Luận văn Nghiên cứu quy trình giám định một số chất ma túy tổng hợp nhóm ats trong nước tiểu bằng phương pháp điện di mao quản

chất thƣờng dùng làm pha động trong CE Tên chất Giá trị pKi Tên chất Giá trị pKi Format 3,75 Trixin 8,05 Acetat 4,76 Bixin 8,25 Citrat 3,12; 4,76; 6,40 Tris 8,30 MES 6,13 TAPS 8,40 ACES 6,75 Borat 9,14 MOPSO 6,79 CHES 9,55 BES 7,16 CAPS 10,40 MOPS 7,20 Photphat 2,14; 7,10; 13,30 DIPSO 7,50 Histidin 1,78; 5,97; 8,97 HEPES 7,51 Lysin 2,20; 8,90; 10,28 HEPPSO 7,90 Arginin 2,18; 9,09; 13,20 1.5.3. Nguồn điện thế cao Là nguồn thế V một chiều nhất định đƣợc áp vào hai đầu mao quản để tạo ra lực điện trƣờng E và dòng điện I trong mao quản. Nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Điện thế V một chiều thƣờng đƣợc dùng là từ 15 - 40 kV/1m, hoặc từ 150 – 550 V/1cm mao quản để không cho dòng điện I quá lớn mà chỉ nên nằm trong vùng từ 10 - 75 µA. Việc chọn điện thế V là tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH và nồng độ của pha động điện di[6]. 1.5.4. Các kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản Tùy theo trang thiết bị, đối tƣợng phân tích và mục đích phân tích khác nhau mà có thể lựa chọn một kiểu bơm mẫu phù hợp trong 3 kiểu sau: 22 Hình 1.6. Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản * Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động lực học dùng áp suất Trong kĩ thuật này (hình 1.7-A): Dùng áp suất thích hợp để nén (đẩy) hoặc hút một lƣợng mẫu bơm vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định. * Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động lực học kiểu xiphông Trong kĩ thuật này (hình 1.7-B): Dựa vào sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định. Độ cao chênh lệch thƣờng từ 10 - 30 cm trong vài giây đến vài phút tùy thuộc vào hỗn hợp mẫu phân tích. * Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học Kĩ thuật này (hình 1.7-C) sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản trong thời gian nhất định. Ƣu điểm của kĩ thuật này là cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao, nhƣng lại có nhƣợc điểm rất lớn là diện tích pic (khi định lƣợng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau nên chỉ thƣờng dùng để định tính [6]. 1.5.5. Detector trong phương pháp điện di mao quản Detector là bộ phận có tác dụng phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình điện di. Tùy thuộc vào tính chất của hỗn hợp mẫu mà lựa chọn detector phù hợp. Các loại detector thƣờng dùng trong phƣơng pháp điện di mao quản bao gồm: Hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, phổ khối, điện thế (đo dòng, đo thế, đo độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [9] 23 Ngày nay ngƣời ta đặc biệt quan tâm và phát triển loại detector đa năng nhƣ detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D). Nó đƣợc sử dụng khá hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học, công nghệ, kinh tế và y dƣợc. * Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) [1] Detector đo độ dẫn là một trong những loại detector đƣợc đặc biệt chú ý, mặc dù thƣờng có độ nhạy thấp hơn so với một vài kĩ thuật điện hóa khác nhƣng lại có ƣu điểm là đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất phân tích khác nhau. Thêm vào đó là nó có thể thu nhỏ dùng cho các mao quản có đƣờng kính hẹp, thậm chí cho các microchip mà không ảnh hƣởng đến độ nhạy và các tính chất khác của detector. Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Đến năm 2002, nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV-C4D, 200V). Sau đó Hãng điện tử eDAQ của Úc đã phối hợp cùng với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser để phát triển nghiên cứu này. Nguyên lý hoạt động của detector đƣợc thể hiện trong hình 1.8. Hình 1.7. Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc Khi áp nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) vào điện cực thứ nhất, tại điện cực thứ hai xuất hiện tín hiệu đo ở dạng cƣờng độ dòng điện (I). Vì vậy, dòng điện thu đƣợc tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f. 24 Vđo = I x Rfeedback Tín hiệu đầu ra thu đƣợc ở dạng cƣờng độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ đƣợc chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vôn thế xoay chiều sau đó đƣợc chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trƣớc khi đƣợc hiển thị và lƣu trữ trên máy tính. Hình 1.8. Quá trình chuyển đổi tín hiệu của C4D Nhƣ vậy, detector đo độ dẫn không tiếp xúc ngoài ƣu điểm là phân tích đa năng còn có lợi thế là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo. Đó là do lợi dụng đƣợc tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của điện thế cao đến hệ điện tử của detector đảm bảo an toàn và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích, trong quá trình phân tách điện di. 25 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài là: Nghiên cứu quy trình giám định một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) trong mẫu nƣớc tiểu và mẫu bị bắt giữ (Viện Khoa học Hình sự cung cấp) bằng phƣơng pháp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C4D). 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Trên cơ sở mục tiêu đề ra, nội dung đề tài bao gồm: - Tổng hợp các tài liệu liên quan đến các chất ma túy tổng hợp nhóm ATS và các phƣơng pháp phân tích. - Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ƣu cho việc giám định đồng thời 4 chất ma túy tổng hợp nhóm ATS gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D), gồm: + Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm. + Khảo sát thời gian bơm mẫu. + Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản. + Khảo sát sự ảnh hƣởng của các cation đến việc giám định các chất. - Thẩm định, đánh giá phƣơng pháp phân tích + Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định khoảng tuyến tính (khoảng làm việc). + Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). + Đánh giá độ chụm của phƣơng pháp phân tích. + Đánh giá độ đúng của thiết bị và của phƣơng pháp phân tích. - Áp dụng phân tích hàm lƣợng 04 chất ma túy tổng hợp trong một số mẫu thực tế: mẫu bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu do Viện Khoa học Hình sự cung cấp. - Thực hiện phân tích đối chứng một số mẫu có hàm lƣợng các chất ma túy với phƣơng pháp phân tích tiêu chuẩn GC/MS do Viện Khoa học Hình sự thực hiện. 26 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích Phƣơng pháp phân tích trong luận văn là phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D). Thiết bị này đƣợc thiết kế và chế tạo bởi TS. Mai Thanh Đức và ThS Bùi Duy Anh kết hợp với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị có nguồn thế cao lên đến 20 kV, có thể thực hiện bán tự động (hình 2.1). Hình 2.1. Hệ điện di sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu Các mẫu đƣợc sử dụng trong luận văn gồm mẫu viên thuốc bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu thu đƣợc ở hiện trƣờng các vụ án hoặc tại các trại giam do Viện Khoa học Hình sự cung cấp. 2.2.2.1. Xử lý mẫu viên thuốc Lấy 1 viên thuốc nghiền thành bột và trộn đều. Cân 1 lƣợng bột chính xác (26,0 mg MA viên; 11,4 mg MA đá; 57,0 mg MDMA viên) trên cân phân tích (độ chính xác 0,1 mg). Sau đó cho vào bình định mức 10,0 mL, thêm 3,0 mL metanol (Riêng MDMA thêm 4 mL methanol vì mẫu này ở dạng bazơ khó tan), siêu âm khoảng 10 phút và định mức tới vạch bằng nƣớc đề ion. Hỗn hợp đƣợc ly tâm (8000 vòng/phút) trong 10 phút, tiếp đến đƣợc lọc qua màng 0,2 µm và pha với tỉ lệ thích hợp bằng nƣớc đề-ion trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE. 27 2.2.2.2. Xử lý mẫu nước tiểu 18 mẫu nƣớc tiểu thu trong vụ “Tổ chức sử dụng trái phép ma túy” đã đƣợc phân tích sàng lọc bằng phƣơng pháp thử miễn dịch (Các mẫu đƣợc