Luận văn Nghiên cứu sản xuất Cellulase từ Aspergillus Oryzea

ệp và Sinh học Ứng dụng 27 + Chuẩn bị mỗi mẫu 100 g, hấp thanh trùng và chuẩn pH, ẩm độ (pH từ 4,5-5,5; ẩm độ từ 60-65%). Tiến hành thí nghiệm theo qui trình. Nguyên liệu được xử lý, hấp thanh trùng sau đó nuôi cấy theo thời gian B với thành phần môi trường A. Sau đó thu enzyme và khảo sát hoạt tính (sử dụng cơ chất là hợp chất CMC). + Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme cellulase thu được + Kết quả tối ưu được chọn làm cơ sở cho thí nghiệm sau. Giai đoạn thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự tạo thành cellulase - Mục đích: Xác định điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển và tạo thành cellulase - Nguyên liệu: kết quả tối ưu của thí nghiệm 1. - Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm gồm có các nhân tố + Nhân tố C: pH của môi trường • C1: 4,5 • C2: 5,0 • C3: 5,5 + Nhân tố D: nhiệt độ nuôi • D1: 25oC • D2: 30oC • D3: 35oC + Nhân tố E: độ ẩm môi trường • E1: 55% • E2: 60% • E3: 65% * Tổng số nghiệm thức: 27 * Số lần lặp lại: 2 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 28 Thí nghiệm được tiến hành theo qui trình. Nguyên liệu được xử lý, hấp thanh trùng và sau đó trộn giống vi sinh vật rồi nuôi ở nhiệt độ D, độ ẩm môi trường E, pH môi trường F. Thu enzyme và khảo sát hoạt độ. + Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính cellulase thu được. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau Hinh13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 3.4.3 Phân tích thống kê Số liệu sau khi thu thập được tính toán và phân tích thống kê theo phương pháp ANOVA, sử dụng phần mềm thống kê StatGraphics Plus 4.0 Kết quả thống kê sẽ được thể hiện ở phần phụ lục. C2 C1 C3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 29 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN Quá trình tạo enzyme của nấm mốc phụ thuộc và nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm: thời gian, thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH, độ ẩm, Nấm mốc được cấy vào môi trường nuôi đã được thanh trùng, sau thời gian nuôi cấy, thu môi trường và thử hoạt tính cellulase tạo thành. Kết quả khảo sát các yếu tố thể hiện như sau: 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường khác nhau, thu nhận môi trường sau nuôi cấy ở các khoảng thời gian khác nhau và đo hoạt tính enzyme thu được. Với: A1 là mẫu 75% cám + 15% trấu + 9% mùn cưa + 1% bột gạo A2 là mẫu 75% cám + 20% trấu + 5% mùn cưa + 1% bột gạo B1 là mẫu 30 giờ B2 là mẫu 40 giờ B3 là mẫu 45 giờ B4 là mẫu 50 giờ Hoạt tính cellulase riêng Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính riêng của cellulase được thể hiện ở bảng và hình sau: Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 30 Bảng 3. Hoạt tính riêng của cellulase Môi trường Thời gian nuôi (giờ) Môi trường- thời gian Hoạt tính cellulase riêng (đv/g) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 16,5 15,9 30 A1B1 16,5 16,3f 44,23 38,16 40 A1B2 41,55 41,31a 32,4 30,4 45 A1B3 31,75 31,52bc 27,53 25,88 A1 (75% cám+ 15% trấu+9% mùn cưa+1% bột gạo 50 A1B4 26,25 26,55d 28,92cd 14,7 15,3 30 A2B1 15 15,0f 36,44 30,44 40 A2B2 34,1 33,66b 25,68 26,92 45 A2B3 28,5 27,03d 24,28 22,84 A2 ((75% cám+ 20% trấu+4% mùn cưa+1% bột gạo 50 A2B4 23,75 23,62e 24,83de Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 31 SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH CELLULASE VÀO MÔI TRƯỜNG VÀ THỜI GIAN 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 THỜI GIAN NUÔI CẤY H O Ạ T TÍ N H TR U N G BÌ N H A1 A2 Hình 14. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase riêng Ở Bảng 3, ta thấy ở hai kiểu môi trường nuôi cấy A1và A2, thu được enzyme có hoạt tính cellulase riêng trung bình khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%. Ở Hình 14, ta thấy trên kiểu môi trường nuôi cấy A1 và A2 hoạt tính enzyme tăng dần khi thời gian nuôi cấy tăng từ 30 đến 40 giờ và sau đó giảm dần khi nuôi đến 50 giờ. Tuy nhiên, hoạt tính cellulase riêng trung bình thu được ở 40 giờ là cao nhất. Như vậy, 40 giờ là thời điểm nấm mốc sinh enzyme cho hoạt tính mạnh nhất Hoạt tính cellulase riêng cao nhất thu được trên kiểu môi trường A1 (75% cám, 15% trấu và 9% mùn cưa, 1% bột gạo) với thời gian nuôi cấy 40 giờ (41,31 đv/g). . Hoạt tính cellulase tổng Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính tổng của cellulase được thể hiện ở bảng và hình sau: 30 40 45 50 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 32 Bảng 4. Hoạt tính tổng của cellulase . Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) - Ý nghĩa của việc xác định hoạt tính tổng: Giúp đánh giá kết quả tổng quát hơn vì khối lượng môi trường cũng phụ thuộc vào thời gian, pH, nhiệt độ, độ ẩm và thành phần môi trường cũng như thời gian nuôi. Cách xác định hoạt tính tổng: hoạt tính tổng bằng hoạt tính riêng nhân với khối lượng môi trường sau nuôi cấy (Theo Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Môi trường Thời gian nuôi (giờ) Khối lượng môi trường sau nuôi cấy (g) Hoạt tính cellulase riêng (đv/g) Hoạt tính cellulase tổng (đv) Hoạt tính cellulase tổng trung bình (đv) 75,8 16,5 1250,70 76,4 15,9 1214,76 30 76,4 16,5 1260,60 1242,02f 76 44,23 3361,48 76,3 38,16 2911,61 40 77,2 41,55 3207,66 3160,25a 75 32,4 2430,00 78,1 30,4 2374,24 45 77,3 31,75 2454,28 2419,51b 78,2 27,53 2152,85 76,9 25,88 1990,17 A1 (75% cám+ 15% trấu+9% mùn cưa+1% bột gạo) 50 78,5 26,25 2060,63 1381,01c 2050,70de 76,6 14,7 1126,02 75,7 15,3 1158,21 30 79 15 1185,00 1156,41f 78,1 36,44 2845,96 77,3 30,44 2353,01 40 77,8 34,1 2652,98 2617,32b 77,6 25,68 1992,77 78 26,92 2099,76 45 78,3 28,5 2231,55 2108,03c 76,5 24,28 1857,42 75,7 22,84 1728,99 A2 (75% cám+ 20% trấu+4% mùn cưa+1% bột gạo) 50 77,8 23,75 1847,75 1811,39e 1923,29de Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 33 SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH TỔNG VÀO MÔI TRƯỜNG VÀ THỜI GIAN 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 1 2 3 4 THỜI GIAN NUÔI CẤY H OẠ T TÍN H TỔ NG A1 A2 Hình 15. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase tổng Ta có hoạt tính cellulase tổng là tích của hoạt tính cellulasse riêng nhân với khối lượng môi trường thu được sau nuôi cấy được tính toán và thể hiện ở Bảng 4 và Hình 15. Ở Bảng 4, ta thấy cũng tương tự như hoạt tính cellulase riêng hoạt tính cellulase tổng trên hai kiểu môi trường A1 và A2 thu được có trung bình khác biệt, có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. . Ở Hình 15, ta thấy hoạt tính enzyme tăng nhanh theo thời gian đầu từ 30 đến 40 giờ nuôi cấy và đạt giá trị cực đại ở 40 giờ nuôi trên môi trường A1 và A2, sau đó giảm dần đến 50 giờ. Kết quả thống kê thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4 cho thấy hoạt tính cellulase tổng thu được trên môi trường A1 khi nuôi trong 40 giờ có nghiệm thức thí nghiệm lớn nhất (3160,25 đv) tương ứng với hoạt tính enzyme thu được là cao nhất. 30 40 45 50 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 34 Tóm lại, môi trường A1 là môi trường tốt nhất để thu được cellulase có hoạt tính cao nhất và thời gian nuôi 40 giờ cho hoạt tính cao nhất. 