Luận văn Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất Phenolic từ cây Alpinia Pinnanensist. L. WU ET Senjen (Zingiberaceae)

ược lập trình gây bởi H2O2 trong một sự phụ thuộc vào liều lượng. Phân tích flow cytometric cho thấy tác dụng mạnh của PCA đối với sự bảo vệ các tế bào PC12 đối với apoptosis gây bởi H2O2. Trong các tế bào này, các hàm lượng của glutathione (GSH) và hoạt tính catalase đã được tăng cường, trong khi hoạt tính của glutathione peroxidase không thay đổi. Hơn nữa, PCA cũng bảo vệ sự hư hại tế bào gây ra bởi H2O2 và Fe 2 +, chất này tạo ra các gốc tự do hydroxyl (.OH) do phản ứng Fenton. Các kết quả này cho thấy rằng PCA có thể là một chất hóa học thích hợp cho điều trị stress và các bệnh thoái hóa thần kinh gây bởi sự oxy hoá [34]. Ba chất liên hợp monoterpen-chalcon, rubrain (50), isorubrain (51) và sumadain C (52) đã được phân lập từ hạt Alpinia katsumadai. Cấu trúc và cấu hình tương đối của các hợp chất đã được chứng minh bằng phổ NMR và X-ray. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này đã được đánh giá trên các dòng tế bào HepG2, MCF-7 và MAD-MB-435, và 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon đã được chứng minh là có hoạt tính gây độc tế bào [32]. 50 51 Tám hợp chất đã được phân lập từ phần chiết etanol của Alpinia katsumadai Hayata, 1,7-dipheny-5-hydroxy-4,6-heptadien-3-on (52), 1,7-diphenyl-1,4,6-heptadien -3-on (53), pinocembrin, cardamomin (54), alpinetin (55), 7,4-dihydroxy-5-methoxy flavanon (56) và β-sitosterol (57). Trong đó 2 hợp chất đầu và (58) đã được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này [42]. 58 Tổng kết lại, các hợp chất phenolic mới vẫn tiếp tục được phân lập từ các loài Alpinia officinarum, Alpinia galanga, Alpinia kadsumadai và Alpinia oxyphylla. Các hợp chất này cho một tỷ lệ cao các hoạt chất chống viêm, kháng virut và chống ung thư. 1.3 Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất khác từ chi Alpinia (Zingiberaceae) Các thành phần hóa học khác thường được phát hiện trong các thực vật chi Alpinia (Zingiberaceae) là các hợp chất mono- và sesquitecpenoit trong các tinh dầu từ các bộ phận lá, thân, rễ và quả. Các đitecpenoit dãy labdan thường được phân lập và các hợp chất này cho các hoạt tính gây độc tế bào mạnh. Các tinh dầu từ lá khô, thân giả và thân rễ loài Alpinia conchigera Griff. được thu nhập từ tỉnh Jeli của Kelanta, bờ biển phía đông của bán đảo Malaysia, đã nhận được bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước. Phân tích GC và GC-MS đã nhận biết được 41 hợp chất, trong đó 13 thành phần đã được xác định lần đầu tiên. Ở lá, thân giả và thân rễ 40, 33 và 39 thành phần đã được xác định. Thành phần phổ biến nhất trong tinh dầu lá là β-bisabolen (15,3%), β-pinen (8,2%), β-sesquiphellandren (7,6%), chavicol (7,5%) và β-elemen (6,0%), trong khi β-bisabolen (19,9%), β-sesquiphellandren (11,3%), β-caryophyllen (8,8%) và β-elemen (4,7%), là các hợp chất chính trong tinh dầu thân giả. Trong tinh dầu thân rễ, 1,8-cineol (17,9%), β-bisabolen (13,9%), β-sesquiphellandren (6,8%) và β-elemen (4,0%) là các hợp chất chính. Các tinh dầu đã được thử nghiệm hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn, tuy nhiên chỉ có các sự ức chế yếu đối với các vi sinh vật thử nghiệm đã được phát hiện [29]. Trong liệu pháp điều trị thực vật, tinh dầu từ lá cây Alpinia zerumbet (Alpinia speciosa K. Schum.) đã được sử dụng cho điều trị các triệu chứng của bệnh thần kinh, như sự giảm thần kinh, stress, lo lắng, và các bệnh về kinh niên liên quan đến sự mất cân bằng hoocmon sinh sản ở phụ nữ. Thành phần hoá học của tinh dầu đã được phân tích bằng GC-MS. Các tính chất của tinh dầu gây ra sự thay đổi hành vi của chuột đã được nghiên cứu bởi các quan sát hành vi và bài toán mê cung nâng cao (EPM) được sử dụng làm phương pháp để đánh giá các biểu hiện giảm căng thẳng. Năm hợp chất chính, p-cymen (28,0±5%), 1,8-cineol (17,9±4,2%), terpinen-4-ol (11,9± 6,3%), limonen (6,3±2,2%) và camphor (5,2±2,1%) đã được xác định bằng GC và GC-MS. Đưa tinh dầu vào bằng đường hít (8,7 ppm) đã dẫn phản ứng nhảy duy nhất ở chuột. Để nghiên cứu các cơ chế điều chỉnh hành vi của tinh dầu, 10 mg/kg 5-HTP hoặc 10 mg/kg fluoxetine đã được tiêm vào đường màng bụng trước khi cho hít tinh dầu. Bằng các xử lý trước với 5-HTP hoặc fluoxetine, tần số nhảy đã giảm đáng kể. Trong thí nghiệm EPM, tinh dầu (0,087 và 8,7 ppm) đã cho thấy rõ hoạt tính giảm căng thẳng ở chuột [19]. Kỹ thuật HSCCC bán điều chế đã được áp dụng thành công trong phân lập và tinh chế nootkaton (59) từ tinh dầu quả