đánh số thứ tự từ 1 - 18 ). Kết quả có 12/18 mẫu dƣơng tính ma túy nhóm ATS. Vì hàm lƣợng ma túy trong nƣớc tiểu thƣờng nhỏ nên cần đƣợc chiết xuất để làm giàu mẫu và loại bỏ bớt tạp chất trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE. Sau khi tham khảo tài liệu [2, 20] và căn cứ vào các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phòng thí nghiệm, chúng tôi thực hiện qui trình chiết xuất ma túy nhóm ATS trong mẫu nƣớc tiểu nhƣ sau: 1. Lấy mỗi mẫu 5 mL nƣớc tiểu vào ống nghiệm có nắp xoáy 2. Kiềm hóa mẫu về pH: 10-11 bằng dung dịch NH3 (kiểm tra bằng giấy quỳ) 3. Chiết mẫu bằng 2 mL etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút 4. Ly tâm cho tách lớp 5. Hút lớp etyl axetat (lớp trên) đuổi dung môi, đƣợc cặn chiết 6. Cặn chiết hòa tan vào 100 L methanol rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE-C 4 D và/hoặc GC-MS. 2.3. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) * Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [13]. * Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Thông thƣờng, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [13]. 2.3.2. Độ chụm ( độ lặp lại) của phương pháp Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, đƣợc tiến hành bằng một phƣơng pháp phân 28 tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (ngƣời phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn [13]. Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) theo các công thức sau [10, 13]:   1 2     n SS SD tbi (2.1) ;   100% x S SD RSD tb  (2. 2) Trong đó: - Si là diện tích của pic điện di thứ i - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n = 6) 2.3.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay bằng phƣơng pháp xác định độ thu hồi [10, 13]. Độ thu hồi (H): 100 lt tt C C H (2.3) Trong đó: H: hiệu suất thu hồi (%) Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lƣợng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE ta có độ đúng của thiết bị. Ngoài ra, độ đúng của phƣơng pháp còn đƣợc khẳng định qua việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả đo của một phƣơng pháp đối chứng tiêu chuẩn khác. 29 2.4. Thực nghiệm 2.4.1. Hóa chất Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích. 2.4.1.1. Chất chuẩn + MA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ =66,7%) + MDA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 82,8%) + MDMA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 40,0%) + MDEA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 84,66%) 2.4.1.2. Hóa chất dung môi + L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%) + L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lƣợng 99,5%) + Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức) + Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) + Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) + Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức) Nƣớc siêu tinh khiết (nƣớc đề-ion): là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết với các cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm 2.4.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất * Pha dung dịch chuẩn gốc Cân riêng từng chất trên cân phân tích (độ chính xác 0,1 mg) MA: 81,8 mg, MDA: 5,0 mg, MDMA: 96,1 mg, MDEA: 11,3 mg đƣợc pha trong dung môi là methanol với lƣợng thích hợp: MA: 3 mL, MDA: 2 mL, MDMA: 4 mL, MDEA: 4 mL, rung siêu âm trong 30 phút, sau đó thêm vào mỗi dung dịch 1 mL nƣớc thu đƣợc các dung dịch gốc có nồng độ tƣơng ứng là MA: 13600 ppm, MDA: 1380 ppm, MDMA:7690 ppm, MDEA: 1910 ppm. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh từ 2 - 8oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 1 năm. Từ dung dịch chuẩn trên ta có thể pha các dung dịch hỗn hợp 4 chất chuẩn (tỉ lệ nồng độ (ppm) MA : MDA : MDMA : MDEA là 2 : 8,3: 4,2 : 3,7 để làm việc có 30 các nồng độ khác nhau tƣơng ứng với nồng độ MA là: từ 0,3 – 90 ppm. Các dung dịch làm việc đƣợc pha hàng ngày. * Pha dung dịch đệm Các dung dịch đệm điện di đƣợc pha hàng ngày. Chất đệm đƣợc cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nƣớc đề-ion, sau đó đƣợc rung siêu âm 10 phút và chuẩn lại giá trị pH cần thiết trƣớc khi sử dụng. 2.4.2. Thiết bị dụng cụ * Thiết bị - Thiết bị điện di mao quản CE-C4D nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.1. - Máy lọc nƣớc đề-ion của hãng Sientech (Mỹ) - Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521 - Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH - Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g - Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu - Máy ly tâm LCEN-200 * Dụng cụ - Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh, pipet, micro pipep. - Pipetman với các cỡ: 20; 100; 200; 1000 và 5000 µL và đầu típ tƣơng ứng - Các bình định mức nhựa polipropilen (PP) 25 và 100 mL đƣợc sử dụng để pha các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm - Các lọ Falcon 15 mL, 45 mL và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn - Đầu lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,2 µm và 0,45 µm - Các xy lanh có đầu lọc để lọc mẫu - Mao quản đƣờng kính trong 50 µm, chiều dài 60 cm - Các dụng cụ thông thƣờng khác của phòng thí nghiệm 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát để tối ƣu điều kiện tách MA, MDA, MDMA, MDEA bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách các chất MA, MDA, MDMA, MDEA đƣợc thực hiện trên hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đƣờng kính trong 50 µm. Mẫu đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao 10 cm so với đầu mao quản còn lại. Độ cao này đƣợc cố định trong tất cả các thí nghiệm. 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm Trong phƣơng pháp CE, các yếu tố: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm có ảnh hƣởng rất lớn đến dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tốc độ di chuyển phân tử của các chất trong mao quản. Chúng ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng tách các chất trong quá trình phân tích. Vì vậy, cần thiết phải khảo sát lựa chọn điều kiện tối ƣu cho các thông số này trong điều kiện cụ thể. Ngoài ra, cần phải khảo sát thêm các yếu tố khác cũng gây ảnh hƣởng đến khả năng tách và/hoặc cƣờng độ tín hiệu nhƣ: thời gian bơm mẫu, thế tách và các chất cản trở khác 3.1.1.1. Khảo sát thành phần của hệ đệm điện di Thành phần hệ đệm là một yếu tố có ảnh hƣởng rất nhiều đến khả năng xuất hiện và tách chất trong quá trình điện di. Vì vậy, công việc quan trọng là tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của hệ đệm. Hệ đệm đƣợc khảo sát gồm một trong hai hợp phần bazơ thƣờng sử dụng trong phƣơng pháp CE-C4D là Arginine (Arg) (pKa = 9,09) hoặc Histidine (His) (pKa = 8,97), kết hợp với một trong số hợp phần axit thông dụng nhƣ phosphoric (Phos), ascorbic (Asc) hoặc acetic (Ace). Trong đó, hợp phần bazơ đƣợc giữ nguyên nồng độ 10 mM và dùng hợp phần axit để điều chỉnh đến pH mong muốn bằng máy đo pH. Qua tham khảo tài liệu [15] cho thấy giá trị pH = 4,5 là phù hợp để tách các chất. Do đó, việc khảo sát thành phần hệ đệm điện di sẽ đƣợc thực hiện ở pH này. 32 Quá trình khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di đƣợc thực hiện với các điều kiện sau: - Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của MA: 40,0 ppm, MDA: 166,5 ppm, MDMA : 83,0 ppm và MDEA : 73,5 ppm trên 4 hệ đệm khác nhau gồm: Arg/Phos, His/Ace, Arg/Asc và Arg/Ace. - Thế điện di 10 kV, chiều cao bơm mẫu 10 cm, thời gian bơm mẫu là 15 s Các kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm thể hiện trong bảng 3.1; hình 3.1; hình 3.2. Bảng 3.1. Sự phụ thuộc diện tích pic của MA, MDA, MDMA và MDEA vào thành phần hệ đệm điện di 12001000800600400200 MA MDA MDMA MDEA Thêi gian di