Luận văn Nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây (solanum tuberosum l.)

và Phát triển Cây có củ - Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm – Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Các hóa chất chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích 1 Các muối đa lượng, vi lượng và vitamin theo công thức môi trường khoáng cơ bản MS Bio Basic Canada INC. Môi trường nuôi cấy Sorbitol 2 TriZol Invitrogen, USA Tách chiết RNA tổng số EDTA, Chloroform, Isopropanol Sigma Ethanol Merck Ultrapure diluted water Invitrogen Agarose Sigma Điện di Universal DNA Ladder DNA Loading Dye 6X KAPA 10X BlueJuice Invitrogen 4 5X buffer DNase BioLabs Xử lí DNA DNAse I 21 STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích 5 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific Tổng hợp cDNA 6 SYBR Green AB, Mỹ Kiểm tra chất lượng cDNA và sự biểu hiện gen Cặp mồi GADPH 3’, GADPH 5’, ef1, P1, P2, P3 Macrogen Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật và các hóa chất khác như: aga, sucrose, ethanol, axit acetic, axit boric, EDTA, ethidium bromide được sử dụng đều có độ sạch phân tích. 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị và máy móc thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu STT Thiết bị Hãng/loại thiết bị 1 Tủ an toàn sinh học Biohazard MDH contamination control 2 Máy nghiền đồng thể mô thực vật Retsch MM40 3 Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R 4 Máy real time PCR Bio-RAD iQ5 5 Tủ lạnh -20oC và -80oC Toshiba 6 Máy soi gel UV BCE 7 Máy đo mật độ quang học Thermo Electron Corporation (CAT 335902) 8 Máy quang phổ định lượng axit nucleic/protein NanoDrop ND100 9 Máy đo pH HoriBa 22 Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân, thiết bị khử trùng, lò vi sóng, bể ổn nhiệt, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các nội dung nghiên cứu được tiến hành như sau: Hình 2.1. Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7. 2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng bằng dung dịch hydropeoxit 15% trong 10 phút và được gieo trên môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau. Các nồng độ sorbitol sử dụng là: 0 mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các hạt nảy mầm trên môi trường có bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn tập chống chịu. Sorbitol là một trong các đường polyol được sản sinh trong tế bào thực vật khi gặp điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Vì vậy, khi sử dụng sorbitol bổ sung vào môi trường sẽ tạo môi trường hạn cho cây mà không có thêm ảnh hưởng nào khác. 23 2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang 2 lá chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm và cao hơn (Hình 2.2). Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu ( Môi trường khoáng cơ bản MS và hàm lượng sorbitol được ghi trong khung) Như vậy, có 10 công thức cấy chuyển được thiết lập. Các công thức chuyển môi trường này được chia thành 4 nhóm để đánh giá: Nhóm đối chứng (ĐC): 0-0 Nhóm thí nghiệm thứ nhất (TN1): 0-50 và 50-50 Nhóm thí nghiệm thứ hai (TN2): 0-100; 50-100 và 100-100 Nhóm thí nghiệm thứ ba (TN3): 0-200; 50-200; 100-200 và 200-200 Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so sánh giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong từng nhóm TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá, số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl. và hàm lượng proline. Hệ số nhân chồi Trong nuôi cấy mô, khoai tây có hai dạng phát sinh chồi. Một là phát sinh trực tiếp chồi mới từ vị trí cắt cấy chuyển vào môi trường. Hai là các chồi ngủ ở nách lá sẽ phát triển thành chồi chính. Trong TN này, số chồi được tính cả hai dạng trên. 24 Hệ số nhân chồi = Chiều cao chồi Chiều cao chồi được đo từ điểm cắt mẫu ban đầu đến điểm cao nhất của chồi sau thời gian nuôi cấy. Chiều