Luận văn Nghiên cứu nồng độ β – hydroxybutyrate máu ở bệnh nhân đái tháo đường ở Việt Nam

quan trực tiếp với tỷ lệ tổng hợp acid béo, và tỷ lệ nghịch với tỷ lệ oxy hóa acid béo. Do vậy, malonyl-CoA đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành thể ceton. Insulin ức chế tạo thể ceton thông qua việc khởi phát quá trình dephosphoryl hóa enzym lipase nhạy cảm với hormon và hoạt hóa quá trình tổng hợp lipid bằng việc kích thích enzym acetyl-CoA carboxylase. Trong mô mỡ, quá trình dephosphoryl hóa enzym lipase nhạy cảm với hormon sẽ làm giảm phân giải triglycerid thành acid béo và glycerol, do đó làm giảm nguyên liệu cho quá trình tạo thể ceton. Thêm vào đó, dƣới tác dụng của insulin lên acetyl-CoA carboxylase làm tăng malonyl-CoA, do đó cũng làm giảm acid béo bị oxy hóa cho quá trình tạo thể ceton [48]. Glucagon kích thích tạo thể ceton bằng cách kích hoạt quá trình phosphoryl hóa cả lipase và acetyl-CoA carboxylase thông qua AMP vòng phụ thuộc protein kinase. Tại mô mỡ, sự phosphoryl hóa lipase kích thích giải phóng các acid béo từ triglycerid, glyceryl khuếch tán ra khỏi mô mỡ vào máu để vận chuyển tới gan. Các -18- acid béo tự do vào máu liên kết với albumin để hấp thu và chuyển hóa ở các mô khác nhƣ tim, cơ xƣơng, thận, gan. Tại gan, sự phosphoryl hóa acetyl-CoA carboxylase làm giảm malonyl-CoA, do đó kích thích các acid béo vào ti thể, làm tăng nguyên liệu cho quá trình tạo thể ceton. Enzym HMG-CoA synthase (MHS) của ty thể gan là enzym chủ yếu thứ ba liên quan đến sự hình thành thể ceton. Hoạt động của enzym này tăng lên trong tình trạng đói hoặc một chế độ ăn nhiều chất béo, và giảm đi bởi insulin. MHG tăng hoạt động sẽ dẫn tới tăng tạo thể ceton [41]. Các thể ceton là những acid hữu cơ có thể di chuyển tự do qua màng tế bào, thậm chí là hàng rào máu não. Không giống với các mô khác, não không thể sử dụng các acid béo nhƣ một nguồn năng lƣợng khi nồng độ glucose máu thấp. Trong trƣờng hợp này, các thể ceton đóng vai trò quan trọng, cung cấp 2/3 nhu cầu năng lƣợng của não. Các thể ceton tồn tại trong máu với một lƣợng nhỏ ở ngƣời khỏe mạnh khi nhịn đói hoặc tập luyện kéo dài. Ngƣời ta cũng tìm thấy thể ceton ở trẻ sơ sinh và phụ nữ có thai. Nồng độ thể ceton tăng lên bất thƣờng trong máu gặp ở những ngƣời nhiễm toan ceton do ĐTĐ, toan ceton do rƣợu, ngộ độc salicylat, và 1 số trƣờng hợp hiếm gặp khác. Khi các thể ceton tăng lên sẽ ứ lại trong máu và bài tiết qua thận, xuất hiện trong nƣớc tiểu. Những chất này ứ trệ trong máu sẽ gây toan hóa máu [41]. 1.3.3. Các phƣơng pháp phân tích thể ceton trong hóa sinh lâm sàng:  Phƣơng pháp truyền thống: Phản ứng Legal: cho natri nitropruxiat hay natri nitrosoferixyanua [Fe(CN)5NO]NO2 tác dụng với các thể ceton tạo thành màu đỏ hoặc màu xanh (nếu cho CO gắn với bột nhân thơm) Phản ứng Rothera: Đây là phản ứng phát hiện ceton nhạy hơn so với phản ứng Legal tới 5-10 lần. Dựa trên phản ứng: cho nitropruxiat tác dụng với nƣớc tiểu bão hòa amoniac sulfat trong môi trƣờng sunfuric. Nếu xuất hiện màu tím hay hồng: phản ứng dƣơng tính. Nếu xuất hiện màu hồng nhạt và biến mất sau thời gian 5 phút: