Luận văn Nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo

nex Corp.) với pha động là NaOH 1 mM và bộ phận phát hiện xung đẩy. Sự ảnh hưởng của glucose được loại bỏ bằng cách chuyển glucose thành acid gluconic nhờ enzyme glucose oxidase. Tuy vậy, để loại bỏ acid gluconic, cột sắc ký phải được rửa kỹ với NaOH 500 mM trước khi được cân bằng với NaOH 1 mM. Để duy trì sự phát hiện với độ nhạy cao, dòng chảy qua cột cần được trộn với NaOH 250 mM trước khi cho qua bộ phận phát hiện hóa điện tử. Các tác giả đã thực hiện một số cải tiến so với phương pháp của Houben: pha động sử dụng NaOH 15 mM có thể nâng cao độ nhạy của detector, cho phép định lượng chính xác mà không cần bổ sung thêm NaOH; xylose và galactose có khả năng hòa tan tốt khi glucose ở nồng độ cao mà không cần loại bỏ enzyme glucose oxidase, hơn nữa có thể tránh được giai đoạn rửa cột với gradient nồng độ NaOH 500 mM [56]. Các phương pháp định lượng trên có một số nhược điểm, do trong cấu trúc tự nhiên của các pentosan không có chứa các nhóm mang màu, vì thế rất khó để phát hiện và định lượng được ở nồng độ thấp nếu sử dụng các hệ thống phát hiện bình thường. Hầu hết các cột HPLC pha đảo đều không lưu giữ và phân tích pentose một cách đầy đủ, vì thế để duy trì sự phân tích giữa glucose, xylose và giữa glucose, galactose, cần phải điều chỉnh nồng độ NaOH thích hợp. Tuy vậy, sử dụng phương pháp IEC-PAD rất lý tưởng để định lượng các pentosan trong bột mì do có ưu điểm là độ nhạy cao, không cần phải chuyển hóa chất phân tích thành các chất khác, kết quả phân tích thành phần cụ thể, rõ ràng. Trong khi với phương pháp so màu, kết quả dễ bị ảnh hưởng bởi các chất như glucose, không cho được kết quả cụ thể thành Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 17 phần các đường đơn, còn phương pháp sắc ký khí lại có độ nhạy không cao, cần thiết phải chuyển hóa chất phân tích thành chất trung gian khác [56]. Ngoài ra, để phân tích các đường mono, oligo là sản phẩm của các phản ứng thủy phân AX có thể sử dụng các phương pháp sắc ký khác như sắc ký lỏng cao áp. Trong nghiên cứu của Bataillon và tập thể [5], đường đơn xylose, arabinose và glucose trong mẫu AX sau khi được thủy phân được chạy qua cột sắc ký Biorad Aminex column HPX-87H, rửa chiết bằng acid sulfuric 5 mM. Zheng và tập thể [58] đã định tính và định lượng các monosaccharide cấu tạo nên AX bằng pháp sắc ký trao đổi ion cao áp (HPAEC), hàm lượng đường không phải cellulose được xác định bằng tổng hàm lượng các monosaccharide đo được với hệ số nghịch đảo của pentose (0,88) hoặc hexose (0,9) so với hàm lượng polymer. Khi đó hàm lượng AX được tính theo công thức 0,88 x (% arabinose + % xylose). Khối lượng phân tử của AX được xác định bằng sắc ký lọc rây phân tử cao áp (HPSEC). Cerning và tập thể [11] đã định lượng pentosan tổng số trong ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. Pentosan được chuyển thành furfural bằng cách sử dụng HCl 4,15 N và được phân tách bằng chưng cất hơi nước. Phương pháp này có ưu điểm: thủy phân hoàn toàn pentosan thành pentose và sau đó được chuyển thành furfural, sự chưng cất diễn ra không cần sử dụng trực tiếp nhiệt của môi trường phản ứng. Phản ứng định lượng furfural được thực hiện dựa trên phản ứng màu của aniline acetate và được đo ở bước sóng 530 nm. Nhược điểm của phương pháp là tính kém bền của phức màu aniline furfural nếu không sử dung dung dịch đệm thích hợp để làm bền màu của phản ứng. Ngoài ra furfural có thể được định lượng khi có mặt lượng lớn hydroxy methyl furfural (HMF). Acid uronic và glucuronic không ảnh hưởng đến 10% nồng độ pentosan tổng số. Englyst và Cummings [21] đã thủy phân polysaccharide bằng acid sulfuric 2N ở 100oC trong 2 giờ. Các đường đơn sau đó được chuyển thành aldidol acetate và được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí lỏng. Hàm lượng AX được tính bằng tổng arabinose và xylose, trong đó arabinose được thủy phân từ arabinogalactan được ước lượng từ hàm lượng galactose với tỷ lệ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 18 arabinose/galactose là 0,7. AX sau đó được phân tích bằng sắc ký HPSEC sử dụng hai cột Shodex OH-pak SB HQ 804 và 805 [18, 35]. 