cao chồi trung bình được tính theo công thức: Chiều cao chồi = (cm) Số lá Số lá được đếm cụ thể trên mỗi chồi. Số lá trung bình được tính theo công thức: Số lá = Số rễ Khi cấy chuyến, số rễ ban đầu ở mỗi công thức môi trường đồng nhất bằng 0. Số rễ trung bình của mỗi công thức chuyển môi trường được tính theo công thức: Số rễ trung bình= Trọng lượng tươi và trọng lượng khô Mỗi công thức chuyển môi trường lấy 5 mẫu. Mẫu được lấy ra từ môi trường, rửa với nước để loại bỏ thạch. Thấm khô rễ, đặt lên đĩa pettri và cân. Trọng lượng tươi của mẫu được xác định bằng công thức: Trọng lượng tươi = Sau khi mẫu được xác định trọng lượng tươi sẽ được sấy ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và cân lại. Trọng lượng khô của mẫu được xác định bằng công thức: Trọng lượng khô = 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll Hàm lượng Chl. được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J. Porra [60]. Chl. được chiết từ mô lá trong aceton 80% với quy trình như sau: - Cân 10 mg lá vào ống eppi 25 - Thêm 20µl aceton 80% - Nghiền bằng chày nhựa - Bổ sung aceton 80% đến 1,5ml - Ly tâm 2000 rpm trong 1 phút - Thu 1000µl dịch nổi - Đo độ hấp thụ ở bước sóng 646 nm và 664 nm (A646 và A664). Pha loãng dịch đo bằng aceton 80% nếu chỉ số hấp thụ vượt quá giá trị 1. Hàm lượng Chl. được tính toán theo công thức: Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates và cs., 1973) [6]. Quy trình được tiến hành theo các bước sau: - Cân 50 mg lá và thân vào ống eppi, cho vào mỗi ống 1 viên bi nghiền - Nghiền với nito lỏng bằng máy nghiền - Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều ống lên xuống - Ly tâm 7000 vòng/20 phút - Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% (w/v) (Tỷ lệ 1:2) - Thực hiện phản ứng màu: lấy 200µl dịch trong cho vào ống eppi, bổ sung 200 µl axit axetic và 200 µl dung dịch nynhidrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml acetic acid + 1,6 nml phosphoric acid 6M), ủ phản ứng ở 100oC trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng bằng cách làm lạnh trong đá bào ít nhất 15 phút. - Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều - Thu 200 µl dịch nổi - Bổ sung 800 µl toluence - Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520) Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so sánh với đường chuẩn. Quy trình xây dựng đƣờng chuẩn proline được tiến hành như sau: 26 - Pha proline chuẩn trong axit sulfosalicylic 3% (w/v) với các nồng độ: 0 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM và 150 mM. - Thực hiện phản ứng màu và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định proline mẫu. Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm Nồng độ proline (mM) A520 0 0,000 25 0,191 50 0,379 75 0,631 100 0,761 - Xây dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ bằng phần mềm Excel 2007 (Hình 2.3). Hình 2.3. Đường chuẩn proline - Mối tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ được thể hiện bằng công thức: Y= 0,007x – 0,001 Trong đó: 27 x là nồng độ proline y là độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520) Vậy công thức xác định nồng độ proline là: x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM) Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức: Hàm lượng proline (µg/mg) = Trong đó: x: nồng độ proline (mM) V: thể tích dịch chiết proline (ml) HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu tươi (mg) 2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy mô, hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50 mM mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến hành xác định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thu được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và môi trường không có sorbitol ( mẫu ĐC). Quy trình xác định biểu hiện một số gen mã hóa yếu tố phiên mã được tiến hành theo sơ đồ hình 2.4. 