Luận văn Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho

nghiệm ngoại bào cũng được ghi nhận có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của kim loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế bào tránh khỏi rất nhiều yếu tố gây tác động xấu tới vi sinh vật từ môi trường như tia UV, pH, sốc thẩm thấu và sự khô hạn [23]. Những kênh vận chuyển nước nằm xen kẽ trong cấu trúc của màng sinh học, giữa các vùng bao quanh vi khuẩn lạc được ví như là một hệ thống tuần hoàn. Chúng hoạt động hiệu quả trong quá trình trao đổi chất với môi trường xung quanh, do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dưỡng cũng như loại bỏ các sản phẩm chuyển hóa có khả năng gây độc hại. Nhờ vậy quá trình chuyển hóa các chất trong đó cũng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do [7]. Mặt khác quá trình hình thàng màng sinh học giúp vi sinh vật tận dụng được nguồn chất hữu cơ bám dính trên bề mặt giá thể cũng như các cơ chất, chất dinh dưỡng tạo ra từ các loài vi sinh vật khác sống chung. Một màng sinh học có thể được hình thành do sự hợp tác cùng chung sống của nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp. Các loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm. Chẳng hạn như những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao trong khi những loài nằm phía trung tâm biofilm có xu hướng chịu được nồng độ oxy thấp (vi hiếu khí). Khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng được nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hưởng lớn đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Hầu hết các quá trình trong tự nhiên đòi hỏi sự phối hợp của nhiều nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau cùng cư trú trong biofilm sẽ góp phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [35]. Quá trình truyền gen ngang đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật. Trong đó cơ chế truyền gen phổ biến ở vi Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 20 K19 – Sinh học thực nghiệm sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên từ những hiểu biết rằng hầu hết các vi khuẩn trong tự nhiên định cư dưới dạng biofilm, liên kết với nhau bởi mạng lưới các chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ đó vi khuẩn trong biofilm có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [35]. 1.4.2.2. Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm Màng sinh học tác động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày. Do vậy nhiều nghiên cứu hiện nay về màng sinh học có ý nghĩa thực tiễn quan trong và ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Một số ứng dụng cụ thể của màng sinh học nói riêng và các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học nói chung là xử lý ô nhiễm. Trong công nghiệp lên men tại các bể lên men là nơi giữ lại sinh khối vi sinh vật. Thông thường các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng được giữ lại trong các bồn lên men sau mỗi mẻ xử lý. Khi đó để tiếp tục một qui trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Qui trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành. Ngược lại khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý. Những giá thể chất mang có sẵn mạng lưới biofilm có thể được tái sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà không phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển [29]. Dầu thô và các sản phẩm từ dầu được loại bỏ bởi các vi khuẩn phân hủy hydrocarbon. Các vi khuẩn được sử dụng có thể được thả trực tiếp xuống vùng dầu tràn hoặc có thể thả ở vùng ven bờ mà dầu tràn bị sóng đánh vào. Lý do chính ở đây là biofilm giúp tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dính của vi sinh vật với bề mặt giá thể nơi có dầu tràn. Trong nghiên cứu của Radwan và cộng sự, khi sử dụng các vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter và dùng một lớp phủ làm giá thể cho vi khuẩn là tảo, kết quả đã làm giảm được 64-98% n-octadecane và khoảng 38-56% phenanthrene từ môi trường có chứa 0,03% của hydrocarbon sau 2 tuần [50]. Trong nghiên cứu của Lê Thị Nhi Công cùng cộng sự, đã phân lập từ biển nhóm vi khuẩn Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 21 K19 – Sinh học thực nghiệm tạo biofilm và có hoạt tính chuyển hóa các chất hydrocacbon thơm đa vòng như napthalene, anthracene, pyren [17]. Một trong những ứng dụng của màng sinh học đang được quan tâm liên quan đến việc làm sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm bằng công nghệ sinh học. Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thân vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ trong môi trường tự nhiên thành các chất vô cơ đơn giản, ít độc. Đã có nhiều phương pháp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đó nước thải được lọc qua các biofilm nhằm mục đích tách và đồng hóa các hợp chất hữu cơ có hại. Một lượng sinh khối lớn các vi sinh vật trong mạng lưới biofilm làm tăng sự hợp tác trong quá trình trao đổi chất, giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước diễn ra hiệu quả hơn so với dạng sống tự do. Quá trình phân hủy các chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản phẩm của chủng này lại là cơ chất cho một chủng khác trong mạng lưới biofilm, ví dụ trong một mạng lưới biofilm xử lý nước thải có chứa hợp chất nitơ, ion NH4+ được nhóm Nitrosomonas, Nitrobacter chuyển hóa thành ion NO3-, rồi tiếp tục được các nhóm vi khuẩn yếm khí khác sử dụng để cuối cùng tạo thành N2 đi vào khí quyển [37]. Một số nghiên cứu về vi khuẩn anammox có khả năng xử lý nitơ trong nước thải, đã chỉ ra rằng trong hệ thống các lớp siêu mỏng của lớp màng biofilm của chủng vi khuẩn Planctomycetes có sự phân bố oxy theo lớp. Các lớp phía trên là những lớp giàu oxy trong khi các lớp ở phía dưới cùng nằm trong trạng thái kị khí. Sự phân chia theo lớp màng sinh học sẽ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình ứng dụng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ vì giai đoạn nitrate hóa là giai đoạn hiếu khí, giai đoạn khử nitrate là giai đoạn kị khí [52]. Những nghiên cứu về biofilm trong xử lý nước thải có chứa các hợp chất nitơ và photpho của Boelee và cộng sự, các nhà nghiên cứu đã sử dụng màng sinh học của vi tảo để thực hiện nghiên cứu này. Kết quả cho thấy, màng sinh học được thiết kế dựa vào các vi tảo đã xử lý được nitơ là 1.0 g/m2/ngày và photpho là 0.13 g/m2/ngày [13]. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 22 K19 – Sinh học thực nghiệm Wellander và cộng sự khi sử dụng một vật liệu bám sinh khối, thả nổi trong hệ thống xử lý làm giá thể cho các vi sinh vật có khả năng nitrate hóa, đã loại bỏ được đến 90% lượng nitơ tổng số [64]. Hoilijoki và cộng sự đã nghiên cứu khả năng nitrate hóa của vi sinh vật thuộc nhóm nitrate hóa. Kết quả cho thấy, quá trình nitrate hóa chỉ xử lý được 61% amoni khi không có vật liệu bám cho vi sinh vật, và quá trình nitrate hóa xảy ra hoàn toàn khi có vật liệu bám cho vi sinh vật trong bể phản ứng bùn hoạt tính [30]. Kết quả này cho thấy, quá trình xử lý nước thải sử dụng màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý khi có mặt vật liệu bám cho vi sinh vật. Bernet và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng khả năng chuyển hóa nitơ và tạo màng sinh học của vi sinh vật. Mẫu ban đầu có hàm lượng NH4+ là 250 mg/l, sau 2 ngày, hàm lượng NH4+ giảm xuống chỉ còn 5 mg/l, hiệu quả của quá trình xử lý lên đến 98% [12]. Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học trong xử lý ô nhiễm nước thải đặc biệt là nước thải giàu nitơ và photpho hiện nay chưa nhiều. Các công trình công bố liên quan đến lĩnh vực ứng dụng nghiên cứu này chưa nhiều, còn thiếu cả về số lượng lẫn chất lượng. Tại Việt Nam tình hình ô nhiễm nước thải ngày một gia tăng do đó việc cấp thiết là tìm một phương pháp xử lý hiệu quả là cần thiết. Vì vậy, để phù hợp với mục đích nghiên cứu và ứng dụng xử lý ô nhiễm tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài phân lập nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học và có khả năng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho với mục tiêu: Phân lập các chủng có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có khả năng xử lý nitơ và photpho Bước đầu nghiên cứu tối ưu các điều kiện cho sự sinh trưởng phát triển của các chủng vi sinh vật này để có thể áp dụng trong công nghệ xử lý nước thải giàu nitơ và photpho Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 23 K19 – Sinh học thực nghiệm CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Các mẫu nước thải từ bể Biogas tại Vĩnh Yên – Vĩnh Lộc – Thanh Hóa với vị trí thu mẫu và được ký hiệu là các mẫu số 1,2, 3: Nước thải lấy từ tầng giữa bể biogas đã ngưng sử dụng: mẫu số 1 Nước thải lấy từ tầng đáy bể biogas đã ngưng sử dụng: mẫu số 2 Nước thải trực tiếp chảy ra từ bể biogas đang sử dụng: mẫu số 3 Mẫu nước thải rỉ rác ở khu tập trung xử lý rác thải Vạn Phúc – Hà Đông – Hà Nội với hai vị trí thu mẫu là trong và ngoài khu tập trung xử lý rác thải được ký hiệu là mẫu số 4 và số 5. Các mẫu sau khi lấy được chuyển về Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên phân tích. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường Winogradsky được sử dụng để phân lập vi sinh vật trong quá trình nitrate hóa. Môi trường Winogradsky 1 Môi trườngWinogradsky 2 (NH4 )2SO4 2 g NaNO2 1 g MgSO4 0,5 g MgSO4 0,5 g NaCl 2 g NaCl 0.3 g K2HPO4 1 g K2HPO4 1 g CaCO3 0,001 g NaCO3 1 g FeSO4 0,4 g FeSO4 0,03 g Thạch 15 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít Nước cất 1 lít Môi trường acetate mineral medium (AMM) được sử dụng để phân lập vi sinh vật có khả năng xử lý photpho: CH3COONa: 3,68 g Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 24 K19 – Sinh học thực nghiệm Na2HPO4: 28,73 mg NH4Cl: 57,27 mg MgSO4: 131,82 mg K2SO4: 26,74 mg CaCl2. 2H2O: 17,2 mg HEPES: 12 g Dung dịch khoáng: 2 ml Thạch: 15 g Nước cất: 1 lit Dung dịch khoáng gồm: EDTA: 50 g FeSO4. 7H2O: 5 g CuSO4. 5H2O: 1,6 g MnCl2. 4H2O: 5 g (NH4)6Mo7O24. 4H2O: 1,1 g H3BO3: 50 mg KI: 10 mg CoCl2. 6H2O: 50 mg Nước cất: 1 lit Môi trường Luria Betani (LB) (g/l) Peptone 10 g Cao nấm men 5 g NaCl 10 g Nước cất 1 lit Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút. Các hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cho nghiên cứu. 2.2.2. Máy móc thiết bị  Nồi khử trùng (ALP–Nhật).  Máy lắc (Satorius–Đức). Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 25 K19 – Sinh học thực nghiệm  Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý).  Máy đo mật độ quang học (Bionate–Anh).  Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản).  Cân Kern (Satorius–Đức).  Cân phân tích (Presica, Ý)  Tủ ấm (Memmert–Đức).  Máy ly tâm sigma 3K30 (Sartorius–Đức).  Tủ sấy (Memmert–Đức).  Máy khuấy từ (IKA–Đức).  Kính hiển vi điện tử quét JSM–5421LV (Nhật Bản). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Dùng các đĩa petri có chứa môi trường Winogradsky và môi trường AMM đã khử trùng. Pha loãng các mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Dùng pipet lấy 100 µl dịch mẫu đã pha loãng cho lên mặt thạch. Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều trên mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừng lại. Các mẫu đã cấy gạt cho vào tủ ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày. 2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng hình thành biofilm Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường nuôi cấy tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện, quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [46], [47]. Các chủng vi khuẩn được lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường LB trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bước sóng 620 nm (OD620) ở vào khoảng 0,2 đến 0,3. Hút 100 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 µl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC. Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp so màu ở bước sóng 620 nm dịch nuôi cấy vi khuẩn. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 26 K19 – Sinh học thực nghiệm Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh. Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng các tinh thể tím bám trên thành eppenodorf đươc hòa tan trong 1 ml etanol 70%. Mật độ tế bào trong biofilm được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm. 2.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (SEM)  Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường LB. Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC.  Gắn mẫu biofilm lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu.  Rửa nhẹ bằng nước cất khử trùng.  Gắn mẫu lên đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC–1200 trong 5 phút ở 30 mA.  Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi quét điện tử JSM–5421LV (Nhật Bản) tại phòng chụp Hiển vi điện tử quét – Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên. 2.3.4. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành màng sinh học Vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khác nhau. Nhiệt độ, pH không thích hợp sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của chúng. 2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn nghiên cứu. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 27 K19 – Sinh học thực nghiệm 2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu. 2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram. Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu vi khuẩn được nhuộm bằng tím kết tinh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot được giữ lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loại lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kết tinh-iôt. Khi nhuộm lại bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1]. Phương pháp tiến hành:  Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch, đốt nóng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoặc trong ống giống, đưa vào giọt nước, cố định vết bôi bằng cách hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn.  