chuyÓn (s) His/Asc Arg/Phos Arg/Ace Arg/Asc 10 mVMA MDA MDMA MDEA Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của MA, MDA, MDMA, MDEA Chất phân tích Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) Đệm Arg/Phos Đệm His/Asc Đệm Arg/Asc Đệm Arg/Ace MA 40,0 48,8 36,4 50,8 51,6 MDA 166,5 28,5 10,3 29,8 30,1 MDMA 83,0 20,6 12,0 22,9 23,0 MDEA 73,5 18,1 34,6 32,5 34,8 33 48,8 36,4 50,8 51,6 28,5 10,3 29,8 30,1 20,6 12 22,9 23 18,1 34,6 32,5 34,8 0 10 20 30 40 50 60 Arg/Phos His/Asc Arg/Asc Arg/Ace Diệ n t ích pi c ( mV .s) MA MDA MDMA MDEA Hình 3.2. Sự phụ thuộc diện tích pic của MA, MDA, MDMA, MDEA vào thành phần hệ đệm điện di Từ các kết quả trên cho thấy, hệ đệm sử dụng hợp phần bazơ là histidin cho đƣờng nền không tốt, độ phân giải thƣờng thấp và tín hiệu của các chất nhỏ hơn nhiều so với hệ đệm sử dụng hợp phần bazơ là arginin. Trong 3 hệ đệm sử dụng Arginin thì hệ đệm sử dụng axit acetic cho kết quả đƣờng nền, diện tích pic và độ phân giải giữa các pic tốt hơn hệ đệm sử dụng axit ascorbic và phosphoric. Vì thế, hệ đệm này đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.1.2. Khảo sát pH của dung dịch đệm điện di Với một hệ đệm nhất định thì giá trị pH là yếu tố quyết định trực tiếp đến quá trình tách điện di của các chất. Khi giá trị pH thay đổi sẽ làm thay đổi độ điện di và tốc độ di chuyển của dòng EOF. Do đó công việc quan trọng là phải tìm đƣợc giá trị pH thích hợp và giữ không đổi trong suốt quá trình điện di. Qua tham khảo tài liệu [15], chúng tôi nhận thấy giá trị pH = 4,5 là phù hợp để tách các chất. Vì vậy, khoảng pH đƣợc chọn để thực hiện việc khảo sát nhằm tìm ra giá trị pH phù hợp nhất là: 4,0 - 6,0. Các điều kiện khác dùng để khảo sát bao gồm: - Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của MA: 40,0 ppm, MDA: 166,5 ppm , MDMA: 83,0 ppm, MDEA: 73,5 ppm. - Các giá trị pH khảo sát xung quanh giá trị pH = 4,5 là: pH = 4,0; pH = 5,0; pH = 5,5 và pH = 6,0. Các giá trị pH này đƣợc điều chỉnh bằng máy đo pH trên cơ sở giữ nguyên nồng độ của hợp phần bazơ (Arginin - Arg) là 10 mM và thêm dần hợp phần axit (axit Acetic - Ace) vào đến khi đạt giá trị pH mong muốn. 34 - Thế điện di 10 kV, chiều cao bơm mẫu 10 cm với thời gian 15 s hoặc 45 s. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH với 4 giá trị pH nằm trong khoảng từ 4,0 đến 6,0 đƣợc nêu trong bảng 3.2; hình 3.3; hình 3.4; hình 3.5. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của MA, MDA, MDMA, MDEA Chất phân tích Nồng độ (ppm) pH = 4,0 pH = 4,5 pH = 5,0 pH = 5,5 pH = 6,0 Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) MA 40,0 50,4 890 52,8 845 50,4 820 50,1 770 30,1 710 MDA 166,5 28,7 910 30,7 878 28,6 830 28,3 790 18,0 740 MDMA 83,0 21,4 925 22,6 935 22,6 850 22,6 810 16,0 760 MDEA 73,5 33,4 980 35,5 982 35,2 970 35,1 830 35,0 790 12001000800600400200 pH=4,0 pH=4,5 pH = 5,0 pH = 5,5 pH = 6,0 10 mV Thêi gian di chuyÓn (s) MA MDA MDMA MDEA Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của MA, MDA, MDMA, MDEA 35 Từ điện di đồ thể hiện sự phân tách thay đổi theo pH của dung dịch đệm ta thấy khi giá trị pH thay đổi thì diện tích của các pic và độ phân giải giữa các pic gần nhau cũng thay đổi. Trong số 4 pic của các chất phân tích có thể thấy 3 pic MA, MDA, MDMA có thể ảnh hƣởng dến sự xuất hiện đồng thời trên điện di đồ. Để đánh giá tốt hơn điều này, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic ở giữa (MDA) và độ phân giải giữa 2 pic gần nhau nhất là MDA và MDMA vào pH. Kết quả thể hiện trên hình 3.4 Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tín hiệu diện tích pic của MDA và độ phân giải R của 2 pic MDA và MDMA phụ thuộc vào pH của dung dịch đệm điện di Các kết quả khảo sát trong khoảng pH từ 4,0 - 6,0 cho thấy, khi pH tăng thì tổng thời gian phân tích giảm nhƣng đồng thời diện tích pic và khả năng tách pic của các chất cũng giảm. Điều này đƣợc