Alpinia oxyphylla Miquel. Mười hai hệ dung môi 2 pha, bao gồm có 7 hệ không nước và 5 hệ hữu cơ nước-dung môi hữu cơ, với hệ số phân bố phù hợp của nootkaton mà còn hệ số tách thích hợp giữa nootkaton và valencen, tạp chất chủ yếu trong tinh dầu. Hơn nữa trong HSCCC, n-hexan-clorofom-axetonitril (10:1:10, v/v), và n-hexan-metanol-nước (5:4:1, v/v) đã được sàng lọc riêng biệt. Tuy nhiên, n-hexan-metanol-nước (5:4:1,v/v) được cho là tối ưu vì thời gian rửa giải rất ngắn và các dạng pic HSCCC tốt hơn. Bằng cách rửa giải pha dưới của hệ dung môi trong phương thức đầu-đuôi, 3,1 mg nootkaton đã nhận được với độ tinh khiết 92,3% (GC-MS) từ 80 mg tinh dầu thô trong thao tác một bước với thời gian ít hơn 4 giờ [24]. 59 Nghiên cứu hoá học phần chiết CHCl3 từ hạt Alpinia zerumbet đã phân lập được 2 labdan đitecpen mới (60 và 61) cùng với năm hợp chất đã biết (62-66). Tất cả các chất được phân lập đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư THP-1, HL-60, A-375 và A-549. Hai hợp chất 60 và 61 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh [23]. 60 61 62 63 64 65 66 CHƯƠNG II NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nhiêm vụ nghiên cứu Luận văn này nghiên cứu thành phần hoá học của cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen) (Zingiberaceae) được thu thập ở Lào Cai. Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong luận văn này gồm có: 1. Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên có từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis; 2. Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột; 3. Phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng các phương pháp sắc ký điều chế; 4. Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ hiện đại. 5. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic nhận được. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết Mẫu thực vật sau khi được thu hái được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở 40oC và xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu thực vật được ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Phần chiết axeton nhận được được phân bố chọn lọc bằng phương pháp chiết hai pha lỏng lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần, n-hexan, điclometan và etyl axetat. 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phần chiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểm tra độ sạch của các hợp chất phân lập. Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế lượng nhỏ (< 15 mg) chất hữu cơ. Phương pháp kết tinh để tinh chế các chất rắn. 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR); Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR); Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT. 2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Các hợp chất phenolic được phân lập đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in vitro theo phương pháp quét gốc tự do DPPH của S. G. Olga et al. (2003). Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam. CHƯƠNG III PHẦN THỰC NGHIỆM 3.1 Thiết bị và hoá chất - Các phương pháp sắc ký Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm. Phát hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đó hơ nóng bản mỏng ở 1200 và đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm. Sắc ký cột thường (CC) Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 µm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Sắc ký cột nhanh (FC) Phân tách sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới áp suất nén. Chất hấp phụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μm và 63-100 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhau được sử dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) Phân tách sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C. Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫu trực tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký FC, CC và Mini-C. - Các phương pháp phổ Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) Phổ EI-MS được đo trên thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MS Engine và Waters Autospec Premier. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Các phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm. Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135. 