Cho một giọt tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi, nhuộm trong thời gian 1 phút. Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô.  Nhuộm với lưugôn (chứa KI và I2) tương tự như với tím kết tinh.  Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.  Nhuộm safain trong 2 phút. Rửa bằng nước cất, thấm khô.  Soi trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100 lần.  Quan sát kết quả và đưa ra kết luận. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 28 K19 – Sinh học thực nghiệm 2.3.6. Phương pháp sử dụng kit APi Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành thử với Kit thử APi 20NE của hãng BioMérieus. Hóa chất và thuốc thử cần thiết được cung cấp cùng với bộ kit. Kết quả được ghi lại và phân loại với phần mềm của hãng BioMérieus . 2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ Mỗi chủng được nuôi lắc ở 37°C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15, 20 ngày. Môi trường nuôi lắc là dung dịch môi trường Winogradsky có bổ sung 1% pepton [34]. 2.3.7.1. Phương pháp phân tích nitơ tổng số Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng vô cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 220 nm [9]. Phương pháp làm như sau: Xử lý mẫu  Lấy 50 ml mẫu vào bình chịu nhiệt 100 ml  Thêm 10 ml dd A (dd A : 4 g NaOH + 3 g K2S2O8)/100ml nước cất.  Nút chặt và đun trong nồi khử trùng ở 120°C trong 30 phút.  Sau đó lấy 30 ml mẫu vào bình định mức 50 ml, lọc loại bỏ vẩn đục.  Thêm 6,5 ml HCl (HCl:H2O = 1:15 về thể tích).  Lắc và định mức tới 50 ml bằng nước khử ion.  Lập đường chuẩn  Chuẩn bị đường chuẩn gồm 4 điểm bằng bình định mức 50ml  Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,722 g KNO3 bằng nước cất, sau đó định mức lên 1000 ml, đựng trong chai màu nâu, bảo quản trong tủ lạnh.  Dung dịch chuẩn 10 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc ra 10 lần  Cách tiến hành: lấy thể tích dung dịch chuẩn theo tỷ lệ vào 4 bình định mức, thêm vào mỗi bình 0,5 ml dung dịch HCl, định mức tới 50 ml bằng nước cất, lắc đều. Sau đó đo ở bước sóng 220 nm Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 29 K19 – Sinh học thực nghiệm  Với mẫu sau khi thực hiện bước xử lý mẫu xong cũng tiến hành tương tự như bước lập đường chuẩn  Tính toán kết quả mgN- T = mgN- T đo  2 Chú ý: giới hạn của phép đo là < 3 mg/l, nếu hàm lượng nitơ trong mẫu nằm quá giới hạn thì phải pha loãng mẫu . 2.3.7.2. Phương pháp phân tích hàm lượng amoni (NH4+) Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dựa trên nồng độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi. Nguyên tắc: Phản ứng của NH4+ và hypochloride với sự có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất indophenol blue. So màu ở bước sóng 640 nm [9]. Chuẩn bị thuốc thử:  Hypochloride: 15 g NaOH khan + 500 ml NaClO 0.1% sau đó định mức đến 1000ml bằng nước khử ion.  Dung dịch phenol- sodium nitroprusside: 5 g phenol (C6H5OH) + 0.025 g nitroprusside (Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O), định mức đến 500 ml bằng nước khử ion. Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn được lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105°C trong 3 giờ, đẻ nguội trong bình hút ẩm. Cân 3,819 g NH4Cl, hòa tan và định mức đến 1000 ml bằng nước khử ion. Dung dịch có nồng độ N- NH4+ là 1 g/l. Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc. Lập đường chuẩn: tương ứng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l.  Lấy 5 ml mẫu vào ống thủy tinh.  Thêm 3 ml thuốc thử phenol- sodium nitroprusside.  Lắc trên máy rung 30 giây.  Thêm 3 ml hypochloride.  Lắc trên máy rung 30 giây. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 30 K19 – Sinh học thực nghiệm  Điều nhiệt ở 37°C trong 25 phút.  Đo ở bước sóng 640 nm.  Với mẫu cũng làm các bước tương tự như lập đường chuẩn. 2.3.7.3. Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của các chủng được đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trường nuôi cấy. Nguyên tắc: Phản ứng giữa nitrite và hỗn hợp sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước sóng 540 nm [9]. Chuẩn bị thuốc thử:  Dung dịch sunfanylamide: cân 0,6 g NH2C6H4SO2NH2 hòa tan trong 50 ml nước cất nóng, làm lạnh, thêm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.  Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0.1 g C10H7NHCH2NH2.2HCl hòa tan trong 100 ml nước cất, đựng trong chai màu nâu, bảo quản 4oC. Lập đường chuẩn: Chuẩn bị các ống thí nghiệm.  