giải thích là khi pH của dung dịch đệm thay đổi sẽ làm thay đổi điện tích, tốc độ của các chất, từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Với các chất phân tích là MA, MDA, MDMA, MDEA đều có giá trị pKa > 9,0. Do đó, trong khoảng pH khảo sát từ 4,0 - 6,0 (các giá trị pH đều nhỏ hơn giá trị pKa của các chất phân tích) nên chúng đều tồn tại ở dạng cation. So sánh kết quả khảo sát thu đƣợc với các giá trị pH khác nhau trong khoảng từ 4,0 đến 6,0 thì chỉ có ở giá trị pH = 4,5 cho kết quả các chất tách tốt nhất (vì độ 36 phân giải giữa hai pic gần nhau nhất là MDA và MDMA là lớn nhất), pic gọn nhất, diện tích pic của các chất lớn nhất, tín hiệu đƣờng nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý. Do đó, pH = 4,5 đƣợc lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu tham khảo tài liệu [15]. 3.1.1.3. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện di Sau khi đã tối ƣu đƣợc pH và thành phần của hệ đệm, công việc tiếp theo là khảo sát tối ƣu nồng độ của dung dịch đệm. Trong phƣơng pháp CE, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trƣờng điện ly ổn định. Nếu nồng đệm nhỏ không ổn định sẽ tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản, làm ảnh hƣởng đến quá trình di chuyển của các ion. Qua tham khảo tài liệu [8, 19] cho thấy nồng độ các cấu tử của hợp phần bazơ của dung dịch đệm điện di sử dụng trong phƣơng pháp CE- C 4D thƣờng từ 10 mM trở lên. Do đó, việc khảo sát đƣợc thực hiện với các nồng độ bazơ trong đệm từ 10 mM trở lên, cụ thể là: hệ đệm Arg/Ace với pH = 4,5 có các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM. Các điều kiện khác là: - Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của MA: 40,0 ppm; MDA: 166,5 ppm ; MDMA: 83,0 ppm; MDEA: 73,5 ppm. - Thế điện di 10 kV, thời gian bơm mẫu 15 s, chiều cao bơm mẫu 10 cm Kết quả khảo sát này đƣợc thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.5 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của MA, MDA, MDMA, MDEA vào nồng độ dung dịch đệm điện di Chất phân tích Nồng độ (ppm) 10Mm 15mM 20mM Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) MA 40,0 51,5 945 31,2 982 30,6 970 MDA 166,5 30,1 978 19,1 998 18,5 990 MDMA 83,0 22,5 925 14,5 1035 13,6 1110 MDEA 73,5 35,2 980 23,1 1100 22,8 1180 37 12001000800600400200 10 mM 15 mM 20 mM Thêi gian di chuyÓn (s) MA MDA MDMA MDEA 10 mV Hình 3.5. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến quá trình phân tách các chất MA, MDA, MDMA, MDEA Từ kết quả ở điện di đồ hình 3.5 và bảng 3.3 cho thấy: Khi tăng nồng độ dung dịch đệm điện di thì thời gian di chuyển của cả 4 chất phân tích (MA, MMDA, MDMA, MDEA) đều tăng nhƣng tín hiệu (diện tích) pic lại giảm. Điều này đƣợc giải thích là do khi tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của các ion dƣơng và ion âm tăng. Do đó làm tăng thời gian di chuyển của chất tan. Khi nồng độ đệm tăng cũng làm tăng độ dẫn điện của dung dịch điện ly nền, làm giảm tín hiệu của các chất phân tích. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng thì nồng độ các ion tăng, thƣờng làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện của lớp điện kép với thành mao quản. Do đó làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng nên đƣờng nền nhiễu, khả năng tách chất kém và pic không cân đối (nhƣ kết quả ở nồng độ đệm là 20 mM và 15mM ). Ở nồng độ đệm 10 mM cho hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất đƣợc tách tƣơng đối tốt và diện tích pic của các chất phân tích thu đƣợc lớn hơn. Thời gian phân tích ở nồng độ đệm 15 mM và 20 mM thì dài hơn. Độ phân giải các pic ở 10 mM là tốt. Do đó, hệ đệm Arg/Ace có nồng độ 10 mM đƣợc chọn là điều kiện tối ƣu cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu Trong phƣơng pháp điện di mao quản, lƣợng mẫu (vùng mẫu) đƣợc nạp vào phải đủ lớn và ổn định để đảm bảo cho quá trình điện di có độ nhạy tốt.