28 Thu mẫu Chọn gen đích Tách RNA tổng số Thiết kế mồi Kiểm tra, xác định hàm lượng RNA tổng số Xử lý DNA Tổng hợp cDNA Kiểm tra chất lượng cDNA Xác định biểu hiện của các gen đích Xử lý số liệu Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã 2.2.5.1. Thu mẫu Quá trình thu mẫu được tiến hành như sau: - Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol. - Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h bằng cách cân 120 mg (±5 mg) mẫu thân và lá vào các ống eppi đã có bi nghiền và thả ngay vào nitrogen lỏng. Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu (tủ -70oC) hoặc trong nitrogen lỏng cho đến khi tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo. 2.2.5.2. Tách RNA tổng số Quy trình tách RNA tổng số được tiến hành theo các bước sau [44]: - Nghiền mẫu trong điều kiện nitrogen lỏng bằng máy nghiền mẫu thực vật Restch Mill tốc độ 25 Hz trong 1 phút. - Lấy ống eppi ra khỏi nitrogen lỏng cho vào bình đá bào, chờ 1-2 phút, làm ấm nắp ống bằng tay, mở từ từ, để ống trên giá để ống eppi. 29 - Thêm 500 µl TRIzol vào mỗi ống. Vortex kỹ. - Ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút sau khi xong mẫu cuối cùng - Thêm 200 µl chloroform vào mỗi mẫu. Vortex. - Ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút. - Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC. Dung dịch tách 3 pha. - Chuyển dịch nổi sang ống mới (Chỉ thu pha dịch trong tránh hoàn toàn pha trắng sữa thứ 2). - Chuẩn bị hỗn hợp isopropanol và NaCl 2 M (1:1) để lạnh 4oC. - Bổ sung hỗn hợp vào dịch chiết với tỉ lệ 2:1. Lắc nhẹ ống bằng cách đảo lên xuống nhẹ tay. - Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC. - Đổ phần dịch ra cốc thủy tinh, giữ lại tủa. - Rửa tủa 2 lần với 500 µl ethanol 70% bằng ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC. - Để khô tủa ở nhiệt độ phòng. - Hòa tan tủa trong 40 µl nước RNase – free - Lắc 300 U/min trong 10 phút Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose và xác định hàm lượng, độ tinh sạch. 2.2.5.3. Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose với quy trình như sau: Chuẩn bị bản gel: - Hòa tan 1,7g agarose trong 100 ml TAE 1x - Đun nóng dung dịch để agarose hòa tan hoàn toàn - Để dung dịch nguội bớt đến 50 - 60oC, thêm vào 1 µl redsafe hoặc 5 µl ethedium bromide, lắc đều. - Đổ bản gel với số giếng tương ứng với số mẫu - Mix mẫu {2 µl nước + 3 µl mẫu + 1 µl dye caspa 6x} - Tra mẫu lên giếng theo thứ tự 30 - Chạy bản gel với hiệu điện thế 60V trong 5 phút, rồi chạy tiếp với hiệu điện thế 80V trong 30 phút. - Bản gel sau điện di được quan sát dưới máy soi gel UV để xác định có sản phẩm RNA tách chiết. Hàm lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng (máy đo NanoDrop) và chất lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ. Các mẫu RNA có giá trị A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là những mẫu RNA đạt tiêu chuẩn. 2.2.5.4. Xử lý DNA Các mẫu RNA tổng số thu được có thể còn lẫn DNA hệ gen của khoai tây. Để đảm bảo không còn lẫn DNA hệ gen trong cDNA sau này, mẫu được xử lý bằng DNAse theo quy trình sau: - Từ kết quả hàm lượng RNA trong mẫu, chuẩn bị mẫu 4 µg/17 µl nước DEPC - Thêm vào mỗi mẫu 2 µl buffer DNAse I 10X và 1 µl enzyme DNAse I - Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng - Thêm 1 µl EDTA 110 mM - Ủ 65oC trong 10 phút. Các ống mẫu được cắm sang đá, bước tổng hợp cDNA được tiến hành ngay trong ngày. 2.2.5.5. Tổng hợp cDNA cDNA được tổng hợp theo bộ kit The Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. Bộ kit sử dụng ReverAid Reverse Transcriptase (RT), có sự hoạt động kém của RNase H so với AMV reverse transcriptase. Enzyme này hoạt động chủ yếu ở nhiệt độ 42-45oC và phù hợp cho sự tổng hợp cDNA có độ dài trên 13 kb. Bộ kit sử dụng Thermo ScientificTM RiboLockTM RNase Inhibitor có hiệu quả bảo vệ RNA khỏi sự phân hủy và nhiễm bẩn ở