Luận văn Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu nước tiểu để phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ats bằng phương pháp CE - C4D

điều kiện phân tích để tách đồng thời 4 chất ma túy MA, MDA, MDMA và MDEA; giới hạn phát hiện của MA sau khi chiết và trước khi chiết là 10ppb và 500ppb [29]. Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu thường khá phức tạp, chứa rất nhiều chất khác nhau như ezym, vitamin, axit amin, các hợp chất hữu cơ khác và đặc biệt là một lượng lớn các ion như: Na+, NH4+, Mg2+, Cl-, SO42-, Hơn nữa, hàm lượng các chất ma túy tổng hợp có thể rất thấp nên các thành phần khác trong nền mẫu sẽ gây khó khăn cho phương pháp phân tích. Vì thế, để có kết quả phân tích tốt thì việc làm sạch và làm giàu mẫu là rất cần thiết. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu nước tiểu để phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS bằng phương pháp CE-C4D” trên cùng thiết bị đo mà không khảo sát lại điều kiện tối ưu, nhằm nâng cao khả năng ứng dụng của phương pháp CE-C4D đối với phân tích ma túy nói riêng và các nhóm chất khác nói chung, đáp ứng nhu cầu thực tế. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về ma túy tổng hợp nhóm ATS Ma túy là các chất gây nghiện có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo [2], khi đưa vào cơ thể sống có thể làm thay đổi một hay nhiều chức năng tâm - sinh lý của cơ thể. Sử dụng ma túy nhiều lần sẽ bị lệ thuộc cả về thể chất lẫn tâm lý, gây hậu quả nghiêm trọng cho cá nhân, gia đình và xã hội. Ma túy tổng hợp dạng Amphetamine (Amphetamine - ATS - amphetamine-type-stimulans) là những chất ma túy được tổng hợp ra từ các hóa chất ban đầu (tiền chất). Chúng có tác dụng kích thích nhất thời hệ thống thần kinh trung ương gây hưng phấn và ảo giác hoang tưởng. Ngoài Amphetamine, Methamphetamine (MA) và MDMA (còn gọi là Ecstasy) thì trong nhóm này còn có rất nhiều chất khác nhau, được quy định trong Công ước quốc tế năm 1971 về sác chất hướng thần như: MDA, MDE, MDEA, PMA, MMDA...Chúng có cấu trúc hóa học tương tự nhau trên cơ sở khung của Amphetamine, do đó có tác dụng dược lý giống nhau. Đặc điểm và dạng dùng: Khác với heroine và các chất ma túy khác là các chất này chỉ có hiệu lực tác dụng tối đa, gây cảm giác đê mê khi được đưa trực tiếp vào cơ thể qua đường máu. Nếu sử dụng bằng hình thức uống thì chúng bị dịch tiêu hóa phân hủy làm giảm tác dụng đáng kể. Vì vậy, trong thực tế Heroine và các chất ma túy khác có nguồn gốc thuốc phiện chỉ thấy sử dụng qua đường tiêm, chích hoặc hút, hít mà không sử dụng bằng đường uống. Các chất ATS có hiệu lực tác dụng khi đưa vào cơ thể bằng đường trực tiếp là vào máu và cả đường tiêu hóa. Chính vì thế, ngoài các hình thức sử dụng như đối với các chất ma túy khác, ma túy tổng hợp còn được sử dụng bằng hình thức uống. Trong thực tế, một số ít trường hợp gặp các chất ma túy tổng hợp ATS dưới dạng ống tiêm hay bột để pha tiêm, hút, hít, hình thức phổ biến nhất vẫn là ở dạng viên nén, viên nhộng để uống với nhiều hình dáng, kích thước, màu sắc và những ký hiệu rất khác nhau. 1.2. Tình hình sử dụng ma túy tổng hợp nhóm ATS trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Trên thế giới Theo báo cáo của UNDOC về số người sử dụng ma tuý cho hay, toàn cầu có từ 172 đến 250 triệu người từng sử dụng ma tuý trái phép ít nhất một lần trong năm. 16 đến 51 triệu người sử dụng duợc chất ma tuý thuộc nhóm amphetamin; 12 đến 24 triệu người sử dụng ma tuý tổng hợp estasy. Những con số trên đây là tính cả những người