1.4. Các nghiên cứu tinh sạch và xác định khối lượng phân tử của arabinoxylan Arabinoxylan được tạo ra từ ngũ cốc có khối lượng phân tử thay đổi phụ thuộc vào phương pháp xác định khối lượng phân tử. Các nghiên cứu đã cho thấy AX của lúa mì được chiết bằng nước có khối lượng phân tử khoảng 65-66 kDa khi được phân tích bằng phương pháp lắng kết tủa, trong khi đó nếu phân tích bằng phương pháp sắc ký lọc gel, khối lượng phân tử lớn hơn nhiều từ 800-5.000 kDa, 70-1.000 kDa. AX của lúa mạch đen có khối lượng phân tử khoảng 519-770 kDa khi phân tích bằng phương pháp sắc ký lọc gel cao áp [31]. Vì thế để xác định chính xác khối lượng phân tử của AX là điều không dễ dàng. Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới là phương pháp HPSEC [18, 53, 57]. Dervilly và tập thể [18] đã tinh sạch AX hòa tan trong nước từ dịch chiết thô bằng cách xử lý với enzyme bền nhiệt α-amylase và protease để loại bỏ tinh bột và protein và được tủa hai lần với ethanol 80% rồi xử lý với ethanol 100% và acetone trước khi được sấy khô. AX sau đó được phân đoạn theo các nồng độ ethanol khác nhau từ 20 đến 70%, và được xử lý với enzyme lichenase, β-glucosidase và amyloglucosidase để loại bỏ các β-glucan và tinh bột còn sót lại. Các phân đoạn tủa cồn được xử lý và rửa chiết qua cột Sephacryl S500 HR. Shiiba và tập thể [52] đã sử dụng cột sắc ký DEAE-Sepharose CL-6B để tinh sạch hemicellulose hòa tan trong nước, mẫu qua cột được thẩm tích trong đệm Tris-HCl 100 mM trước khi được sắc ký qua cột Sephacryl S-200. Khối lượng phân tử của AX cám mì được xác định bằng hệ thống SE-HPLC với cột Waters Ultrahydrogel 1000 và hệ các chất chuẩn của Shodex có khối lượng phân tử khác nhau. Rao và tập thể [53] đã tinh sạch polysaccharide qua cột Sepharose CL-4B, sau đó mẫu được cho qua cột E- 1000, và xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp HPSEC. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 19 Watanabe và tập thể [57] đã nghiên cứu AX được tách từ vỏ trấu của lúa gạo, AX được tinh sạch qua cột lọc gel Sepharose CL-6B và rửa chiết với đệm NaOH 0,5 M, sau đó AX được kiểm tra độ sạch và sự đồng nhất bằng phương pháp siêu li tâm và điện di vùng. Kết quả thu được AX có kích thước khoảng 15 kDa. Kích thước của các oligosaccharide sau khi được thủy phân bằng endoxylanase được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lọc gel sử dụng cột Bio-Gel P-2. Các phân đoạn rửa chiết được làm khô và sau đó được kiểm tra bằng sắc ký giấy. Dervilly và tập thể [43] đã dùng 2 cột sắc ký Shodex OH-pax SB HQ 804 và Shodex OH-pax SB HQ 805, rửa chiết bằng dung dịch NaNO3 50 mM, NaN3 0,02 % [18] hoặc sử dụng các cột OH-pax 806 M, OH-pax SB-6 để xác định khối lượng phân tử của mẫu bằng phương pháp HPSEC. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 20 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Chế phẩm arabinoxylan Chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo dùng cho các thí nghiệm được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein (là sản phẩm của đề tài ĐT.02.11/CNSHCB, Bộ Công thương do TS. Nguyễn Thị Vân Anh chủ trì). 2.1.2. Hoá chất Arabinoxylan từ bột mỳ, D-Xylose Kit và Arabinan Kit được mua từ hãng Megazyme. Bản mỏng sắc ký bọc silica được mua từ hãng Merck. Gel Sephadex được mua từ hãng Sigma. Các enzyme Ultraflo M, Ultraflo L và Porzyme được mua từ hãng Novozymes. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide Thủy phân arabinoxylan bằng acid Khi được xử lý với HCl hoặc H2SO4, arabinnoxylan được thủy phân hoàn toàn thành dạng đường đơn: Arabinoxylan → arabinose + xylose Hàm lượng D-xylose và L-arabinose có trong mẫu sau khi được thủy phân được xác định theo kit D-xylose và kit Arabinan của hãng Megazyme. Quy trình: HCl đặc hoặc H2SO4 2 M được bổ sung vào 100 μl mẫu dạng dịch lỏng để đạt đến nồng độ HCl là 1,3 M hoặc 0,5 M đối với thủy phân bằng H2SO4. Sau đó dịch mẫu được thủy phân ở 100oC trong 3 giờ và để nguội đến nhiệt độ phòng. Dịch mẫu được trung hòa về pH 7,0 bằng cách bổ sung theo thứ tự NaOH 1,3 M hoặc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 21 NaOH 0,5 M, sau đó ly tâm 5.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, dịch trên tủa được hút nhẹ nhàng và chuyển sang ống eppendorf mới để dung cho phân tích đường tạo thành. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 0,2 U cho 1mg mẫu AX) của mỗi một chế phẩm xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ, trong đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở 100 o C trong 10 phuts, sau đó xác định lượng xylose và arabinose tạo thành bằng kit của Megazyme 2.2.2. Phân tích định lượng arabinoxylan bằng kit D-xylose và kit Arabinan Nguyên tắc: Dựa vào phương pháp đo quang phổ để định lượng xylose và arabinose tổng số có trong mẫu trước và sau khi được xử lý với HCl hoặc H2SO4, từ đó xác định được hàm lượng AX trong các mẫu. 2.2.2.1. Xác định hàm lượng D-xylose có trong arabinoxylan sau khi đươc thủy phân bằng D-xylose kit [60]. Nguyên tắc: - Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của D-xylose được xúc tác bởi enzyme xylose mutarotase (XMR) α-D-Xylose → β-D-xylose - β-D-xylose bị oxi hóa bởi NAD+ thành acid D-xylonic khi có sự hiện diện của β-xylose dehydrogenase (β-XDH) tại pH 7,5 β-D-Xylose + NAD+ → acid D-xylonic + NADH + H+ Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng xylose tổng số có trong mẫu. Trong đó, hàm lượng NADH tạo thành được đo bằng sự tăng hấp thụ ở bước sóng 340 nm, từ đó tính toán được hàm lượng xylose tương ứng có trong mẫu tham gia phản ứng. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 22 Quy trình: Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.1: Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng định lượng D-xylose bằng D-XYLOSE KIT Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu Nước cất(ở 25°C) Mẫu Dung dịch I ( đệm TE) Dung dịch II (NAD+/ATP) Dung dịch III (hexokinase) 400 µl 20 µl nước cất 80 µl 80 µl 4 µl 400 µl 20 µl 80 µl 80 µl 4 µl Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 5 phút và bắt đầu phản ứng khi thêm: Dung dịch IV (XDH/XMR) 10 µl 10 µl Trộn đều, đo giá trị A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản ứng (6 phút) Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng 340 nm. Thể tích phản ứng cuối cùng: 594 µl, đối chứng dương là D- xylose có nồng độ 0,25 mg/ml, thể tích mẫu và nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân tích Hàm lượng D-xylose được tính toán như sau: C = x ΔAxylose (g/L ) Trong đó V = thể tích cuối cùng (ml) MW = khối lượng phân tử của D-xylose (g/mol) ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 23 = 6300 (l x mol -1 x cm -1 ) d = Độ dày cuvet (cm) v = thể tích mẫu (mL) Do đó, với thể tích mẫu là 20 µl: Cxylose = x ΔAxylose = 0,7076 x ΔAD-xylose Ta có: ΔA xylose của Arabinoxylan = ΔAxylose tổng – ΔAxylose tự do = ΔAxylose của D2 – ΔAxylose = ΔAD* Cxylose của arabinoxylan (g/L) = 0,7076× ΔAD* x hệ số pha loãng (nếu có) C D-xylose của arabinoxylan (g/100g) = Cxylose của arabinoxylan (g/L)x100/trọng lượng mẫu (g/L) 2.2.2.2. Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau khi đươc thủy phân bằng Arabinan kit [59] Nguyên tắc: - Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của L- arabinose được xúc tác bởi enzyme galactose mutarotase (GalMR) α -L-Arabinose → β -L-arabinose - β-L-arabinose bị oxi hóa bởi NAD+ thành acid D-arabinonic khi có sự hiện diện của enzyme β -galactose dehydrogenase (β- GalDH). β -L-Arabinose + NAD+ → acid L-arabinonic + NADH + H+ Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng arabinose tổng số có trong mẫu và được xác định thông qua giá trị A340. Quy trình: Thành phần phản ứng đo hàm lượng arabinose được trình bày ở bảng 2.2: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 24 Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng định lượng L-arabinose bằng ARABINAN KIT Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu Nước cất (ở 25°C) Mẫu Đệm B (đệm acetate, pH 4.0) Dung dịch 1 (Đệm Tris-HCl) Dung dịch 2 (NAD+) 404 µl 20 µl nước cất 20 µl 40 µl 20 µl 404 µl 20 µl 20 µl 40 µl 20 µl Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 3 phút và bắt đầu phản ứng khi thêm: Dung dịch 4 (β-GalDH + Gal-MR) 4 µl 4 µl Trộn đều, ủ 40°C trong 10 phút. Đo A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản ứng. Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng: 340 nm. Thể tích phản ứng cuối cùng là 508 µl, đối chứng dương là arabinose có nồng độ 0,5 mg/ml, thể tích mẫu và thể tích nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân tích. Hàm lượng L-arabinose được tính toán như sau: C = x ΔAarabinose (g/L ) Trong đó V = thể tích cuối cùng (ml) MW = khối lượng phân tử của L-arabinose (g/mol) ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm = 6300 (l x mol -1 x cm -1 ) d = Độ dày cuvet (cm) v = Thể tích mẫu (mL) Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 25 ΔA arabinose của Arabinoxylan = ΔAarabinose tổng số – ΔAarabinose tự do = ΔA* Do đó, với thể tích mẫu là 20 μl, ta có: Carabinose = (0,508 x 150,1 x ΔA arabinose) / (6300 x 1 x 0,02) (g/L) = 0,6052 x ΔA (g/L) và nhân với hệ số pha loãng (nếu có) 2.2.3. Phân tích định tính arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký bản mỏng Nguyên tắc : Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được. Rf = Trong đó: a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [1]. Quy trình: Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 26 chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [1]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme. 2.2.4. Tinh sạch và cô đặc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ xác định Nguyên tắc: Màng lọc được cấu tạo dựa trên mạng lưới các polymer được liên kết chéo tạo thành các lỗ. Các chất hòa tan có kích thước nhỏ sẽ di chuyển một chiều qua các lỗ trên màng từ dung dịch có nồng độ cao đến dung dịch có nồng độ thấp cho đến khi nồng độ cân bằng ở hai dung dịch. Vì thế sử dụng màng lọc có thể phân tách các chất hòa tan trong dung dịch dựa trên kích thước hoặc khối lượng phân tử [62]. Quy trình: Arabinoxylan dạng dịch lỏng được cho vào túi thẩm tích với màng lọc có kích thước lỗ xác định, túi mẫu sau đó được cho vào cốc chứa nước cất đã được khử trùng, được đặt lên máy khuấy từ và thẩm tích trong 1 ngày ở 4oC để loại muối và các chất phân tử nhỏ khác. Mẫu trong túi sau đó được cô đặc bằng cách cho bay hơi nước ở 4oC trong 1 ngày và thu lấy mẫu trong túi bảo quản ở -20oC . 