phản ứng âm tính. -19- Phương pháp phát hiện ceton trên thanh thử: Nguyên lý của xét nghiệm dựa trên phản ứng Legal có độ nhạy với chất acetoacetat hơn aceton. Thuốc thử đƣợc gắn trên bề mặt thanh thử nƣớc tiểu. Sự kết hợp giữa phenylketon và phtalein tạo thành phức hợp màu đỏ (từ màu tím đến màu đỏ). Độ nhạy của xét nghiệm với chất ceton có nồng độ khoảng  0,5 mmol/L ( 5 mg/dL) Nhận xét: Các phƣơng pháp trên chỉ phát hiện đƣợc thành phần acetoacetat và aceton trong nƣớc tiểu, không phát hiện đƣợc sự có mặt của beta-hydroxybutyric acid, là thành phần chính của thể ceton (78%). Đây là phƣơng pháp bán định lƣợng, không đo đƣợc giá trị chính xác của thể ceton trong nƣớc tiểu hoặc trong máu. Kết quả có thể dƣơng tính giả khi có mặt một số loại thuốc nhƣ captopril, mesna, N- acetylcystein, dimercaprol, penicillamin [30], [55]. Kết quả có thể âm tính giả khi que thử tiếp xúc với không khí trong một thời gian dài hoặc nƣớc tiểu có tính acid cao, nhƣ sau khi ăn một lƣợng lớn acid ascorbic [31].  Phƣơng pháp định lƣợng beta-hydroxybutyrate trong máu: Nguyên tắc: Beta-hydroxybutyrate đƣợc biến đổi thành acetoacetat dƣới sự xúc tác của beta hydroxybutyrat dehydrogenase và sự có mặt của coenzym NAD. NADH đƣợc hình thành trong phản ứng sẽ chuyển đổi sang NAD bởi tác dụng với chất oxy hóa INT và enzym diaphorase. Sự giảm mật độ quang sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ chất cần phân tích -hydroxybutyrat, đƣợc xác định bởi quang kế tại bƣớc sóng 505 nm. Nhận xét: Phƣơng pháp xác định đƣợc chính xác giá trị của thể ceton trong máu, loại bỏ các vấn đề dƣơng tính giả do thuốc. 1.4. BETA- HYDROXYBUTYRIC ACID VÀ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG Nhiễm toan ceton là một biến chứng cấp tính của bệnh ĐTĐ, đặc biệt là ĐTĐ typ 1, gây ra nhiều rối loạn chuyển hóa, thậm chí có thể dẫn tới tử vong. Tình -20- trạng này đặc trƣng bởi các dấu hiệu lâm sàng: buồn nôn, nôn, mất nƣớc, nhìn mờ, ý thức lơ mơ, nhịp tim nhanh, kiểu thở Kussmaul, hơi thở có mùi aceton. Các dấu hiệu cận lâm sàng bao gồm: pH ≤ 7,3, đƣờng huyết ˃ 13,9 mmol/L, tăng khoảng trống anion > 12, có thể ceton trong nƣớc tiểu hoặc trong máu. Đây là một cấp cứu nội khoa cần đƣợc theo dõi tại các khoa điều trị tích cực [3],[4]. Nhiễm toan ceton do ĐTĐ (DKA) đặc trƣng bởi tình trạng thiếu hụt insulin và tăng nồng độ của các hormon đối kháng. Điều này sẽ làm giảm khả năng tái este hóa các acid béo tự do tại gan, cũng làm giảm khả năng tổng hợp lipid của gan, đồng thời xúc tác quá trình vận chuyển các acid béo tự do vào ty thể tế bào gan và chuyển hóa thành thể ceton [41]. Tình trạng nội tiết này kéo dài sẽ làm tổng hợp các thể ceton liên tục, dẫn đến tích lũy quá nhiều các thể ceton trong máu. Bên cạnh việc nồng độ các thể ceton trong máu tăng cao ở bệnh nhân DKA thì cũng có sự thay đổi tỷ lệ các thể ceton. Bình thƣờng, tỷ lệ BHB:AcAc là 1:1, nhƣng ở bệnh nhân DKA, tỷ lệ này tăng tới 3:1, thậm chí có thể cao hơn (10:1). Sự tăng nồng độ thể ceton trong máu ở bệnh nhân DKA có thể đƣợc bù trừ phần nào bằng việc tăng sử dụng ở não, cơ xƣơng, thận. Một lƣợng lớn các thể ceton cũng đƣợc