nhiệt độ trên 55oC. Quy trình tổng hợp cDNA được tiến hành như sau: - Thêm các chất sau vào ống eppi khô, không có nuclease, cắm trên đá: 31 Khuôn RNA RNA đã xử lý DNA 2 µg (11 µl) Primer Oligo (dT)18 1 µl Nước không có nuclease 1 µl Tổng thể tích 12 µl - Mix nhẹ nhàng, ly tâm nhanh và ủ 65oC trong 5 phút. Làm lạnh nhanh trong đá bào. - Thêm các chất theo bảng sau: 5X Reaction Buffer 4 µl RiboLock RNase Inhibitor (20U/µl) 1 µl 10 dNTP Mix 2 µl RevertAid MuL V RT (200 U/µL) 1 µl Tổng thể tích 20 µl - Mix nhẹ nhàng và li tâm nhanh - Ủ 60 phút ở 42oC - Dừng phản ứng bằng cách ủ trong 5 phút ở 70oC. 2.2.5.6. Kiểm tra chất lượng cDNA Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR. Cặp mồi được sử dụng để kiểm tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5). Thông tin cặp mồi được trình bày trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra chất lượng cDNA Tên mồi Trình tự mồi Độ dài G3 5’-TTCAACATCATCCCTAGCAGCACT-3’ 24 Nu 3’-TAAGGTCGACAACAGAAACATCAG-5’ 24 Nu G5 5’- AAGGACAAGGCTGCTGCTCAC-3’ 21 Nu 3’- AACTCTGGCTTGTATTCATTCTCG-5’ 24 Nu  Phản ứng qPCR với hai cặp mồi trên được thực hiện với các thành phần trong bảng 2.5. 32 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng SYBR Green 10 Mồi 5’-3’ 4 0,5 µM Mồi 3’-5’ 4 0,5 µM Mẫu cDNA khuôn 2 Tổng thể tích phản ứng 20  Chu trình nhiệt được sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện trong bảng 2.6 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kì 50 o C 2 phút 1 95 o C 10 phút 1 95 o C 15 giây 40 60 o C 1 phút 95 o C 15 giây 1 60 o C 15 giây 95 o C 15 giây Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn là các mẫu có giá trị Ct chênh lệch giữa hai mồi không quá 1,5. Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn được bảo quản ở -20oC cho thí nghiệm tiếp sau hoặc bảo quản lâu dài ở -80 oC. 2.2.5.7. Chọn gen đích Từ trình tự các gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã biết trên cây mô hình A.thaliana. So sánh các trình tự trên với các gen yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) trên ngân hàng gen Plant Transcription factors Database v 3.0. Một số gen của khoai tây tương đồng với các gen liên quan đến tính chịu hạn đã biết ở A. thaliana với mức độ tương đồng > 90% được chọn làm gen đích cho nghiên cứu này (Bảng 2.7). 33 Bảng 2.7. Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu Tên locus gen Gen tƣơng đồng ở A.thaliana Kí hiệu trong đề tài PGSC0003DMG400014309 At4g13040.1 (DREB1A) P1 PGSC0003DMP400026903 At4g27410.2 (RD26) P2 PGSC0003DMT400045091 Atg13040 P3 2.2.5.8. Thiết kế mồi Gen tham chiếu được chọn cho qPCR trong nghiên cứu này là ef1α [55]. Dựa trên trình tự mã hóa (CDS-coding sequence) của các gen đích đã chọn trên (Phụ lục 1, Phụ lục 2 và Phụ lục 3), sử dụng chương trình Primer3Plus để thiết kế mồi đặc hiệu cho nhân đoạn 1 gen với các tiêu chuẩn đầu vào: độ dài của sản phẩm từ 180 - 240 bp; kích thước mồi 20 - 24 bp; Tm của mồi là 60 - 62oC với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi là 1oC và mồi phải chứa 40 - 60 % GC. Thông tin các cặp mồi thiết kế được trình bày trong bảng 2.8. Bảng 2.8. Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra sự biểu hiện của gen đích STT Gen Trình tự mồi Độ dài mồi (bp) 1 ef1α 5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’ 21 Nu 5’-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’ 21 Nu 2 P1 5’-AGCTGGCAGGAAGAAGTTTCGA-3’ 22 Nu 5’-CTTAATGCTAAAGCCGCCACGT-3’ 22 Nu 3 P2 5’-ACGCCTGGATTCAGCCAATTTC-3’ 22 Nu 5’-TTGGTGTTGCCTCGGAAATTCG-3’ 22 Nu 4 P3 5’-CGCAAGCTGTTAGGACTTTGCT-3’ 22 Nu 5’-TGGAAATTGTTGAGCGGTCTGC-3’ 22 Nu 34 2.2.5.9. Xác định tương quan mức độ biểu hiện Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp mồi tương ứng (Bảng 2.8) sử dụng các thành phần phản ứng như trong bảng 2.5 và chu trình nhiệt như bảng 2.6. 