2.2.5. Đánh giá tỷ lệ và kích thước của arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký lọc gel Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel bao gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới hay lỗ và kích thước của các lỗ rây này khác nhau tùy theo loại gel được sử Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 27 dụng, còn pha chuyển động là một loại dung dịch đệm hay dung môi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc, trong đó chất có kích thước lớn ra trước, tiếp đến là chất có kích thước vừa và cuối cùng là chất có kích thước nhỏ, là do chất có kích thước lớn không thể chui vào các hệ thống lỗ gel, do đó khi đi qua phần kẽ hở giữa các hạt gel và ra nhanh hơn, các chất có kích thước vừa sẽ có cơ hội chui vào các lỗ gel và do đó mất nhiều thời gian để chui ra. Các chất có kích thước nhỏ dễ dàng chui vào lỗ gel và cơ hội chui vào các lỗ gel cao nhất và thời gian đi qua hệ thống lọc gel lâu nhất nên được đẩy ra khỏi hệ thống gel muộn nhất [1]. Dựa vào sắc ký lọc gel có thể đánh giá khối lượng phân tử tương đối của chất với nguyên tắc: Logarit KLPT (logMw) của các chất tỷ lệ nghịch với hệ số Ve/Vo, trong đó Ve là thể tích rửa chiết của chất sắc ký, Vo là thể tích trống của cột. Khi có được một loạt các chất chuẩn với KLPT đã biết, người ta cho sắc ký qua cột để tính ra giá trị Ve/Vo và lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo, từ đó với một chất chưa biết KLPT nhưng biết được Ve khi đi qua cột thì có thể tính được KLPT của chất đó [1] một cách tương đối. Quy trình: Gel đã trương nở được nhồi vào cột 1x 60 cm. Cột gel được cân bằng với nước cất với thể tích tổi thiểu bằng 2 lần thể tích cột gel để tạo môi trường gel sắc ký đồng nhất trong toàn bộ cột gel. Dextran xanh (2.000 kDa) được dùng để tính thể tích trống Vo của cột. Sau khi cột gel được rửa sạch, từng dịch protein chuẩn được nạp vào cột từ từ, đảm bảo bề mặt gel ổn định. Sau đó cho đệm chảy qua liên tục, tốc độ dòng chảy đươc duy trì khoảng 20 ml/giờ, thu các phân đoạn vào các ống riêng. Xác định hàm lượng protein mỗi phân đoạn để tính Ve của từng protein chuẩn với cách tinh giống như tính Vo. Tính toán các giá trị logMw và Ve/Vo của các chất chuẩn. Sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo với trục tung là giá trị logMw và trục hoành là tỷ lệ Ve/Vo. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 28 Mẫu đã cô đặc được nạp vào cột với thể tích khoảng 1 ml với cách thức tiến hành tương tự như đối với protein chuẩn. Khi bắt đầu cho mẫu lên cột thì cũng bắt đầu tính thể tích mẫu chảy qua cột bằng cách tiến hành thu các phân đoạn vào từng ống riêng. Các phân đoạn rửa chiết sau đó được xác định hàm lượng arabinoxylan thông qua hàm lượng xylose và arabinose như quy trình được trình bày ở mục 2.2.2. Biểu đồ của quá trình phân tách qua sắc ký lọc gel được thiết lập với trục tung là giá trị độ hấp thụ ở 340 nm và trục hoành là các phân đoạn/thể tích rửa chiết. Dựa trên giá trị Ve của các đỉnh sắc ký qua cột lọc gel của chế phẩm arabinoxylan sau khi qua cột, tỷ lệ Ve/Vo của từng phân đoạn đỉnh sắc ký được tính và giá trị Ve/Vo được đối chiếu này với đồ thị tương quan của các chất chuẩn sẽ suy ra được giá trị logMw của AX ở phân đoạn đấy, từ đó có được giá trị KLPT tương ứng một cách tương đối. 2.2.6. Xác định độ ẩm Nguyên tắc: Độ ẩm được xác định theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC để làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu đến khối lượng không đổi. Mẫu được cân khối lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu. Quy trình: Hộp nhôm dùng để đựng mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng của hộp cân mo (g). Sau đó cho mẫu vào hộp nhôm, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng hộp và mẫu là m1 (g). Hộp mẫu được đặt vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105 o C, sau 1 ngày thì lấy hộp mẫu ra để nguội, cân và sau đó để hộp vào tủ sấy tiếp, cứ sau 1 ngày thì hộp được cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng hộp mẫu giữa các lần sấy khác nhau không quá 0,01%, khối lượng m2 (g) được ghi lại. Công thức tính độ ẩm theo phần trăm: W = (m1 – m2).100 / (m1 – mo) (%) Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 29 Trong đó: mo: Khối lượng hộp sau khi được sấy đến khối lượng không đổi. m1: Khối lượng hộp và mẫu trước khi sấy. m2: khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi. 2.2.