3.2 Nguyên liệu thực vật Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen (Zingiberaceae) (20 kg) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 tại xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai. Mẫu sau đó được rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô trong bóng râm và sấy khô ở 40oC. Mẫu khô (1,6 kg) được xay thành bột mịn. 3.3 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis Mẫu bột khô thân rễ cây Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngâm chiết trong dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu được dịch chiết axeton đầu tiên. Tiến hành lặp lại quá trình ngâm mẫu trong axeton thêm 4 lần nữa. Cuối cùng lọc bỏ bã thực vật thu được dịch chiết axeton. Dịch chiết sau 5 lần ngâm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để tránh làm biến chất cho đến khi thu được phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt. Hoà loãng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch nước nhận được với các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đó được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được các phần chiết tương ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và AP3 (phần chiết etyl axetat). Quy trình điều chế các phần chiết được nêu trên Sơ đồ 1, Mục 4.2; Chương 4: Kết quả và Thảo luận. Xác định khối lượng các phần chiết và tính hiệu suất so với lượng mẫu khô ban đầu. Kết quả được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) 1 n-Hexan AP1 21,1 1,32 2 Điclometan AP2 49,2 3,01 3 Etyl axetat AP3 3,8 0,23 3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) trên nền nhôm. Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọn trong các hệ dung môi triển khai khác nhau để cho các sắc ký đồ phân giải tốt các hợp chất trong các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis. 3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1) Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Các kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan được trình bày ở Bảng 3, Mục 4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2) Phần chiết điclometan (AP2) được phân tích TLC với các hệ dung môi n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Các kết quả phân tích TLC được phần chiết điclometan trình bày trên Bảng 4, Mục 4.4.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3) Phần chiết etyl axetat (AP3) được phân tích với TLC với các hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với các tỷ lệ 20:19:1, 20:15:1 và 20:19:0,5, hệ etyl axetat-axit fomic-nước với tỷ lệ 30:2:3, và hệ etyl axetat-metanol-nước với tỷ lệ 30:5:4. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và FeCl3 5%. Các kết quả phân tích TLC được trình bày trên Bảng 5, Mục 4.5.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất 3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (AP1) Phần chiết n-hexan AP1 (10 g) được hoà tan trong CH2Cl2 sau đó được hấp phụ trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm). Khuấy đều cho đến khi silica gel hấp phụ đều hết dung dịch mẫu cho đến khi khô đều. Cho silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khí. Sau đó đổ silica gel ở dạng bột nhão vào cột sắc ký (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Cho dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nén đều cột đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định. Đưa mẫu đã tẩm trên silica gel lên cột CC. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v). Các phân đoạn được thu theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 24 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP1.1 đến AP1.24. Các nhóm phân đoạn AP1.11 (150 mg) và AP1.12 (670 mg) được rửa nhiều lần bằng n-hexan cho chất AP1.11 (101 mg) và AP1.12 (203 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Nhóm phân đoạn AP1.15 (44 mg) được rửa bằng n-hexan cho chất AP1.15 (25 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng nhạt. Nhóm phân đoạn AP1.18 (1,1 g) được phân tách sắc ký CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 6:1 đến 1:1 cho chất AP1.18.3 (321 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Nhóm phân đoạn AP1.20 (1,13 g) được cho chạy sắc ký cột CC (2 cm i.d. x 25 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm), hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 7:1 và 5:1 cho năm nhóm phân đoạn chính sau các phân tích TLC từ AP1.20.1 đến AP1.20.5. Các nhóm phân đoạn AP1.20.3 và AP1.20.4 được gộp lại và phân tách CC (2 cm i.d. x 20 cm) với gradient n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1 (silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm). Kết quả thu được chất AP1.20.3.2 (356 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng ánh. Nhóm phân đoạn AP1.22 (190 mg) được rửa bằng axeton cho chất AP1.22 (23 