2.2.5.10. Xử lý số liệu Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt của Livak và cs 2001 để xác định tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC [46]. Tương quan mức độ biểu hiện của các gen đích đã chọn tại mỗi mốc thời gian nghiên cứu được tính như sau: ΔCt (TN) = Ct (TN/Tg) – Ct (TN/Ref) ΔCt (ĐC) = Ct (ĐC/Tg) – Ct (ĐC/Ref) ΔΔCt = ΔCt (TN) - ΔCt (ĐC) Tương quan mức độ biểu hiện = 2-ΔΔCt (lần) Trong đó: Ct (ĐC/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC (0 mM sorbitol) với cặp mồi của gen đích (P1, P2 và P3). Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC với cặp mồi của gen tham chiếu, elf1α. Ct (TN/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN (50 mM sorbitol) với cặp mồi của gen đích (P1, P2 và P3). Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN với cặp mồi của gen tham chiếu, elf1α. 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7 Môi trường MS có chứa đầy đủ dinh dưỡng (đường, đa lượng, vi lượng, vitamin), là môi trường cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật những cũng thích hợp cho sự phát triển của nấm và khuẩn. Yêu cầu trước tiên của nuôi cấy in vitro là điều kiện vô trùng. Trước khi đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro, mẫu cần được loại bỏ các yếu tố nấm, khuẩn. Trong bước này, ethanol 70% và dung dịch hydropeoxit 15% được dùng để khử trùng hạt khoai tây. Một thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá khả năng khử trùng hạt khoai tây HH7 của các hóa chất trên và kết quả cho tỷ lệ mẫu sống và sạch cao nhất là sử dụng ethanol 70% trong 1 phút để sơ bộ loại bỏ mầm bệnh trên bề mặt, tiếp đó dùng dung dịch hydropeoxit 15% trong 10 phút và rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 lần, mỗi lần 15 phút (số liệu không được trình bày). Hạt khoai tây HH7 sau khi được khử trùng đã được cấy trên môi trường MS có bổ sung sorbitol với các nồng độ 0 mM, 50 mM, 100 mM và 200 mM sorbitol. Các cây con nảy mầm trên các môi trường có sorbitol sẽ được coi là các cây đã qua tập chống chịu ở giai đoạn nảy mầm. Thí nghiệm vừa là bước tạo tập chống chịu cho các cây con khoai tây vừa đánh giá tác động của sorbitol đến khả năng nảy mầm của hạt khoai tây HH7. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây trên các môi trường được đánh giá sau 30 ngày. Kết quả cho thấy, giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt của điều kiện hạn. Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng (Hình 3.1). Tỷ lệ nảy mầm giảm đều theo thứ tự 96,33%; 91,67%; 86,33% tương ứng với nồng độ sorbitol tăng từ 0 mM lên 50 mM và 100 mM. Khi độ hạn tăng cao với hàm lượng sorbitol 200 mM trong môi trường gieo, tỷ lệ nảm mầm chỉ còn 53,33%. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sorbitol khác nhau đến tỷ lệ nảy mầm của hạt ngô đã được Jain và cs công bố [36]. Kết quả cũng có sự tương đồng với kết quả về tỷ lệ nảy mầm của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng của mặn dưới tác dụng của NaCl trong môi trường [44]. 36 Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi trường có bổ sung sorbitol Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt 37 Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy sorbitol trong môi trường không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt mà còn ảnh hưởng đến thời gian nảy mầm và chiều dài thân mầm. Các cây con trong môi trường có nồng độ sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân ngắn hơn (hình 3.2). 3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu Các cây con nảy mầm trên môi trường ĐC (môi trường MS) và môi trường TN (MS có bổ sung lần lượt 50 mM, 100 mM, 200 mM sorbitol) là những cây con đã qua tập chống chịu, được tiến hành cấy chuyển sang môi trường có độ hạn ngang bằng và cao hơn (theo sơ đồ hình 2.2). Sau 4 - 6 tuần khả năng tập chống chịu của cây con khoai tây sẽ được đánh giá thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi; chiều cao chồi; số lá; số rễ; trọng lượng tươi; trọng lượng khô; hàm lượng Chl.; hàm lượng proline. 