm 50 TB/cm2 09 15 14,6 Khối tế bào tính trong 1gram mô mỡ 8,8x105 4.200 5.100 14,6 Nhận xét: - Khối tế bào mới tách từ mô mỡ thử nghiệm (50TB/cm2): Số CFU-F tối thiểu là 09, tối đa là 15, tỷ lệ %CFU-F là 14,6 - Khối tế bào tính trong 1 gram mô mỡ (8,8x105): Số CFU-F tối thiểu là 4200, tối đa là 5100, tỷ lệ % CFU-F là 14,6 Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào xác định khả năng tạo tập đoàn (colony) của các tế bào phân lập từ mô mỡ. Khả năng tạo colony là một trong những thí nghiệm thể hiện tế bào có khả năng tự đổi mới nhưng vẫn duy trì được tính di truyền của tế bào. Các tế bào đầu dòng sẽ tạo colony, thí nghiệm này đánh giá bằng test CFU-F. Kết quả cho thấy số lượng tế bào có khả năng sinh tập đoàn của khối tế bào mới tách từ mô mỡ là 7,5% ± 1,8%. Các thế hệ từ P1 - P5 đạt 16,5-18,6% tùy vào thế hệ tế bào thử nghiệm. A B Hình 9. Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5. (50X) - (A ) Ngày thứ nhất, tế bào ít và mọc rải rác. - (B) Ngày thứ 5 đã xuất hiện colony. A B Hình 10. Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20. (50X) - (A) Ngày thứ 10, các colony rõ hơn. - (B) Ngày thứ 20, colony dày và các tế bào hình thoi. Bảng 3. Khả năng tạo CFU-F theo các thế hệ tế bào (n=5) Thế hệ tế bào Số tế bào/cm2 Số CFU %CFU-F P1 50 9-15 14,6 ± 1,5 P3 50 15-18 16,5 ± 1,9 P5 50 14-19 17,3 ± 1,8 Nhận xét: - Các tế bào có xu hướng tạo colony nhiều hơn khi tăng số lần cấy chuyển lên đến P3, P5. - Như vậy các tế bào đã dần được tinh lọc, những tế bào không thuộc trung mô sẽ chết trong các lần cấy chuyển đầu tiên. - Colony tế bào gốc mỡ thuộc dạng colony fibroblast, các tế bào không đứng thành cụm như các tế bào biểu mô. A B Hình 11. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (A)(B) Kết quả khả năng tạo CFU-F của đề tài cao hơn một số tác giả khác có thể do mẫu mô chúng tôi lấy đa số từ người còn nhỏ tuổi, còn các tác giả khác lấy mô mỡ từ các bệnh nhân thẩm mỹ thành bụng có tuổi đời cao hơn. Cùng phương pháp đánh giá, có tác giả chỉ đạt 15% (C. Dromard và CS 2011). 3.3. Ảnh hưởng tế bào gốc mỡ lên sự tăng sinh và di cư tế bào da qua thí nghiệm đồng nuôi cấy 3.3.1. Tác động của tế bào gốc mỡ đến nguyên bào sợi Bảng 4. Ảnh hưởng của tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợi Lô nghiên cứu Số lượng nguyên bào sợi đồng nuôi cấy ngày thứ 2 (x104/giếng 10cm2) Min – Max ± SD Lô A (n=10) 6 – 7 6,8 ± 0,5 Lô B (n=10) 4 – 6 5,5 ± 0,9 Lô C (n=10) 3 – 5 4,6 ± 0,6 - Lô A : Là lô nghiên cứu đồng nuôi cấy nguyên bào sợi ở giếng với màng giá đỡ chứa tế bào gốc mỡ . - Lô B : Là lô đối chứng dương đồng nuôi cấy nguyên bào sợi ở giếng với màng giá đỡ chứa tấm nguyên bào sợi. - Lô C : Là lô nuôi cấy nguyên bào sợi ở giếng và màng giá đỡ đơn thuần không có tế bào. Nhận xét: Số lượng nguyên bào sợi thu được ở lô có tấm tế bào gốc mô mỡ cao hơn so với lô có tấm nguyên bào sợi và lô nghiên cứu không có tấm tế bào. Hình 12. Biểu đồ so sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi cấy tấm tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ở ngày thứ 2. D0 D2 A B C Hình 13. Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi (50X) Sau 2 ngày thí nghiệm đồng nuôi cấy, chúng ta thấy - Lô A, tấm tế bào gốc mỡ làm tăng số lượng nguyên bào sợi trong thí nghiệm đồng nuôi cấy. - Lô B (đồng nuôi cấy tấm nguyên bào sợi và nguyên bào sợi), mật độ TB tăng không đáng kể. - Mật độ ít nhất ở Lô C (chỉ nuôi cấy nguyên bào sợi mà không có tấm tế bào). - Mức độ làm gia tăng số lượng nguyên bào sợi trong sự có mặt của tấm ADSCs là 23,6%-47,87% cao hơn so với việc không có tấm tế bào hoặc có tấm tế bào nhưng là tấm nguyên bào sợi. Bảng 5. Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lượng khi có tấm tế bào gốc Giếng nguyên bào sợi Số lượng tế bào(x104)/giếng Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Lô A (n=10) 4,2 6,8 11,5 Lô C (n=10) 3,5 4,6 7,8 p >0,05 <0,001 <0,0001 Nhận xét: Thí nghiệm về sự tác động của tấm TB gốc lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi được nuôi cấy trong mỗi giếng của đĩa 6 giếng ban đầu là 50.000 tế bào ở thời điểm 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy và theo dõi bằng đếm tế bào ở ngày thứ 1, thứ 2 và thứ 3 trong 5 thí nghiệm độc lập đều thấy: Ở giếng có tấm TB gốc thì ngày thứ 2 và thứ 3, số lượng nguyên bào sợi ở giếng có tấm TB gốc tăng lên đáng kể so với giếng không có tấm TB gốc, với p<0,001. Bảng 6. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin Giếng nguyên bào sợi Tỷ lệ sống của tế bào (%) Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Lô A (n=10) 96,3 ± 2,3 96,5 ± 1,8 96,2 ± 2,2 Lô C (n=10) 96,4 ± 2,5 97,2 ± 2,1 96,9 ± 2,1 P >0,05 >0,05 >0,05 Nhận xét: Không có sự khác nhau về tỷ lệ sống của nguyên bào sợi giữa mẫu nghiên cứu có tấm tế bào gốc và mẫu đối chứng không có tấm tế bào gốc. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi giữa mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứng ở các thời điểm 1 ngày, 2 ngày và 3 ngày đồng nuôi cấy giữa nguyên bào sợi và tấm tế bào gốc đều ổn định ở mức 96-97%. Hình 14. Sự gia tăng số lượng nguyên bào sợi theo thời gian. 3.3.2. Tác động của tấm tế bào gốc mỡ đến tế bào sừng Bảng 7. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừng Lô nghiên cứu Số lượng tế bào sừng ở ngày đồng nuôi cấy thứ 2 (x104/giếng 10cm2) Max Min TB SD Lô A (n=10) 9 7 8,2 0,9 Lô B (n=10) 13 9 10,7 1,8 Lô C (n=10) 5 3 4,3 1,1 - Lô A: Là lô nghiên cứu đồng nuôi cấy tấm tế bào gốc mỡ và tế bào sừng ở giếng. - Lô B: Là lô đối chứng dương đồng nuôi cấy có tấm tế bào là nguyên bào sợi đồng loại và tế bào sừng ở giếng. - Lô C: Là lô nuôi cấy tế bào sừng ở giếng và không có tấm tế bào mà chỉ có màng giá đỡ đơn thuần. Nhận xét: Mật độ tế bào có tăng ở thí nghiệm Lô B (đồng nuôi cấy tấm nguyên bào sợi và tế bào sừng), mật độ TB giảm dần ở Lô A (đồng nuôi cấy tấm tế bào là TB gốc mỡ với tế bào sừng), và mật độ ít nhất ở Lô C (chỉ nuôi cấy tế bào sừng). Hình 15. So sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi cấy tấm tế bào gốc với tế bào sừng D1 D3 A B C Hình 16. Tác động của tấm tế b