từng một lần thử qua ma tuý (có thể chưa nghiện). Còn về số người nghiện ma tuý kinh niên, UNODC ước tính vào khoảng 18 đến 38 triệu người. Hằng năm có khoảng 200.000 người chết vì ma túy. Thực tế này cho thấy ma túy có ảnh hưởng xấu đến kinh tế, văn hóa của toàn thế giới. Vì vấn đề nghiêm trọng nên ngày 26/6 hàng năm được Liên Hợp Quốc chọn làm “Ngày quốc tế phòng, chống lạm dụng ma túy” [10]. Methamphetamine thống lĩnh thị trường các loại ma túy tổng hợp toàn cầu và đang mở rộng ở Đông Á và Đông Nam Á. Sử dụng methamphetamine dạng tinh thể ngày càng tăng ở các khu vực thuộc Bắc Mỹ và châu Âu. Hiện nay, ATS vẫn là chất ma túy chủ yếu sử dụng ở Nhật. Ngoài ra, số nguời đã sử dụng ATS ở Thụy Sĩ là 8%, Đức 2,8%, Tiệp Khắc 1,6%, Brazil là 5%. Tại Úc 25% nam và 12% nữ tuổi từ 20- 24 đã thử dùng ATS. Số lượng các vụ bắt giữ ATS kể từ năm 2009 – tăng gần gấp đôi ở mức trên 144 tấn trong năm 2011 và 2012, và vẫn ở mức độ cao vào năm 2013 – cho thấy thị trường ATS mở rộng nhanh chóng trên toàn cầu. Cho đến tháng 12 năm 2014, có tổng cộng 541 loại chất kích thần mới (NPS) có tác động tiêu cực đến sức khỏe đã được phát hiện và báo cáo tại 95 quốc gia và vùng lãnh thổ - gia tăng 20% so với số lượng 450 loại của năm ngoái. 1.2.2. Ở Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình buôn bán, vận chuyển ma túy ngày càng phức tạp. Cuộc chiến chống buôn lậu ma túy đã diễn ra trên 30 năm qua, ngày càng trở lên khốc liệt. Bọn tội phạm ma túy tự trang bị vũ khí quân dụng, ngày càng hung hăng, dùng mọi phương tiện để vận chuyển ma túy vào Việt Nam hay quá cảnh từ Việt Nam đi các nước khác. Trong vài năm gần đây, trên hai tuyến biên giới Việt nam - Lào và Việt - Trung các lực lượng chức năng đã phát hiện, bắt giữ gần 5.340 vụ (chiếm 30% tổng số vụ bị bắt giữ trên toàn quốc). Điều đáng lưu ý là số vụ và lượng ma túy tổng hợp (chủ yếu là ma túy đá) bị phát hiện, bắt giữ gia tăng nhanh chóng. Các hình thức vận chuyển, cất giấu tinh vi, xảo quyệt như cất giấu trong hàng hóa, trong cơ thể, hành lý để vận chuyển qua đường hàng không,.... Theo thống kê của Bộ Công an, 6 tháng đầu năm 2013, trong nhiều loại ma túy bị bắt giữ, có tới 46 kg và 140 nghìn viên ma túy tổng hợp [10]. Trong năm 2014, tình hình mua bán, sử dụng ma túy tổng hợp, nhất là ma túy tổng hợp dạng “đá” tiếp tục gia tăng, đặc biệt trong giới trẻ; số lượng ma túy tổng hợp thu giữ được trong năm 2014 nhiều hơn 147,7 kg ma túy tổng hợp so với năm 2013. Nguồn ma túy tổng hợp tại Việt Nam chủ yếu từ Trung Quốc vận chuyển qua các biên giới thuộc tỉnh Quảng Ninh và Lạng Sơn vào nội địa. Bên cạnh đó, đối tượng phạm tội tiếp tục tìm cách sản xuất ma túy tổng hợp để tiêu thụ ngay trong nội địa. Năm 2014, Lực lượng Cảnh sát điều tra tội phạm về ma túy đã phối hợp với các lực lượng chức năng phát hiện, bắt giữ 19195 vụ với 28880 đối tượng liên quan đến tội phạm ma túy; thu giữ 573,2 kg heroin; 19,3 kg cocain; 28,8 kg thuốc phiện; 1536 kg cần sa; 231,2 kg và 165314 viên ma túy tổng hợp cùng nhiều phương tiện, tài sản, vật chứng khác. Một nghiên cứu về thực trạng sử dụng ma túy tổng hợp ở các thành phố lớn cho thấy thuốc lắc (MDMA) là loại ATS phổ biến ở cả 3 thành phố, cao nhất là ở thành phố Hồ Chí Minh với gần 80% đối tượng nghiên cứu báo cáo có sử dụng loại ATS này. Methamphetamin cũng là loại ATS sử dụng phổ biến ở Hà nội và thành phố Hồ Chí Minh (61,00% và 87.12%). Theo nhóm tuổi, các loại ATS như thuốc lắc hay methamphetamin sử dụng phổ biến ở tất cả các nhóm tuổi (xấp xỉ từ 50% đối tượng từng nhóm tuổi sử dụng), trong đó sử dụng phổ biến hơn ở nhóm dưới 40 tuổi [12]. Như vậy, để thực hiện đẩy lùi được ma túy thì việc quan trọng là phải có nguồn chứng cứ kịp thời nhằm thực thi luật pháp và điều trị ngộ độc, cai nghiện. Do đó việc xây dựng một phương pháp giám định ma túy nhanh, chính xác là rất cần thiết. 