lọc qua thận, trong đó một phần nhỏ không đƣợc tái hấp thu thì đƣợc thải qua nƣớc tiểu. Trong DKA, tình trạng thiếu hụt insulin làm giảm độ thanh thải của thận với thể ceton nhƣng chƣa rõ cơ chế. Việc sử dụng thể ceton ở cơ xƣơng cũng giảm do cơ chế hấp thu đã bão hòa. Khả năng hấp thu BHB của cơ giảm trong ĐTĐ, và insulin không làm tăng khả năng này. Tuy nhiên, việc sản xuất quá nhiều chứ không phải là hấp thu kém, là yếu tố chính dẫn tới tăng ceton máu. Trong mọi trƣờng hợp, tỷ lệ ceton sản xuất luôn luôn vƣợt quá khả năng sử dụng và đào thải ở bệnh nhân DKA, nồng độ ceton máu có thể cao hơn 200-300 lần ở những trƣờng hợp nhịn đói. BHB và AcAc là những acid hữu cơ mạnh, phân ly hoàn toàn ở pH sinh lý. Lƣợng ion H+ trong máu tăng nhanh chóng và không ngừng, vƣợt quá khả năng đệm của máu và các mô, hậu quả là dẫn tới toan chuyển hóa. Thể ceton thứ ba, aceton, đƣợc hình thành do phản ứng tự khử nhóm carboxyl của AcAc trong DKA. Khi có mặt với nồng độ cao trong máu, aceton -21- không tham gia tình trạng toan chuyển hóa, vì nó không phân ly ra ion H+. Aceton hòa tan đƣợc, và đƣợc thải ra ngoài qua phổi. Chính điều này gây nên hơi thở mùi trái cây ở bệnh nhân toan ceton do ĐTĐ [41]. 1.5. Các nghiên cứu về Beta-hydroxybutyrat và bệnh đái tháo đƣờng: Đã có nhiều tác giả nƣớc ngoài nghiên cứu về beta-hydroxybutyrat máu trong việc chẩn đoán, xử trí, điều trị và theo dõi đái tháo đƣờng, đặc biệt là biến chứng nhiễm toan ceton. Klocker AA và cộng sự (2013) đã tiến hành 4 nghiên cứu (2 nghiên cứu ngẫu nhiên có kiểm soát và 2 nghiên cứu thuần tập) với 299 ngƣời tham gia tại 11 trung tâm và cho thấy: So với xét nghiệm ceton niệu (aceto acetat) thì xét nghiệm ceton máu (beta-hydroxybutyric acid) có liên quan đến việc giảm số lần nhập viện, rút ngắn thời gian hồi phục ở bệnh nhân DKA, lợi ích về chi phí và sự hài lòng lớn hơn rất nhiều [38]. Ke P, Zhou H, Wang Z và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng với nồng độ BHB ≥ 3,0 mmol/L có thể đƣợc sử dụng nhƣ một ngƣỡng để chẩn đoán DKA với độ nhạy 99%, độ đặc hiệu 86% và hiệu quả chẩn đoán 92,81% và có thể dùng BHB để đánh giá mức độ nghiêm trọng của DKA [36]. Theo kết quả của Sheikh-Ali M, Karon BS, Basu A, và cộng sự (2008): nồng độ BHB huyết thanh ở trẻ em và ngƣời lớn tƣơng ứng là 3,0 và 3,8 mmol/L ở bệnh nhân ĐTĐ không kiểm soát thì có thể chẩn đoán DKA, và điều này có thể tốt hơn so với sử dụng nồng độ HCO3 thƣờng hay dung trong xét nghiệm phân tích khí máu động mạch [48]. Lertwarttanarak R và Plainkum P (2014) cũng nghiên cứu trên các bệnh nhân ĐTĐ với đƣờng máu mao mạch ≥ 400 mg/dL và cho thấy nồng độ BHB > 3,1 mmol/L là ngƣỡng tốt nhất để chẩn đoán DKA, với độ nhạy 100% (khoảng tin cậy 95% CI = 75,1 – 100) và độ đặc hiệu 96% (khoảng tin cậy 95% CI = 79,6 – 99,3) [39]. Beatriz Rodríguez-Merchán, Ana Casteràs, Eva Domingo và cộng sự (2011) nghiên cứu 30 bệnh nhân ĐTĐ typ 1 đƣợc chẩn đoán DKA với kết quả nồng độ BHB là 4,33 ± 0,48 mmol/L và đo BHB là một phƣơng pháp giám sát dễ dàng, -22- thực tế và đáng tin cậy trong DKA và có thể đƣợc sử dụng nhƣ một tham số để điều chỉnh liều insulin [27]. Theo kết quả của Cao X, Zhang X, Xian Y và cộng sự (2014), khi xét nghiệm ceton niệu âm tính có 10% bệnh nhân có nồng độ BHB trong máu ≥ 0,3 mmol/L. Khi xét nghiệm ceton niệu dƣơng tính 22,62% bệnh nhân có nồng độ BHB <0,3 mmol/L. Nồng độ BHB có mối tƣơng quan có ý nghĩa thống kê với nồng độ glucose máu (r = 0,34, p < 0,001) [28]. Hiện tại ở Việt Nam đến thời điểm này chƣa có nghiên cứu nào về nồng độ beta-hydroxybutyrate trong máu ở bệnh nhân ĐTĐ. -23- CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu: - Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Khoa Hóa sinh – Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng (Thái Thịnh đống Đa Hà Nội) - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2014 đến tháng 5/2015. 2.2.Đối tƣợng nghiên cứu: Chúng tôi lựa chọn đối tƣợng đồng ý tham gia nghiên cứu gồm 133 ngƣời chia thành 2 nhóm: 2.2.1. Nhóm bệnh:  Tiêu chuẩn lựa chọn: Đối tƣợng gồm 83 bệnh nhân điều trị tại Khoa Nội trú ĐTĐ – Bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng với chẩn đoán xác định: ĐTĐ typ 1, theo tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ của ADA (2014), dựa trên các đặc điểm: - Các triệu chứng lâm sàng rầm rộ: khát nhiều, tiểu nhiều, ăn nhiều, gầy sút nhiều. - Glucose máu lúc đói, HbA1c lúc mới chẩn đoán tăng cao - Nồng độ insulin; C – peptid máu thấp - Điều trị bằng thuốc uống không đáp ứng.  Tiêu chuẩn loại trừ: - Không đồng ý tham gia vào nghiên cứu - Phụ nữ có thai - Bệnh nhân nặng, có nguy cơ tử vong trong quá trình nằm viện hoặc có bệnh lý cấp tính kèm theo quá nặng - Bệnh nhân có yếu tố gây toan do các nguyên nhân khác nhƣ dùng thuốc, nhịn đói lâu ngày hoặc nghiện rƣợu 2.2.2. Nhóm chứng: Các đối tƣợng gồm 50 ngƣời khỏe mạnh, gồm cả nam và nữ, có tuổi trung bình tƣơng đƣơng với tuổi trung bình của nhóm bệnh, đƣợc lựa chọn qua đợt khám sức khỏe định kỳ qua khám lâm sàng và làm các xét nghiệm, các kết quả bình thƣờng, không mắc bệnh gì. -24- 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang có đối chứng. Cỡ mẫu nghiên cứu: nhóm bệnh: mẫu thuận tiện 2.3.2. Thu thập số liệu: - Tất cả các đối tƣợng nghiên cứu thỏa mãn với các tiêu chuẩn đã chọn đƣợc khai thác bệnh sử, tiền sử, và các yếu tố liên quan đến mẫu bệnh án, khám lâm sàng và làm xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh phù hợp, cần thiết và định lƣợng nồng độ beta-hydroxybutyric acid trong máu. - Tiến hành phân tích các thông số sau: + Tuổi + Giới + Định lƣợng glucose máu lúc đói (Fasting glucose value – FGV) + Định lƣợng HbA1c + Định lƣợng Insulin máu + Định lƣợng C – peptid máu + Đánh giá chức năng thận: định lƣợng Ure, Creatinin máu + Định lƣợng Nồng độ beta-hydroxybutyric acid máu + Định tính bán định lƣợng ceton niệu 2.3.3 . Xử lý số liệu: - Các kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo thuật toán thống kê y học, sử dụng phần mềm SPSS 22.0. - Các biến định tính: tính tỷ lệ phần trăm, so sánh các tỷ lệ dựa vào test χ2 - Các biến định lƣợng: tính trung bình và so sánh các trung bình dựa vào T- test và test Anova. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. - Sử dụng phƣơng trình tuyến tính với hệ số tƣơng quan r, cho biết mối tƣơng quan giữa hai biến định lƣợng. Hệ số tƣơng quan r có giá trị từ -1 đến +1. Khi r > 0: tƣơng quan đồng biến, r < 0: tƣơng quan nghịch biến. Giá trị tuyệt đối của r càng gần 1 thì mối tƣơng quan càng chặt. -25-  |r| < 0,3: tƣơng quan yếu  0,3 ≤ |r| < 0,5: tƣơng quan trung bình  0,5 ≤ |r| < 0,7: tƣơng quan khá chặt chẽ  0,7 ≤ |r| < 0,9: tƣơng quan chặt chẽ  0,9 ≤ |r| ≤ 1 : tƣơng quan rất chặt chẽ 2.4. Các phƣơng pháp xét nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá: 2.4.1. Định lƣợng beta-hydroxybutyric acid máu: Phương pháp enzym so màu.  Nguyên lý của phản ứng: Beta-hydroxybutyric acid đƣợc biến đổi thành acetoacetat dƣới sự xúc tác của beta hydroxybutyrat dehydrogenase và sự có mặt của coenzym NAD. NADH đƣợc hình thành trong phản ứng sẽ chuyển đổi sang NAD bởi tác dụng với chất oxy hóa INT và enzym diaphorase. Sự giảm mật độ quang sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ chất cần phân tích -hydroxybutyric acid, đƣợc xác định bởi quang kế tại bƣớc sóng 505 nm. Phản ứng diễn ra nhƣ sau: Hóa chất: Do công ty Mindray cung cấp (Mindray Medical International Limited là công ty sản xuất ba loại sản phẩm chính: Giám sát bệnh nhân; hỗ trợ cuộc sống và hệ thống chẩn đoán hình ảnh Y tế lớn nhất Trung Quốc có trụ sở chính tại thành phố Thâm Quyến và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ UK, Bắc Mĩ,..) các sản phẩm đã đƣợc WHO và IFCC phê duyệt và đƣa vào áp dụng trên lâm sàng.  Thuốc thử bao gồm:  R1: đệm tris 100 mmol/L, β-hydroxybutyrat dehydrogenase 2 KU/L, diaphorase 2 KU/L, và chất bảo quản 0,5 g/L.  R2: đệm phosphat 20 mmol/L, NAD+ 5 mmol/L, INT 4 mmol/L, oxalat 20 mmol/L, chất bảo quản 2 g/L. -26-  Calibration: betahydroxybutyric acid.  Bệnh phẩm: Huyết thanh hoặc huyết tƣơng (có chống đông bằng Heparin lithium) bảo quản đƣợc 7 ngày ở nhiệt độ 2 - 8ºC, 6 tháng ở nhiệt độ - 20ºC.  Trang thiết bị: Máy AU 5800 của công ty Backman coulter. Khoảng tham chiếu của beta-hydroxybutyric acid: 0,03 – 0,3 mmol/L 2.4.2. Định lƣợng glucose trong máu: phương pháp hexokinase Dựa trên nguyên lý của phản ứng sau: Glucose + ATP Hexokinase G-6-P + ADP G-6-P + NADP + G-6-PDH Gluconate-6-P + NADPH + H + Sự tạo thành của NADPH trong phản ứng sẽ tỷ lệ với nồng độ của glucose và có thể đo đƣợc ở bƣớc sóng vùng tử ngoại 340 nm bằng quang kế. Khoảng trị số tham chiếu của glucose máu: 3,89 - 6,38 mmol/L (70 - 115 mg/dL) 2.4.3. Định lƣợng HbA1c: Theo nguyên lý sắc ký lỏng áp lực cao (HPLC) ái lực nguyên tố Boronate. Haemoglobins glycated (GHB) và protein huyết tƣơng glycated (GPP) khác với protein không glycated bởi các phần đính kèm với phân tử glucose do quá trình ketoamine. GHB và GPP do đó chứa các nhóm 1,2-cis-diol không tìm thấy trong protein không glycated, trong đó cung cấp cơ sở cho việc phân tách các thành phần glycated và không glycated bằng sắc ký ái lực boronate. Trong kỹ thuật HPLC ái lực boronat, một boronate nhƣ axit phenylboronic đƣợc liên kết với bề mặt của sự hỗ trợ cột sắc ký. Khi dung dịch protein (hemolysate hoặc huyết tƣơng đƣợc pha loãng) đƣợc truyền thông