Luận văn Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loại bèo tấm lemna aequinoctialis db1 và spirodela polyrhyza db2

hiệu ở phụ lục. 2.1.3. Thiết bị thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và phòng Công nghệ ADN ứng dụng Tủ lạnh sâu -200C, -700C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10-4g, Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc (Avanti TM 30 Centrifuge Beckman, Mỹ); Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật * Nguyên tắc Thành tế bào thực vật được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học kết hợp với việc sử dụng các chất tẩy rửa mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất nhờ dung dịch phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : l). DNA được kết tủa trong cồn tuyệt đối ở -200C và thu tủa nhờ ly tâm. * Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PVP theo Stewart và Vie (1993) [56]. Bèo tấm nghiền trong nitơ lỏng. Khoảng 1 g mẫu thực vật được chiết trong 5 ml dung dịch đệm có chứa Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0,1% β-mercaptoethanol, 2% CTAB, 1% PVP và 5 mM ascorbic acid, ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Mẫu được sử lý bằng phenol-chloroform và cuối cùng bằng chloroform. Lớp trên cùng tách ra tủa bằng một phần mười thể tích Na-acetate 3 M và ba thể tích cồn ở -200C trong 2 giờ. Sau đó rửa lại 2 lần bằng cồn 70%. Cặn thu được làm khô ở điều kiện chân không và hòa vào 300 µl TE. Loại RNA bằng RNase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng SDS và PVP theo Angelaes và cộng sự (2005) [10], có sự thay đổi trong thành phần dung dịch đệm chiết như sau: NaCl 2 M; Tris-HCl (pH= 8) 0,2 M; EDTA (pH=8) 70 µM; β-mercaptoethanol 0,2 M; PVP 100 mg/2ml dung dịch đệm chiết. Sau đó, cho thêm 0,2 ml 20% SDS đối với 1 g mẫu thực vật và ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PEG theo Zuccarello và cộng sự (2006) [67]: thành phần dung dịch đệm chiết có chứa Tris- HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0.1% β- mercaptoethanol, 2% CTAB và 1% PEG 6000, * Quy trình - Nghiền 1 g lá bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vô trùng và được giữ ở -70 0 C) trong nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn. - Hòa tan mẫu trong 3 ml dung dịch đệm chiết có thành phần: 5 M NaCl; 1 M Tris HCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0; CTAB 2%, PVP 2%, β - mercaptoethanol 0,1 M, sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần hoặc sử dụng thành phần dung dịch chứa PEG 6000: Tris - HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β - mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần. - Bổ sung 3 ml phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : 1), lắc nhẹ. - Ly tâm 12.000 v/p trong 4 0C, 15 phút, tạo thành 3 pha, thu lấy pha trên, chuyển sang ống ly tâm khác. - Bổ sung 3 ml chloroform - isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ - Ly tâm 12.000 v/p trong 4 0 C, 15 phút, thu lấy pha trên, chuyển sang ống epp mới, mỗi ống 300 µl. - Tủa DNA: Cho vào mỗi ống epp 50 μl CH3COONa 3 M, 1 ml ethanol 100%. Để ở nhiệt độ -200C trong vòng 3 giờ. - Sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút. Thu tủa, rửa tủa bằng 700 μl ethanol 70% 2 lần. Sấy khô bằng máy hút chân không speed vac, hòa mẫu trong 50 μl nước khử ion vô trùng. Sau đó chạy điện di kiểm tra. - Loại RNA: Bổ sung RNase vào mẫu DNA thu được để đạt đến nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 cuối cùng là 100 g/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ. - Chạy điện di kiểm tra 5 l sản phẩm DNA thu được trên gel agarose 0,8% 2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose [51] * Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. * Hóa chất Agarose 0,8% (Hòa 0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X); Đệm TAE 10mM 1X; EtBr 10 µg/ml; Đệm tra mẫu (glycerol 20%; Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0; EDTA 0,01 M, pH 8,0; bromophenol blue 0,25%). * Quy trình - Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel ~ 2 mm. - Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. - Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng điện 60-80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút). - Nhuộm DNA bằng ethidium bromide (EtBr): Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10 g/ml trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất. - Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio- Rad với tia UV có bước sóng 320 nm 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm 1985. Kỹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. * Quy trình nhân bản bằng enzyme này bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần, được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [51]: - Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94 - 950C trong thời gian ngắn. - Tiếp hợp đoạn mồi thông qua hạ nhiệt độ xuống 50-600C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15-30 base sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân. - Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi: Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 720C. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1 đoạn DNA cần nhân sẽ có 2 đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi. * Kỹ thuật PCR bao gồm các thành phần sau đây: - Một đoạn DNA khuôn mẫu. - Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài 15 - 30 nucleotide. - Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). - DNA polymerase chịu nhiệt. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 μl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. * Thành phần của phản ứng PCR đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 - Chu trình nhiệt 95 0 C 95 0 C 55 0 C 72 0 C 72 0 C 4 phút 1 phút 1 phút 1 phút 30chu kỳ 10 phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nồng độ gốc H2O Taq Buffer (+MgSO4) dNTP La-UbipF La-UbipR Taq DNA polymerase DNA khuôn 16,7 2,5 2,5 1 1 0,3 1 10X 10 mM 10 pM 10 pM 5 U/µl 20 ng/µl Tổng thể tích 25 * Thành phần của phản ứng PCR đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 - Chu trình nhiệt 95 0 C 95 0 C 50 0 C 72 0 C 72 0 C 4 0 C 4 phút 1 phút 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nồng độ gốc H2O Pfu Buffer dNTP MgSO4 Sp-UbipF Sp-UbipR Pfu DNA polymerase DNA khuôn 13,1 2,5 2,5 3 1 1 0,4 1,5 10 mM 10 pM 10 pM 5 U/µl 20 ng/µl Tổng thể tích 25 2.2.4. Các phƣơng pháp sử dụng để tách dòng gen [51] 2.2.4.1. Phản ứng nối ghép gen vào vector và biến nạp vào E. coli * Phản ứng ghép nối Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo GeneJETTMPCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase và đạt hiệu quả gắn đoạn rất cao chỉ trong thời gian ngắn là 10 phút. Đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 phương pháp này cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 với sự tham gia của enzyme T4 DNA Ligase còn đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 phương pháp này cho phép gắn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pJET1.2 với sự tham gia của enzyme T4 DNA ligase. Trong cấu trúc của hai vector này có đầy đủ đặc điểm của một vector tách dòng gen như: Trình tự khởi đầu tái bản của DNA; vùng MCS; Vùng mang gen kháng Amp; Vùng mang gen gây chết tế bào vi khuẩn E. coli. - Quy trình đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O Đệm T4 ligase pCR2.1 T4 DNA ligase Sản phẩm PCR 2 1 1 1 5 5 Tổng thể tích 10 Vortex ngắn và ly tâm 3-5 giây. Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 140C trong 4 giờ. - Quy trình đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O 2X đệm T4 DNA ligase pJET1.2 Sản phẩm PCR 3 10 1 1 5 Tổng thể tích 20 Vortex ngắn và ly tâm 3-5 giây. Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 220C trong 2 giờ. * Biến nạp vào tế bào E. coli Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hóa chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc. Quy trình: Thực hiện biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt với các bước: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Đặt tế bào khả biến E. coli DH5 vào đá để làm tan khoảng 30 phút. - Bổ sung 5l sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH5, đảo nhẹ. - Ủ trong đá 15 phút. - Sốc nhiệt ở 420C trong 70 giây, đặt vào đá 5 phút. - Bổ sung 300 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc 370C trong 1 giờ. - Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicelin (Amp) đến nồng độ cuối cùng là 50 g/ml. - Nuôi ở 370C qua đêm, chọn lấy các khuẩn lạc. 2.2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid lƣợng nhỏ Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p. * Quy trình - Nhân vi khuẩn qua đêm trong ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp ở 370C trên máy lắc - Thu tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng ly tâm 6000 v/p trong 5 phút - Bỏ dịch, thu cặn tế bào - Bổ sung 150 l dung dịch I, vortex mạnh - Bổ sung 150l dung dịch II, đảo nhẹ - Bổ sung 150 l dung dịch III tiếp ngay sau đó, rồi để trong lạnh khoảng 5 phút - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch - Bổ sung 1000l cồn 100%, để tủ lạnh -200C trong 3 giờ để tủa DNA - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 40C - Bỏ dịch, thu tủa DNA - Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa Rnase (0,01 mg/ml). Bảo quản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 DNA ở -200C - Kiểm tra DNA trên gel agarose 2.2.4.3. Phân tích DNA bằng enzyme giới hạn * Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp Để xác định rõ xem plasmid đã lựa chọn có mang đoạn DNA lạ hay không thì cần sử dụng enzyme giới hạn để cắt kiểm tra. Có thể lựa chọn các enzyme giới hạn chỉ cắt gen vùng nhận biết của chúng trên vector, hay lựa chọn enzyme giới hạn có cả điểm cắt trên đoạn DNA lạ. Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần: Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O Dung dịch đệm Plasmid Enzyme 5,8 1,0 3 0.2 Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 370C trong vòng 3 giờ. Sau đó kiểm tra kết quả trên điện di agarose 0,8% * Kiểm tra đoạn DNA được nhân lên bằng enzyme giới hạn - Đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1, sau khi nhân được đoạn DNA có kích thước đúng như gen mong muốn và đã tách dòng thành công bằng vector pCR2.1 cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng các điểm cắt của enzyme giới hạn trên gel đó. Có thể xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR và với cả plasmid tái tổ hợp có mang gel đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn cắt kiểm tra là EcoRI và SalI. - Đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 , sau khi nhân được đoạn DNA có kích thước đúng như gen mong muốn và đã tách dòng thành công bằng vector pJET1.2 cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng các điểm cắt của enzyme giới hạn trên gel đó. Có thể xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR và với cả plasmid tái tổ hợp có mang gel đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn cắt kiểm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 tra là HindIII, NotI, HincII và PstI. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau: E.coRI Dung dịch đệm EcoRI Sall, PstI, NotI, Dung dịch đệm O HindIII Dung dịch đệm R HincII Dung dịch đệm Tango 2.2.4.4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR Ngoài việc kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn, cũng có thể kiểm tra bằng cách dùng DNA plasmid này làm khuôn để nhân đoạn gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi và chu trình nhiệt được sử dụng ở đây cũng giống như ở phản ứng PCR thực hiện với khuôn là DNA tổng số thực vật như trên. 2.2.5. Xác định trình tự gen Trình tự đoạn promoter được xác định trên máy tự động ABI PRISMR 3100 Genetic Analyzer theo nguyên lý phương pháp Sanger. Thành phần hỗn hợp dùng trong xác định trình tự đoạn DNA cả dNTP và ddNTP. Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sử dụng BigDye® Terminator v3.l Cycle Sequencing Kit, chứa các ddNTP được đánh dấu bằng các mầu huỳnh quang khác nhau do đó PCR được tiến hành thuận tiện chỉ trong một Eppendorf. 2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng Sau khi xác định trình tự, các số liệu được xử lý bằng các phần mềm ClustalW trên BioEdit để so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên GenBank. Trình tự nhận được tiếp tục nghiên cứu bằng phần mềm chẩn đoán các vùng chức năng của promoter như Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ Bèo tấm Mọi nghiên cứu trên bộ gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lượng tốt và lượng đủ lớn. Một trong những mối quan tâm hàng đầu khi tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các nuclease nội bào. * Quy trình tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm Giống bèo tấm nguyên cây do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp, được nuôi cấy invitro trong khoảng 3-5 ngày sẽ tiến hành tách chiết DNA. Để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA được chúng tôi tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp nhằm ức chế sự hoạt động của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ được giữ trong tủ lạnh -700C. Mẫu sau đó được tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm chiết gồm các chất: Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0.1% β-mercaptoethanol; 2% CTAB; 2% PVP (điều chỉnh tăng lên thêm 1% PVP so với phương pháp gốc) đối với phương pháp của Stewart và Vie (1993), còn đối với phương pháp Zuccarello và cộng sự (2006)[67] dung dịch đệm có thành phần là Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β- mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 (điều chỉnh tăng lên thêm 2% CTAB và 1% PEG 6000 so với phương pháp gốc). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, đồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB, PVP, PEG trong đệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt động của các nuclease. Trong khi đó, EDTA lại có tác dụng cố định các ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được bổ sung hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 25 : 24 : 1). Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 trúc của DNA, đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khí trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, pha dưới cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý tiếp bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA, bước này có thể lặp lại 1 - 2 lần. Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cách bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M có pH 5,2 và cồn tuyệt đối. Cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Ở điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với Rnase 0,01mg/ml ở 370C trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau đó được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và nồng độ. Vì agarose là một loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi với dung dịch đệm agarose sẽ đông lại tạo cấu trúc dạng mạng lưới với kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ của agarose (kích thước lỗ là 150 nm ở nồng độ 1% và 500 nm ở nồng độ 0,16%). Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi điện di các đoạn DNA có kích thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kích thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trí cao nhất trên bản gel. Những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phía dưới vạch DNA tổng số. Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch đơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện được các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA đã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện di được trình bày trên hình 3.1 1 2 Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel agarose 1- DNA tổng số mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 2- DNA tổng số mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Kết quả cho thấy, cả hai băng DNA tổng số của hai mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 và S. polyrrhiza DB2 đều sáng tập trung và tương đối rõ nét. Điều này cho thấy nồng độ DNA tổng số thu được tương đối cao, ít bị phân hủy và sạch RNA. Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Trình tự primer được thiết kế dựa trên trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 đã được công bố [24]. Các gen Ubiquitin đều có cấu trúc bao gồm promoter, 5’UTR (untranslated region), intron sau đó là trình tự mang mã di truyền được bắt đầu từ ATG (mã của Methionin). Như vậy, trong vùng 5’ trước vị trí khởi đầu phiên mã có đoạn promoter, 5’UTR và đoạn intron, đoạn intron này được xem như có chức năng tăng cường khả năng biểu hiện của gen. Sơ đồ và trình tự mồi được thiết kế nhằm phân lập đoạn promoter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 (SpUbip) và đoạn bao gồm cả promoter và intron (SpUbipin) được trình bày sau đây: Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin của loài bèo tấm S. polyrrhiza (Mỹ) và vị trí các mồi. Trình tự các cặp mồi như sau: Sp-UbipF: 5’ GGC GGA GAT GGA CAG ATA ATG AGA TG 3’ Sp-UbipR: 5’ ACT TGG GAG AGA CGA CGC GCT TCC TC 3’ Sp-UbipinR: 5’ GCT GAT GGA ACA TAT GAC GAC TGA AAG G 3’ 3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 3.2.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR Chúng tôi PCR nhân đoạn promoter từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 sử dụng cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR cho đoạn khoảng 2 kb (SpUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR với đoạn khoảng 1kb (SpUbip). Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Pfu DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%. Một yếu tố quan trọng trong thành phần của đệm là ion Mg2+, khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+ có tác dụng gắn dNTP với enzyme, kích hoạt DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa mồi và đoạn khuôn, cũng như tác động vào sự nóng chảy của DNA mạch kép. Nồng độ ion Mg2+ thay đổi tùy thuộc vào quá trình nhân bản những đoạn DNA cụ thể. Nồng độ các dNTP phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA cần nhân, nồng độ ion Mg2+ và nồng độ đoạn mồi. Việc bổ sung ATG Sp-UbipF Promoter Sp-UbipR Intron Sp-UbipinR PstI-474 HincII-934 1033 2013 XbaI-1509 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 các dNTP sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy. Một thành phần quan trọng khác của PCR là các đoạn mồi. Việc điều chỉnh nồng độ mồi có liên quan đến chất lượng sản phẩm thu được. Khi nồng độ mồi cao, mồi sẽ gắn không đặc hiệu trên khuôn DNA và cho ra sản phẩm gồm nhiều đoạn có kích thước không mong muốn. Ngược lại, nồng độ mồi thấp làm giảm hiệu suất phản ứng. Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập một chu trình phù hợp là yếu tố quan trọng, bởi vì yếu tố nhiệt đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử DNA cũng như việc gắn đoạn mồi và kéo dài chuỗi. Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính của Pfu DNA polymerase. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer để các primer có thể bắt cặp với DNA khuôn. Đồng thời nhiệt độ gắn mồi cũng không được quá thấp khiến cho khuôn bị biến tính. Giá trị của nó phụ thuộc vào từng loại mồi và thấp hơn Tm từ 2 - 100C, trong đó Tm được tính theo công thức: Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G + C) + 3,30C. Sau khi tính được nhiệt độ nóng chảy theo lý thuyết, chúng tôi đã tiến hành PCR thử nghiệm với các nhiệt độ khác nhau và đã chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 500C trong thời gian một phút. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Pfu DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb. Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 25 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40C.