1.3. Một số phương pháp xác định ma túy tổng hợp nhóm ATS Việc phân tích ma túy tổng hợp nhóm ATS được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như các phương pháp sắc ký, phương pháp điện hóa, phương pháp phân tích miễn dịch học, phương pháp điện di mao quản Phương pháp điện hóa E.M.P.J. Garrido cùng cộng sự [15] đã tiến hành nghiên cứu tính chất điện hóa của amphetamin (A), methamphetamin (MA), methylenedioxyamphetamin (MDA) và methylenedioxymethamphetamin (MDMA) trong các dung dịch đệm khác nhau bằng phương pháp vôn ampe vòng, sóng vuông, xung vi phân trên điện cực glassy carbon trong khoảng pH 1,2 đến 12,2. Với MA, sóng anot xuất hiện ở pH trên 9, Ep = +0,92V. Ở pH 2 có thể quan sát được sóng anot của MDA, Ep = +1,17V. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của MDMA khi sử dụng phương pháp von ampe xung vi phân tương ứng là 1,2 và 3,7 µM. Các tác giả đã định lượng MDMA trong mẫu huyết tương thêm chuẩn. Kết quả thu được hiệu suất thu hồi 99,5%; 100,6%; 100,2%, độ lệch chuẩn (RSD) 1,4; 0,9; 1,1 % tương ứng với các mức hàm lượng thêm chuẩn 15; 30; 45µM. Phương pháp ELISA Nguyên tắc: Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Marleen Laloup và cộng sự [24] đã sử dụng phương pháp này để xác định amphetamin, MDMA, MDA trong mẫu máu và nước bọt. Phương pháp phân tích này có thể dự đoán được sự hiện diện của một trong hai amphetamin hoặc MDMA/MDA (MDMA và sản phẩm chuyển hóa của nó MDA) với độ nhạy đạt 98,3% và độ đặc hiệu 100%. Đây là một kỹ thuật sàng lọc nhanh và chính xác để xác định amphetamin, MDMA/MDA trong các mẫu nước bọt và huyết tương dương tính. 1.4. Các phương pháp xử lý mẫu phẩm sinh học Hàm lượng ma túy nhóm ATS trong mẫu phẩm sinh học thường nhỏ vì thế việc nghiên cứu phương pháp để xử lý làm giàu mẫu là rất cần thiết. Hiện nay có 2 phương pháp chiết xuất thuờng dùng là chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn. Phương pháp chiết lỏng – lỏng Chiết lỏng-lỏng là phương pháp chiết dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau thường một pha là nước và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít hòa tan trong nước. Quá trình chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ được thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tương tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [8,9]. Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết. Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ: + Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không được trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích; + Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt + Cân bằng chiết đạt được nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết được tốt + Phải chọn được điều kiện chiết tối ưu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia Phương pháp chiết lỏng – lỏng có thể áp dụng cho các chất bay hơi, chất lỏng và rắn với những ưu điểm như các thiết bị đơn giản, hiện có rất nhiều dung môi tinh khiết với độ hòa tan và chọn lọc tốt, hòa tan mẫu thuận lợi và phù hợp với thiết bị sắc ký. Phương pháp chiết pha rắn Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp thụ pha rắn với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau [8]. Hiện nay chiết pha rắn đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do những ưu điểm sau: + Hiệu suất thu hồi cao + Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch + Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất + Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt + Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn Như vậy, có thể nhận thấy có nhiều phương pháp xác định các chất ma túy nhưng các phương pháp này đều đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, yêu cầu kỹ thuật cao. Tuy nhiên, phương pháp điện di mao quản cho thấy rất có tiềm năng bởi vì phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) là phương pháp phân tích mới với những ưu điểm như: thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp, hoạt động đơn giản, có thể tự động hóa và triển khai phân tích ngay tại hiện trường với một lượng nhỏ mẫu và hóa chất phục vụ kịp thời quá trình điều tra. Do đó, chúng tôi tập trung nghiên cứu quy trình phân tích một số chất ma túy tổng hợp ATS trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, kết nối kiểu tụ điện. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của luận văn là: Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu nước tiểu để phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) bằng phương pháp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C4D). 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm: - Tổng quan tài liệu về các phương pháp khác nhau để xác định đồng một số hợp chất ma túy tổng hợp nhóm ATS và các phương pháp xử lý mẫu nước tiểu. - Xây dựng đường chuẩn của các chất phân tích. Đánh giá phương pháp phân tích (xác định LOD, LOQ, độ đúng, độ chụm). Nghiên cứu, tối ưu quy trình chiết lỏng và chiết pha rắn để xử lý làm sạch, làm giàu mẫu nước tiểu. Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu do Viện Khoa học hình sự và Đội giám định hóa học – Phòng kỹ thuật hình sự - CATP Hà Nội cung cấp. Thực hiện phân tích đối chứng một số mẫu bằng phương pháp GC/MS do Viện Khoa học hình sự thực hiện. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích là phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE – C4D). Thiết bị này được thiết kế và chế tạo bởi Công ty 3Sanalysis ( trên cơ sở hợp tác với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị có nguồn thế cao lên đến 20kv, có thể thực hiện bán tự động (hình 2.1). Hệ thiết bị này hiện đang được triển khai nghiên cứu hoàn thiện và phát triển ứng dụng tại Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [1]. Hình 2.1. Hệ thiết bị CE-C4D (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) 2.3. Hóa chất và thiết bị 2.3.1. Hóa chất Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion. 2.3.1.1. Chất chuẩn MA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ =80,2%) MDA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 82,8%) MDMA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 83,71%) MDEA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 84,66%) 2.3.1.2. Hóa chất, dung môi L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng > 99,5%) Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức) Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) Axit photphoric (H3PO4) (PA, Deajung, Hàn Quốc, 85%) Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức) Etyl axetat (CH3COOC2H5), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,9%) 2-propanol (C3H8O), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,8%) Diclometan (CH2Cl2), (PA, Deajung, Hàn