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2) Phần chiết điclometan AP2 (4,1 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ CH2Cl2 và được tẩm trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) cho một hỗn hợp bột mịn màu vàng. Nhồi cột ướt silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) vào cột phân tách CC (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa phần chiết tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v), thu các phân đoạn theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình phân tách bằng TLC. Kết quả thu được 21 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP2.1 đến AP2.21. Nhóm phân đoạn AP2.11 (200 mg) ở dạng gel được chạy CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) với hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1, thu được chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp AP2.11.3 với cột CC (1,5 cm i.d. x 20 cm) với hệ điclometan-axeton 25:1, thu được chất AP2.11.3.3 (83 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Nhóm phân đoạn AP2.16 (150 mg) được kết tinh trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho chất AP2.16 (135 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Nhóm phân đoạn AP2.17 (18,7mg) và AP2.18 (18,7mg) được rửa bằng CH2Cl2 cho các chất AP2.17 (15,6 mg) và AP2.18 (3,1 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) Phần chiết etyl axetat AP3 (3,8 g) được hoà tan vừa đủ trong metanol và được tẩm với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) cho một chất bột mịn màu vàng. Nhồi silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt vào cột tách CC (Φ = 2,5 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa mẫu tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic, thu các phân đoạn theo 20 ml/phân đoạn cho 13 nhóm phân đoạn chính được ký hiệu từ AP3.1 đến AP3.13. Chất AP3.4 (87 mg) được tách ra từ nhóm phân đoạn AP3.4 (96 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Nhóm phân đoạn AP3.13 (0,67 g) được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 (63 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập β-Sitosterol (AP1.11) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v). Hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. IR (KBr): υmax cm-1 3427, 1637, 1461, 1379, 1056. 6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 200-202oC. Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 428 (M+., C29H48O2, 37,8), 413 (6,7), 227 (18,5), 152 (57,9), 81 (41,2), 69 (45,4), 55 (100). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 0,74 (3H, s, H3-18), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-26), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-27), 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H3-29), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H3-21), 1,38 (3H, s, H3-19), 2,37 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz, H-2a), 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4). 13C-NMR/DEPT (125 MHz, CDCl3, ppm): δ 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29), 18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q, C-19), 20,9 (t, C-11), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1 (t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8), 33,9 (t, C-22), 34,3 (t, C-7), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1), 38,0 (s, C-10), 38,6 (t, C-2), 39,6 (t, C-12), 42,5 (s, C-13), 45,9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d,C-17), 56,1 (d, C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,2 (s, C-3). trans-3S,5S-Đihidroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3) Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đ.n.c. 75-77oC. Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 4:1, v/v). Hiện màu xanh lam với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 282, (M+., C19H22O2, <1), 264 (10,1), 135 (21), 133 (37,8), 104 (68,9), 91 (100), 77 (27,3), 55 (36,1). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 1,7-1,9 (4H, m, 2H-4, 2H-6), 2,67-2,83 (2H, m, 2H-7), 2,83 (1H, brs, OH), 2,95 (1H, brs, OH), 3,96 (1H, quintet, J = 6,5 Hz, H-5), 4,54 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-3), 6,21 (1H, dd, J = 6,5 Hz, 16 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1), 7,17-7,37 (10H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′, H-6′, H-2′′, H-3′′, H-4′′, H5′′, H-6′′). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm ): δ 31,7 (t, C-7), 39,7 (t, C-6), 43,5 (t, C-4), 71,6 (d, C-5), 73,6 (d, C-3), 125,9 (d, C-4′), 126,5 (d, C-2′, C-6’′), 127,8 (d, C-4′′), 128,4 (d, C-3′, C-5′), 128,5 (d, C-3′′, C-5′′), 128,6 (d, C-2′′, C-6′′), 130,2 (d, C-2), 131,9 (d, C-1), 136,6 (s, C-1′′), 141,9 (s, C-1′). Alpinentin (AP1.22 = AP3.13) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 15:15:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (26,9), 193 (54,5), 166 (100), 138 (56,3), 123 (19,3), 104 (54,7), 77 (28,3). Cardamomin (AP3.4 = AP1.20.3.2 = AP2.16) Bột vô định hình màu vàng. Rf = 0,14 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (54,7), 193 (100), 167 (34,4), 152 (46,8), 138 (15,1), 124 (12,8), 103 (31,1), 77 (45,4), 69 (37,8). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 3,88 (3H, s, 6′-CH3), 5,93 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3′), 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5′), 7,42-7,48 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,65 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hα), 7,71 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,5 Hz, H-2, H-6), 7,82 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hβ), 13,7 (1H, s, 5-OH). 13C-NMR/DEPT (DMSO-d6): δ 55,9 (q, 6′-OCH3), 91,7 (d, C-3′), 95,8 (d, C-5′), 127,5 (d, Cα), 128,2 (d, C-2, C-6), 128,9 (d, C-3, C-5), 130,1 (d, C-4), 134,9 (s, C-1), 141,6 (d, C-8), 162,6 (s, C-6′), 164,9 (s, C-4′), 166,1 (s, C-2′), 191,6 (C=O). β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.18) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 414 (46,7), 396 (68,0), 381 (20,7), 329 (23,3), 303 (27,3), 255 (29,3), 213 (33,3), 145 (41,3), 135 (100), 107 (41,3). 3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của S. G. Olga và cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH ) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng λ = 515 nm. Các mẫu có hoạt tính quét gốc tự do SC ≥ 50% sẽ được thử nghiệm để xác định giá trị SC50. Xác định giá trị SC50 (μg/ml); Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình Table Curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất khử. CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đối tượng nghiên cứu Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (T. L. Wu et S. J Chen) (Zingiberaceae) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 ở xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai. Mẫu tươi được xử lý và được sấy khô ở 40oC, sau đó nghiền nhỏ thành bột mịn. 4.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis Phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến việc phân tách lớp chất. Trong nghiên cứu này, một quy trình chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần đã được xây dựng. Mẫu sấy khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng (4 lần, mỗi lần trong ba ngày). Dịch chiết axeton nhận được sau khi cất loại dung môi được pha với nước cất và chiết lần lượt được với n-hexan, điclometan và etyl axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, ta thu được các phần chiết tương ứng, kí hiệu là AP1, AP2 và AP3. Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) được nêu trên Sơ đồ 1. Thân rễ tươi (20 kg) 1. Phơi khô, sấy ở 45-50oC 2. Xay thành bột mịn Bột khô xay mịn (1,6 kg) 1. Ngâm chiết với axeton ở nhiệt độ phòng 2. Cất loại axeton dưới áp suất giảm 3. Hoà phần chiết axeton bằng nước cất Dịch nước 1. Chiết bằng n-hexan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại n-hexan 1. Chiết bằng điclometan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại điclometan Phần chiết n-hexan (AP1, 21,1 g, 1,32%) 1. Chiết với etyl axetat 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại etyl axetat Phần chiết điclometan (AP2, 49,2 g, 3,01%) Dịch nước Phần chiết etyl axetat (AP3, 3,8 g, 0,23%) Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis 4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết n-hexan (AP1) 4.3.1 Phân tích phần chiết n-hexan(AP1) Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung môi n-hexan-axeton. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi phân giải tốt được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1) Hệ dung môi n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu 19:1 1 0,81 tròn xanh 2 0,23 tròn tím 9:1 1 0,95 dẹp tím 2 0,88 dẹp xanh 3 0,33 tròn to tím 4 0,06 tròn nhỏ vàng 6:1 1 0,98 dẹp tím 2 0,94 tròn to xanh nhạt 3 0,60 tròn nhỏ tím 4 0,50 tròn tím 5 0,33 tròn tím 6 0,15 tròn vàng 3:1 1 0,95 dẹp tím 2 0,88 dẹp xanh nhạt 3 0,66 tròn tím 4 0,55 tròn tím 5 0,44 tròn cam 6 0,40 tròn xanh 7 0,32 tròn vàng 8 0,20 tròn tím nhạt 1:1 1 0,92 dẹp tím 2 0,90 dẹp xanh 3 0