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [2] Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở định lượng nitơ protein, từ đó tính ra lượng protein bằng cách nhân với hệ số 6,25 (dựa trên nguyên tắc trong protein nitơ chiếm 16%). Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nito (N) bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và nước, còn nitơ chuyển thành ammoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối ammonium sulfate. Quá trình được tiến hành theo các bước sau: Vô cơ hóa nguyên liệu: R-CHNH2-COOH + H2SO4  CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 ↑ +2 H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng: NH3+ H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư (ở bình hứng) Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH có nồng độ 0,1 N, từ đó tính được hàm lượng đạm có trong mẫu nghiên cứu. 2.2.8. Xác định hàm lượng asen Nguyên tắc: Hàm lượng asen có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp so màu với thuốc thử bạc dietyldithiocarbanate (TCVN 5780- 1994), phương pháp dựa trên nguyên tắc cất asin (AsH3) ra khỏi hỗn hợp rồi phản ứng với thuốc thử bạc dietyldithiocacbanat trong pyridine cho sản phẩm có màu đỏ nâu và được so màu ở bước sóng 520 nm [63]; hoặc sử dụng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử giải phóng hydro (TCVN 7770-2007) [64]. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng quy tr nh định tính và định lượng arabinoxylan Để xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng arabinoxylan, chúng tôi đã sử dụng arabinoxylan thương mại có nguồn gốc từ bột mì được mua từ hãng Megazyme làm mẫu chuẩn để tối ưu các bước của quy trình định lượng. Sau đó, chúng tôi thử nghiệm quy trình này đối với chế phẩm AX được tạo ra từ cám gạo. 3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng arabinoxylan Đối với chế phẩm arabinoxylan cám gạo ở dạng bột: 1 g mẫu được thủy phân bằng acid HCl 1,3 M hoặc acid H2SO4 0,5 M ở 100 o C trong thời gian 180 phút, sản phẩm sau khi thủy phân được làm nguội về nhiệt độ phòng và được trung hòa về pH 7,0 bằng NaOH có nồng độ tương đương với nồng độ acid đã sử dụng. Dung dịch sau khi trung hòa được ly tâm loại muối ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút trước khi được định lượng D-xylose và L-arabinose bằng kit của Megazyme (mục 2.2.2). Đối với chế phẩm arabinoxylan ở dạng dịch lỏng: bổ sung HCl đặc (hoặc HCl ở nồng độ cao hơn 1,3 M) hoặc H2SO4 nồng độ 2 M vào 100 μl mẫu để đạt nồng độ cuối cùng của HCl là 1,3 M và H2SO4 là 0,5 M. Dung dịch sau đó cũng được thủy phân ở 100oC trong 180 phút và trung hòa bằng NaOH giống như quy trình định lượng với mẫu dạng bột. Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng hàm lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88 [17]. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Khóa 2010 - 2012 31 ảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid Acid ∆A340 * D-xylose Nồng độ xylose (mg/ml) Tỷ lệ xylose trong AX (%) ∆A340 * L-arabinose Nồng độ arabinose (mg/ml) Tỷ lệ arabinose trong AX (%) HCl 0,52 0,60 60 0,59 0,360 36,0 H2SO4 0,49 0,56 56 0,49 0,296 29,6 *) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid ở bảng 3.1 cho thấy, arabinoxylan (thương mại) sau khi được t