qua các cột, các thành phần glycated đƣợc giữ lại bởi các phức của nhóm diol của nó với các boronate (theo sơ đồ minh họa dƣới đây). Sau khi rửa giải các thành phần không glycated, dụng cụ bơm rửa (Reagent 2 - Buffer 2A), trong đó chiếm chỗ của các thành phần glycated từ cột. Các thành phần glycated sau đó đi qua máy phân tích: -27- Tính toán tỷ lệ phần trăm của GHB trong mẫu theo công thức sau đây, với vùng đỉnh trong AU / giây: Khoảng giá trị tham chiếu HbA1c: Bình thƣờng (no diabetes): 4, 0 – 5,6 % ( 20,2 – 37,7 mmol/moL) Tiền đái tháo đƣờng (Pre-diabetes): 5,7% - 6,4% (38,8 – 46,4 mmol/moL) Đái tháo đƣờng (Diabetes):  6,5% ( 47,5 mmol/moL) -28- 2.4.4. Định lƣợng insulin trong máu: Nguyên lý: dựa trên nguyên lý miễn dịch Sandwich có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. theo kỹ thuật điện hóa phát quang (electrochemiluminescence immunoassay “ECLIA”), đƣợc thực hiện trên hệ thống máy cobas 6000 của công ty Roche diagnostic (Thụy Sỹ). Sơ đồ mô hình 3 giai đoạn của nguyên lý phản ứng định lượng insulin Tổng thời gian phản ứng: 18 phút Giai đoạn ủ thứ nhất: Tạo phức kiểu kẹp chả giữa kháng thể kháng insulin đặc hiệu đơn dòng gắn biotin, insulin trong 20 µL bệnh phẩm và kháng thể kháng insulin đặc hiệu dơn dòng đánh dấu bằng ruthenium. Giai đoạn ủ thứ 2: sau khi cho thêm streptavidin-coated microparticles phức hợp gắn kết vào pha rắn do sự tƣơng tác giữa biotin và streptavidin. -29- Phức hợp phản ứng đƣợc đƣa vào buồng đo nơi mà các hạt microparticles đƣợc giữ bằng từ tính trên bề mặt điện cực. Những chất thừa đƣợc rửa đi bằng procell. Dƣới tác dụng của dòng điện điện áp 2V ở điện cực kích thích phát ra ánh sáng (hóa phát quang) và đo tín hiệu ánh sáng này bằng bộ phận nhân quang. Nồng độ insulin có trong mẫu bệnh phẩm đƣợc tính toán dựa trên đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập trƣớc bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn với nồng độ đã biết trƣớc. Đƣờng chuẩn này đƣợc xây dựng trong khi thực hiện chuẩn định (Calibration) trƣớc khi tiến hành phân tích mẫu. Khoảng giá trị tham chiếu của insulin: 2,6-24,9 μU/mL (17,8-173 pmol/L) 2.4.5. Định lƣợng C – peptid: Dựa trên nguyên lý Sandwich, Kỹ thuật theo phƣơng pháp điện hoá phát quang (electrochemiluminescence immunoassay “ECLIA”). . Tổng số thời gian để hoàn thành 1 xét nghiệm là 18 phút. Chu trình phản ứng thƣờng trải qua các giai đoạn nhƣ sau: Giai đoạn ủ 1: Hút mẫu bệnh phẩm (20 µL) cần định lƣợng, kháng thể c- peptid đặc hiệu đƣợc biotin hóa, kháng thể c-peptid đặc hiệu gắn chất đánh dấu ruthenium và tạo thành phức hợp Sandwich phản ứng Giai đoạn ủ thứ 2: sau khi cho thêm streptavidin-coated microparticles phức hợp gắn kết vào pha rắn do sự tƣơng tác giữa biotin và streptavidin. Phức hợp phản ứng đƣợc đƣa vào buồng đo nơi mà các hạt microparticles đƣợc giữ bằng từ tính trên bề mặt điện cực. Những chất thừa đƣợc rửa đi bằng procell. Dƣới tác dụng của dòng điện điện áp 2V, phản ứng sẽ tạo ra ánh sáng (hóa phát quang) tín hiệu ánh sáng này đƣợc đo bằng bộ phận nhân quang. Nồng độ C-peptid có trong mẫu bệnh phẩm đƣợc tính toán dựa trên đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập trƣớc bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn với nồng độ đã biết trƣớc. Đƣờng chuẩn này đƣợc xây dựng trong khi thực hiện chuẩn định (Calibration) trƣớc khi tiến hành phân tích mẫu. Khoảng giá trị tham chiếu của C-peptid : Trong huyết thanh/huyết tƣơng 0,37 – 1,47 nmol/L (1,1 – 4,4 ng/mL) Trong nƣớc tiểu mẫu 24 h 5,74 - 60,3 nmol/24h (17,2-181 g/24h) -30- 2.4.6. Định lƣợng ure máu: Phƣơng pháp: Dựa trên phƣơng pháp động học enzyme Nguyên tắc phản ứng: Ure + 2H2O NH3 + CO2 NH3 + α-Cetoglutarat + NADH + H + Glutamat + NAD + Nồng độ ure tỷ lệ thuận với sự giảm mật độ quang học của NADH đo ở bƣớc sóng 340nm theo thời gian. Khoảng trị số tham chiếu của ure: 2,5 – 7,5 mmol/L 2.4.7. Định lƣợng creatinin máu: Phƣơng pháp: Dƣạ theo phƣơng pháp động học 2 điểm (Jaffé method) Nguyên tắc phản ứng: Creatinin + a. pycric Picrat creatinin (màu da cam) (hấp thụ cực đại ở bước sóng 492nm) Nồng độ creatinin trong huyết thanh tỷ lệ thuận với mật độ quang của phức hợp pycrat. Khoảng trị số tham chiếu của creatinin: Nam: 62 – 106 μmol/L Nữ : 44 – 80 μmol/L 2.4.8. Đánh giá biến chứng thận:  Chúng tôi xác định biến chứng thận ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 dựa trên các tiêu chuẩn: micro-albumin niệu, protein niệu, bệnh thận mạn tính.  Bệnh thận mạn tính đƣợc chẩn đoán khi thỏa mãn 1 trong 2 tiêu chuẩn sau:  Có những tổn thƣơng về cấu trúc và chức năng thận tồn tại kéo dài ≥ 3 tháng, kèm theo hoặc không kèm theo giảm mức lọc cầu thận.  Mức lọc cầu thận giảm < 60 ml/phút/1,73m2 da, kèm hoặc không kèm bằng chứng của tổn thƣơng thận [4].  Mức lọc cầu thận (MLCT) đƣợc tính theo công thức dựa trên tuổi, giới, chủng tộc và creatinin máu theo hƣớng dẫn về bệnh thận mạn tính của Anh [35].  Phân loại các giai đoạn của bệnh thận mạn tính theo Hội Thận học Hoa Kỳ (2002): [4] Urease GLDH NaOH -31- Bảng 2.1. Các giai đoạn của bệnh thận mạn tính Giai đoạn Đánh giá MLCT(ml/phút/1,73m2) I MLCT bình thƣờng hoặc tăng 90 II MLCT giảm nhẹ 60 – 89 III MLCT giảm trung bình 30 – 59 IV MLCT giảm nặng 15 – 29 V MLCT giảm rất nặng < 15 (điều trị thay thế) -32- 2.5. Sơ đồ nghiên cứu Khám LS Làm XN ĐTĐ typ 1 đã ∆(+) * XN Glucose, HbA1c, Insulin, C-peptid * XN creatinin máu * XN ceton niệu Tìm mối liên quan với Glucose, HbA1c, Insulin, C-peptid, ceton niệu, BC thận KẾT LUẬN Bình thƣờng ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Nhóm chứng XN BHB So sánh nhóm bệnh - chứng -33- 2.6. Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu: - Các đối tƣợng đồng ý và hợp tác trong quá trình nghiên cứu. - Đây là nghiên cứu mô tả, tƣơng quan, không có can thiệp, do đó không ảnh hƣởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân. - Chúng tôi cam kết thực hiện với tinh thần trung thực, giữ bí mật về thông tin của bệnh nhân. -34- CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu: 3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm chứng: Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi và giới của nhóm chứng Nam Nữ p Giới n 25 25 p = 1 % 50 50 Tuổi trung bình ( ̅ ± SD) 30,4 ± 6,1 29,2 ± 5,8 p = 0,482 29,8 ± 6,0 Nhận xét và bàn luận: Nhóm chứng có tỷ lệ nam và nữ là tƣơng đƣơng Tuổi trung bình của nhóm chứng là 29,8 ± 6,0 tuổi. Tuổi trung bình giữa nam và nữ khác biệt không có ý nghĩa thống kê, với p > 0,05. Nhóm chứng của chúng tôi đƣợc lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn là những ngƣời khỏe mạnh trong đợt kiểm tra sức khỏe định kì, bao gồm cả nam và nữ, lựa chọn có độ tuổi trung bình tƣơng đƣơng với tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân đái tháo đƣờng typ 1. Thật vậy, tuổi trung bình của nhóm chứng trong nghiên cứu của chúng tôi là 29,8 ± 6,0 tuổi. Tỷ lệ nam/nữ là 1. Không có sự khác biệt về tuổi trung bình giữa nam và nữ (p > 0,05). 3.1.2. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu: Bảng 3.2. Đặc điểm về tuổi và giới của nhóm bệnh nhân nghiên cứu Nam Nữ p Giới n 32 51 p = 0,046 % 38,55 61,45 Tuổi trung bình ( ̅ ± SD) 29,4 ± 10,1 30,4 ± 9,1 p = 0,687 30,45 ± 9,21 -35- Nhận xét và bàn luận: Tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ typ 1 nữ chiếm 61,45%, nam chiếm 38,55%. Tỷ lệ nữ/nam ≈ 1,6. Tỷ lệ nam và nữ khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân ĐTĐ typ 1 là 30,45 ± 9,21 tuổi. Tuổi trung bình giữa nam và nữ khác biệt không có ý nghĩa thống kê, với p > 0,05. Nghiên cứu của chúng tôi có số bệnh nhân nữ nhiều hơn, chiếm tỷ lệ 61,45%, nam chiếm 38,55%, tỷ lệ nữ/nam ≈ 1,6. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Tỷ lệ này giống với tỷ lệ trong nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Huyền và cộng sự (2012) trên 270 bệnh nhân đái tháo đƣờng có tỷ lệ nữ/nam là 1,62 [9]. Tỷ lệ của chúng tôi cũng gần tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Vũ Thị Nga và Trịnh Kim Giang khi nghiên cứu tình hình biến chứng thận ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 điều trị tại khoa Nội tiết Bệnh viện Bạch Mai là 1,45 [14]. Kết quả của chúng tôi cao hơn trong nghiên cứu của Tạ Văn Bình khi nghiên cứu bệnh nhân ĐTĐ lần đầu đến khám tại Bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng là tỷ lệ nữ/nam là 1 [2]. Kết quả của chúng tôi cũng cao hơn nghiên cứu của Trƣơng Ngọc Dƣơng trên 93 bệnh nhân đái tháo đƣờng typ 1 có tỷ lệ nữ/nam là 1,21 [6]. Bảng 3.3.Phân bố nhóm bệnh nghiên cứu theo nhóm tuổi Nhóm tuổi n % ≤ 20 13 15,66 21 – 30 24 28,92 31 – 40 31 37,35 41 – 50 14 16,87 ˃ 50 1 1,2 Tổng 83 100 Nhận xét và bàn luận: Trong 83 bệnh nhân ĐTĐ typ 1 nghiên cứu, nhóm tuổi 31 – 40 chiếm tỷ lệ cao nhất (37,35%), sau đó đến nhóm tuổi 21 – 30 (28,92%), nhóm tuổi > 50 chiếm tỷ lệ thấp nhất (1,20%). Tuổi thấp nhất là 8 tuổi, cao nhất là 51 tuổi. -36- Trong 83 bệnh nhân đái tháo đƣờng typ 1 ở nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình là 30,45 ± 9,21 tuổi. Không có sự khác biệt về tuổi trung bình của nam và nữ (p > 0,05). Bảng 3.3 cho thấy nhóm tuổi 31 – 40 chiếm tỷ lệ cao nhất 37,35%, sau đó là nhóm tuổi 21 – 30 với 28,92%, nhóm tuổi >50 chiếm tỷ lệ thấp nhất 1,20%. Theo kết quả nghiên cứu của Balasubramanyam A và Maldonado M: tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân ĐTĐ typ 1 là 34 ± 17 tuổi, kết qu