Quốc, 99%) 2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất * Pha các dung dịch chuẩn gốc Cân chính xác từng chất phân tích trên cân phân tích (độ chính xác 0,1mg): 0,0125 g MA, 0,0121 g MDA, 0,0119 g MDMA, 0,0118 g MDEA chuyển vào bình định mức 10,0 mL, thêm 4 mL Methanol và đem rung siêu âm 30 phút sau đó định mức đến vạch bằng nước deion ta được các dung dịch chuẩn gốc 1000ppm. Các dung dịch chuẩn nồng độ nhỏ hơn được pha loãng bằng nước deion theo tỉ lệ thích hợp từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm trước khi phân tích. * Pha dung dịch đệm điện di Dung dịch pha động điện di kết hợp giữa Arginine và axit acetic được pha như sau: Cân chính xác 0,0435g Arginine chuyển vào cốc có mỏ 50,0 mL rung siêu âm trong 5 phút cho tan hết sau đó thêm từ từ axit axetic vào đến khi pH của dung dịch là 4.5 (sử dụng máy đo pH). Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phương pháp (CE-C4D) đã được sử dụng để nghiên cứu tách và xác định đồng thời một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS [29] và bước đầu đã đạt được một số kết quả về điều kiện tối ưu phân tích 4 chất ma túy MA, MDA, MDMA và MDEA. Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu phức tạp và hàm lượng các chất phân tích trong nước tiểu thường rất nhỏ nên việc xử lý mẫu là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào quy trình xử lý mẫu nước tiểu trên cơ sở kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn nhằm nâng cao hiệu quả phân tích bốn chất ma túy nhóm ATS nêu trên bằng phương pháp CE-C4D. Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm: xây dựng và đánh giá lại đường chuẩn, giá trị LOD, LOQ tại thời điểm nghiên cứu; khảo sát điều kiện tối ưu xử lý mẫu nước tiểu trên cơ sở kỹ thuật lỏng -lỏng và chiết pha rắn (SPE) nhằm nâng cao hiệu quả phân tích; áp dụng phân tích một số mẫu thực tế và tiến hành đối chứng với phương pháp truyền thống (GC-MS) do Viện Khoa học Hình sự thực hiện. 3.1. Xây dựng đường chuẩn của các chất phân tích 3.1.1. Xây dựng đường chuẩn Các dung dịch sử dụng để lập đường chuẩn có nồng độ trong khoảng 5÷120 với MA và 10÷140ppm với MDA, MDAM, MDEA và được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc ban đầu. Mỗi dung dịch được bơm 3 lần và thực hiện quá trình điện di trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc với các điều kiện tối ưu như sau: Mao quản silica đường kính trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60cm (chiều dài hiệu dụng 53cm). Phương pháp bơm mẫu: Thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10 cm. Thời gian bơm mẫu: 45 s Dung dịch đệm điện di: Arg/Ace (10 mM) pH = 4,5. Thế tách: 10 kV Giá trị diện tích pic trung bình là kết quả được sử dụng để lập đường chuẩn. Bảng 3.1. Phương trình hồi quy của các chất phân tích Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 MA y = (-0,9818±2,0367) + (2,0003±0,0564)x 0,9994 MDA y = (-0,9677±1,8107) + (1,0187±0,0251)x 0,9995 MDMA y = (-1,2708±2,0969) + (1,3137±0,0290)x 0,9989 MDEA y = (-0,8904±3,7057) + (1,3182±0,0513)x 0,9996 Từ các kết quả trên cho thấy hệ số tương quan R2 của các chất phân tích đều lớn hơn 0,99 đồng thời giá trị P value<0,05 chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính. 3.2. Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện của quá trình chiết lỏng - lỏng nhằm xác định MA, MDA, MDMA, MDEA trong mẫu nước tiểu 3.2.1. Khảo sát dung môi chiết Trong kỹ thuật chiết lỏng-lỏng việc lựa chọn được dung môi là vô cùng quan trọng. Để có được kết quả chiết tốt, dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu, hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được triệt để. Dựa trên cơ sở này và tham khảo các tài liệu [1,7], chúng tôi đã lựa chọn 3 hệ dung môi sau để khảo sát: Dung môi 1: Cloroform/isopropanol(9/1v/v) Dung môi 2: Diclometan/ isopropanol (9/1 v/v) Dung môi 3: Etyl axetat Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.5: Hình 3.5. Điện di đồ xác định 4 chất ma túy trong nhóm ATS với các dung môi chiết khác nhau (đường 1,2,3 tương ứng với dung môi 1,2,3) Từ kết quả trên ta thấy etyl acetat là dung môi cho hiệu quả chiết tốt nhất, hiệu suất thu hồi từ 78-102%. Ngoài ra, etyl acetat lại dễ bay hơi, không độc hại rất thuận lợi cho quá trình chiết nên chúng tôi lựa chọn dung môi này cho các khảo sát tiếp theo. 3.2.2. Khảo sát pH của môi trường chiết Hệ số phân bố của dung môi chiết phụ thuộc vào độ pH của dung dịch vì vậy sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quá trình chiết về độ thu hồi cũng như khả năng làm sạch, làm giàu mẫu. Mà các chất phân tích có pKa trong khoảng 9,7 - 9,9, vì thế chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường chiết đến hiệu suất chiết trong khoảng pH xung quanh giá trị pKa, cụ thể là từ 7 đến 11, sử dụng NH4OH để điều chỉnh pH. Kết quả được thể hiện trong hình 3.7: Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi vào pH môi trường chiết Từ kết quả trên ta thấy, tại pH từ 8-10 cho hiệu quả chiết tốt đối với tất cả các chất phân tích.Trong đó, hiệu suất thu hồi tại pH=9 là cao nhất do vậy chúng tôi lựa chọn pH =9 là pH chiết tối ưu. 3.2.3. Khảo sát thể tích dung môi chiết Thể tích dung môi chiết ảnh hưởng đến chất lượng chiết mẫu. Nếu lượng dung môi ít thì hiệu quả chiết không cao, còn nếu lượng dung môi quá nhiều sẽ không làm tăng hiệu quả chiết, thậm chí sẽ gây khó khăn trong quá trình cô đuổi dung môi và tốn kém khi phân tích đồng thời nhiều mẫu. Việc khảo sát thể tích dung môi chiết được thực hiện với 4 mức thể tích dung môi etyl axetat khác nhau là 1ml, 2ml, 3ml, 4ml và được chiết lặp 2 lần. Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.8 và hình 3.9: Hình 3.8. Điện di đồ kết quả khảo sát với lượng dung môi chiết khác nhau Như vậy, quy trình chiết lỏng – lỏng tối ưu như sau: Lấy 5 ml mẫu nước tiểu vào ống nghiệm có nắp xoáy; kiềm hóa mẫu về pH = 9 bằng dung dịch NH4OH 25% (kiểm tra bằng giấy quỳ); chiết mẫu bằng 3 ml etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút; ly tâm cho tách lớp; hút lớp etyl axetat (lớp trên), đuổi dung môi bằng dòng khí N2, hòa tan cặn chiết với lượng metanol thích hợp (100µL) rồi phân tích trên thiết bị CE-C4D. Với quy trình này, giới hạn phát hiện đạt được với MA là 10ppb, với MDA, MDMA, MDEA là 50ppb. 3.3. Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện của quá trình chiết pha rắn nhằm xác định MA, MDA, MDMA, MDEA trong mẫu nước tiểu 3.3.1. Khảo sát lựa chọn cột chiết Dựa trên các vật liệu sẵn có trong phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng hai loại cột SCX và C18 để tiến hành xử lý mẫu. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu trên cơ sở sử dụng hai loại cột chiết C18 và SCX được thể hiện trong hình 3.10 và bảng 3.16: Bảng 3.16. Hiệu suất thu hồi của quá trình chiết khi sử dụng cột SCX và cột C18 Loại cột Hiệu suất thu hồi (%) MA MDA MDMA MDEA SCX 79,9 36,3 - 60,0 C18 71,5 79,9 82,1 88,9 Kết quả trên cho thấy khi sử dụng cột SCX không phát hiện được tín hiệu của chất MDMA và độ thu hồi của các chất khá thấp. Mặt khác với cột C18 phát hiện được tất cả các chất phân tích, độ thu hồi từ 71 ÷ 89%. Do đó, chúng tôi lựa chọn cột C18 cho những khảo sát tiếp theo. 3.4.2. Khảo sát pH của dung dịch đệm Qua tham khảo tài liệu [14, 22], chúng tôi tiến hành khảo sát ở các pH khác nhau: 5; 6; 7; 8 (đệm photphat) và pH 9; 10 (đệm amoni). Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.11, 3.12 và bảng 3.17: 1: dung dịch đệm photphat pH 5 2: dung dịch đệm photphat pH 6 3: dung dịch đệm photphat pH 7 4: dung dịch đệm photphat pH 8 5: dung dich đệm amoni pH 9 6: dung dịch đệm amoni pH 10 Hình 3.12. Hiệu suất thu hồi của chất phân tích ở các pH khác nhau của đệm Nhìn vào kết quả trên ta thấy ở pH = 9, độ thu hồi của các chất là thấp nhất và ở pH = 6, độ thu hồi của các chất là lớn nhất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn pH đệm tối ưu là 6. 3.3.3. Khảo sát thành phần dung dịch rửa tạp Nền mẫu nước tiểu thường khá phức tạp, chứa rất nhiều chất khác nhau như ezym, vitamin, axit amin, các hợp chất hữu cơ và các ion như: Na+, NH4+, Mg2+,Cl-, SO42-, để giảm ảnh hưởng của các chất này đến kết quả phân tích điện di thì cần lựa chọn dung môi rửa tạp phù hợp, làm giảm các ion ảnh hưởng và hạn chế rửa giải chất phân tích ra khỏi cột trong giai đoạn này. Do vậy, chúng tôi khảo sát bốn hệ dung dịch rửa tạp khác nhau bao gồm: Dung dịch 1: 1,0 mL H20 à 1,0 mL n-hexan à2,0 mL MeOH/H20 (1/9 v/v) Dung dịch 2: 2,0 mL MeOH/H20 (1/9 v/v) Dung dịch 3: 1,0 mL axit axeticà2,0 mL MeOH/H20 (1/9 v/v) Dung dịch 4: 1,0 mL H20 à 1,0 mL H3PO4 (10mM) à2,0mL MeOH/H20 (1/9 v/v) 3.3.4. Ảnh hưởng của thể tích dung dịch axit H3PO4 dùng để rửa tạp đến hiệu suất thu hồi của chất phân tích Để khảo sát khả năng rửa tạp chất của dung dịch H3PO4, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mức thể tích H3PO4 là 1,0 mL; 2,0 mL; 3,0 mL. Kết quả được thể hiện trong hình 3.14 và bảng 3.19: Hình 3.14. Điện di đồ xác định 4 chất ma túy trong nhóm ATS với thể tích H3PO4 rửa tạp khác nhau 3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi rửa giải Chúng tôi tiến hành khảo sát các các loại dung môi rửa giải sau: Dung môi A: 2,0 mL hỗn hợp clorofom/2 - propanol/NH4OH 25% (80/20/2 v/v/v) Dung môi B: 2,0 mL hỗn hợp CH2Cl2/2 - propanol/NH4OH 25% (80/20/2 v/v/v) Dung môi C: 2,0 mL Methanol Dung môi D: 2,0 mL hỗn hợp etyl axetat/MeOH/NH4OH 25% (78/20/2 v/v/v) Kết quả thu được được thể hiện trong hình 3.15 và bảng 3.20: Hình 3.15. Điện di đồ xác định 4 chất ma túy trong nhóm ATS với các dung môi rửa giải khác nhau 3.3.6. Ảnh hưởng của thể tích rửa giải đến độ thu hồi của các chất phân tích Thể tích dung môi rửa giải càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo rửa giải hết chất phân tích ra khỏi vật liệu hấp phụ. Chúng tôi tiến hành khảo sát ở 3 mức thể tích Methanol rửa giải: 1,0 ml; 2,0 m; 3,0 ml. Từ kết quả trên ta thấy với thể tích MeOH là 1,0 mL, hiệu suất thu hồi các chất phân tích là thấp nhất. Độ thu hồi các chất khi sử dụng 2,0 mL và 3,0 mL có sự chênh lệch không nhiều và hiệu suất thu hồi đều nằm trong khoảng 95,5 ÷ 106,4 %. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thể tích rửa giải tối ưu là 2,0 mL MeOH. Với quy trình chiết pha rắn này, mẫu được làm sạch đồng thời và được làm giàu lên 50 lần. Do vậy, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng trong mẫu nước tiểu đạt được với các chất như sau: LOD và LOQ của MA lần lượt là 10 ppb; 34 ppb; LOD và LOQ của các chất MDA, MDMA, MDEA là 50 ppb và 166 ppb. 3.4. Phân tích mẫu thực tế Chúng tôi áp dụng cả hai quy trình xử lý mẫ