Hòa tan 1,23 g NaNO2 trong 1000 ml nước cất. Dung dịch gốc có nồng độ N- NO2 là 250 mg/l.  Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dd gốc.  Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.  Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau.  Thêm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.  Trộn đều và giữ yên trong 5 phút.  Thêm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl.  Trộn đều và giữ yên trong 10 phút.  So màu ở bước sóng 540 nm.  Với các dung dịch mẫu làm tương tự như lập đường chuẩn. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 31 K19 – Sinh học thực nghiệm 2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng xử lý photpho Khả năng tích lũy photpho của các chủng được đánh giá thông qua sự giảm nồng độ của PO4 - trong môi trường nuôi cấy theo thời gian. Chuẩn bị thuốc thử: Chuẩn bị dung dịch (NH4)6Mo6  Hòa tan 7,27 g amonium molydat (NH4)6Mo7O2.4H2O (sấy ở 105 oC trong 3 giờ) vào 150 ml nước cất.  Hòa tan 0,0945 g Kaly antimon tactrat (C8H8O12K2.Sb2O2.H2O) trong 50ml nước cất.  96 ml H2SO4 đặc vào bình chứa 600 ml nước cất sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.  Trộn các dung dịch trên với nhau  Thêm vào 10 g amonium amidosulfat (NH4OSO2NH2) vào hỗn hợp dung dịch trên  Định mức đến 1000 ml Chuẩn bị dung dịch C6H8O6: Hòa tan 1.8 g C6H8O6 trong 25 ml nước, sử dụng trong vòng 2 tuần. Lập đường chuẩn  Chuẩn bị dãy các dung dịch gồm 5 điểm vào 5 ống nghiệm có chia vạch  Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,4394g KH2PO4 trong 100 ml nước cất.  Dung dịch chuẩn: pha loãng dung dịch gốc 20 lần ta được dung dịch chuẩn 5 mg/l. Lấy dung dịch chuẩn theo tỷ lệ nồng độ sau: Nồng độ (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vdd chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10  Sau khi tiến hành lấy dung dịch chuẩn và lấy mẫu vào ống nghiệm định mức tới 40 ml  Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6  Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6  Định mức tới 50 ml Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 32 K19 – Sinh học thực nghiệm  Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40 oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút  Đo mẫu tại bước sóng 710 nm 2.3.8.1. Phương pháp phân tích photpho tổng Nguyên tắc: Amonium molydat và kali antimon tatrat phản ứng với PO43- trong môi trường axit trung bình tạo thành axit photpho molipdic có màu xanh đậm đo màu ở bước sóng 710 nm trên máy quang phổ UV – VIS [9]. Xử lý mẫu:  Lấy 10 ml mẫu vào bình có nút 100 ml  Thêm 5 ml K2S2O8 (4 g K2S2O8 trong 100 ml nước)  Thêm 1 ml H2SO4 30%  Đun ở 120 oC trong 30 phút  Sau đó chuyển toàn bộ mẫu đã đun vào trong bình định mức tới 50 ml bằng nước cất. Lấy 10 ml mẫu này cho vào bình định mức 50 ml  Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml  Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6  Định mức tới 50 ml bằng nước cất.  Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40 oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút  Đo mẫu tại bước sóng 710 nm  Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả.  Tính toán kết quả  C= Cđo 50/10  50/10 (mg/l)  Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l) Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l). 2.3.8.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Ortho photphate (PO43-)  Lấy 10 ml mẫu cho vào bình định mức 50 ml  Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml  Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6  Định mức tới 50 ml bằng nước cất.  Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40 oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 33 K19 – Sinh học thực nghiệm  Đo tại bước sóng 710 nm  Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả.  C= Cđo  50/10 (mg/l)  Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l) Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l). 2.3.9. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA Các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý nitơ và photpho được phân tích trình tự gen 16S rRNA để xác định cây phân loại. Trình tự gen đoạn 16S rRNA được đọc trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học. Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA được so sánh với trình tự đoạn gen tương tưng của các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phần mềm njplot. 2.3.10. Phương pháp thống kê sinh học Các kết quả thu được được xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phần mềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy. Luận văn thạc sĩ Ngô Thị Kim Toán 34 K