3.2.1. Hệ số nhân chồi Ở mẫu ĐC, các chồi được cấy chuyển nhưng hoàn toàn không bị ảnh hưởng của hạn (các môi trường nuôi cấy đều không chứa sorbitol) có hệ số nhân tương đối đạt 1,95 lần sau 4 tuần và 4,65 sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3). Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng cao trong môi trường nuôi cấy. Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang các môi trường 50, 100 và 200 mM sorbitol, hệ số nhân chồi giảm dần xuống mức 1,75; 1,35 và 1,08 lần sau 4 tuần. Cũng cùng chiều hướng đó, sau 6 tuần, hệ số nhân giảm từ 4,65 trong công thức 0-0 xuống còn 3,66 và 2,67 lần lượt trong các công thức chuyển 0-50 và 0-100. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, hệ số nhân sau 6 tuần của các mẫu chưa qua tập chống chịu chỉ đạt 1,73. Các mẫu đã qua tập chống chịu cũng không thể hiện khả năng nhân chồi trong nuôi cấy khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo hoặc nâng cao mức hạn. Trong các công thức chuyển mẫu đã qua tập chống chịu, chỉ có công thức 50-100 cho hệ số nhân cao hơn mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường là 0-100, đạt 1,35 sau 4 tuần và 2,67 sau 6 tuần cấy chuyển. Ở các môi trường khác 50 và 200 mM sorbitol không có mẫu đã qua tập chống chịu nào có hệ số nhân chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu. 38 Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 3.2.2. Chiều cao chồi Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 39 Trong công thức chuyển môi trường ĐC (0-0), chiều cao chồi trung bình đạt 7,06 cm sau 4 tuần và 8,48 cm sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.4). Ở những mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM, sau 4 tuần chiều cao chồi giảm xuống 1,5 lần so với môi trường không có sorbitol. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM, chiều cao chồi chỉ còn 1,96 cm, giảm 3,6 lần so với môi trường không có sorbitol sau 4 tuần. Tuy nhiên ở công thức 0-100, chiều cao chồi có giảm so với công thức ĐC nhưng lại cao hơn công thức 0-50. Những mẫu đã qua tập chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không thể hiện rõ sự phát triển về chiều cao chồi. Trong các công thức chuyển môi trường đã qua tập chống chịu chỉ công thức 50-50 cho cây có chiều cao chồi cao gấp 1,1 lần và 1,2 lần so với công thức môi trường đối chứng 0-50 lần lượt sau 4 tuần và 6 tuần. Trong công thức 100-200 cũng cho cây có chiều cao chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường 200 mM sorbitol. Tuy nhiên sự chênh lệch này không đáng kể. Ở những mẫu đã qua tập chống chịu còn lại đều có chiều cao chồi thấp hơn hoặc tương đương với môi trường ĐC. Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân tương đối cao thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối của mẫu in vitro có những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá khối lượng mẫu sẽ cho thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây trong điều kiện hạn nhân tạo. 3.2.3. Số lá Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị thấp nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở các mẫu chưa qua tập chống chịu, sau 4 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng, số lá trung bình tăng 5,44 lá trong môi trường 50 mM sorbitol và 6,75 lá trong môi trường 100 mM sorbitol. Khi nồng độ sorbitol tăng đến 200 mM, số lá trung bình giảm xuống còn 6,1 lá. Tương tự sau 6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM và 100 mM thì số lá trung bình đạt đến 4,51 lá và 5,8 lá, lần lượt. Có một sự khác biệt so với 4 tuần là sau 6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM thì số lá trung bình lại tăng đến 6,61 lá. 40 Ở những mẫu đã qua tập chống chịu, trong các công thức 50-50, 100-100, 100-200 và 200-