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành enzyme cellulase Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường khác nhau về độ ẩm, pH và nhiệt độ khi nuôi cấy. Sau đó tiến hành đo hoạt tính enzyme thu được. Hoạt tính cellulase riêng Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính riêng của cellulase Bảng 5. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử XXX Ở nhiệt độ nuôi cấy 30oC (pH 5,0 và độ ẩm 55%), hoạt tính cellulase thu được là cao nhất. Trong khi ở nhiệt độ nuôi cấy 25oC, hoạt tính cellulase thu được là thấp nhất, sự khác biệt này là có ý nghĩa 5%. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính riêng của pectinmethylesterase Bảng 6. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy pH Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 4,5 27,17c 5,0 32,84a 5,5 30,49b Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử XXX Ở pH môi trường 4,5, 5,0 và 5,5 cellulase riêng thu được có hoạt tính khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. Ở pH 5,0 (nhiệt độ 300C và độ ẩm 55%) cho hoạt tính riêng của cellulase cao nhất. Nhiệt độ (0C) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 25 26,84c 30 33,4a 35 30,25b Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 35 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến hoạt tính riêng của cellulase Bảng 7. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy Độ ẩm (%) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 50 28,79b 55 32,7a 60 29,01b Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử XXX Ở độ ẩm môi trường là 55% (pH 5,0 và nhiệt độ 300C), hoạt tính cellulase riêng thu được là cao nhất và khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Như vậy, độ ẩm 55% là độ ẩm tối ưu cho nấm mốc phát triển để tạo enzyme. Bảng 8. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo nhiệt độ_pH_độ ẩm môi trường Nhiệt độ pH Độ ẩm (%) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 50 25,75klm 55 27,4 hijklm 4,5 60 24,1m 50 26,9 ijklm 55 29,5fghijk 5,0 60 27,3ijklm 50 28,6fghijkl 55 26,8jklm 25 5,5 60 28,3fghijk 50 27,1 ijklm 55 30,5efghij 4,5 60 24,8lm 50 35,1bcd 55 44,7a 5,0 60 36,8bc 50 28,3fghijkl 55 37,8b 30 5,5 60 35,5bc 50 28,5fghijkl 55 29,1ghijk 35 4,5 60 27,2 ijklm Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 36 50 30\,7efghi 55 33,4cde 5,0 60 31,2efgh 50 31,5defg 55 33,3cdef 5,5 60 27,4hijklm Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH RIÊNG VÀO ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PH _ ĐỘ ẨM H O Ạ T TÍ N H R IÊ N G TR U N G BÌ N H 25oC 30oC 35oC Hình 16. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase riêng Kết quả ở bảng 8 ta thấy mẫu ở 300C, pH bằng 5,0 và độ ẩm 55% cho hoạt tính có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% so với các mẫu khác. Ở đồ thị Hình 16 ta thấy hoạt tính riêng của enzyme ở độ ẩm 55%, nhiệt độ 30oC và pH 5,0 cho hoạt tính riêng cao nhất vượt trội hơn so với các cột khác. Còn ở độ ẩm 60%, nhiệt độ 25oC và pH 4,5 cho hoạt tính riêng thấp nhất. Như vậy với nhiệt độ 300C, độ ẩm 55% và pH 5,0 cho hoạt tính riêng của cellulase cao nhất. 50% 55% 60% 50% 55% 60% 50% 55% 60% 4,5 5,0 5,5 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 37 Hoạt tính cellulase tổng Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính tổng của cellulase Bảng 9. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy Nhiệt độ (0C) Khối lượng môi trường sau nuôi cấy (g) Hoạt tính cellulase tổng trung bình (đv) 25 78,83 2115,87c 30 80,01 2672,21a 35 78,30 2360,6b Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Từ Bảng 9, cho thấy 30oC (ở pH 5,0 và độ ẩm 55%) vẫn là nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, vì khi nuôi cấy nấm mốc ở nhiệt độ này thu được enzyme có hoạt tính cellulase tổng trung bình cao nhất và khác biệt ở mức ý nghĩa 5% so với hoạt tính cellulase tổng trung bình thu được của 2 môi trường kia. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính tổng của cellulase Bảng 10. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy pH Khối lượng môi trường sau nuôi cấy (g) Hoạt tính cellulase tổng trung bình (đv) 4,5 77,88 2116,04c 5,0 78,74 2585,73a 5,5 80,52 2454,92b Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Từ Bảng 10, cho thấy ở môi trường nuôi cấy có pH bằng 5,0 (ở nhiệt độ 300C và độ ẩm 55%) thu được cellulase tổng hoạt tính cao nhất khác biệt có ý nghĩa so với hoạt tính cellulase tổng thu được trên 2 môi trường nuôi cấy kia. Trong khi đó, hoạt tính cellulase tổng thu được thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trường có pH bằng 4,5. Ảnh hưởng của độ ẩm nuôi cấy đến hoạt tính tổng của cellulase Bảng 11. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy Độ ẩm Khối lượng môi trường sau nuôi cấy (g) Hoạt tính cellulase tổng trung bình (đv) 50 78,62 2263,38bc 55 79,47 2598,72a 60 78,54 2278,54b Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 38 Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Từ Bảng 11, cho thấy hoạt tính cellulase tổng thu được đạt cao nhất ứng với độ ẩm 55% (pH 5,0 và nhiệt độ 300C) khác biệt ở mức ý nghĩa 5% so với hoạt tính thu được ở 2 môi trường nuôi cấy kia ở độ ẩm 50% và 60%. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 39 Bảng 12. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo nhiệt độ_độ ẩm_pH môi trường Nhiệt độ (0C) pH Độ ẩm (%) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) Khối lượng môi trường sau nuôi cấy trung bình (g) Hoạt tính tổng trung bình (đv) 50 25,8 77,2 1991,76ijkl 55 27,4 80,2 2197,48ghijk 4,5 60 24,1 82,1 1978,61jkl 50 26,9 76,1 2047,09hijkl 55 29,5 78,7 2321,65efghij 5,0 60 27,3 80,6 2200,38fghijk 50 28,6 75,2 2150,72ghijk 55 26,8 76,6 2052,88hijkl 25 5,5 60 28,3 75,1 2125,33ghijkl 50 27,1 78,4 2124,64ghijkl 55 30,5 77,3 2357,65defghi 4,5 60 24,8 76,2 1889,76l 50 35,1 81,1 2846,61bc 55 44,7 80,1 3580,47a 5,0 60 36,8 78,9 2903,52bc 50 28,3 77,3 2187,59ghijk 55 37,8 79,5 3005,1b 30 5,5 60 35,5 78,3 2779,65bc 50 28,5 80,9 2305,65efghij 55 29,1 79,5 2313,45efghij 4,5 60 27,2 78,1 2124,32ghịkl 50 30,7 83,2 2554,24defg 55 33,4 81,6 2725,44cd 5,0 60 31,2 79,4 2477,28defgh 50 31,5 82,4 2595,6cdef 55 33,3 80,7 2687.31cde 35 5,5 60 27,4 78,4 2148,16ghijk Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 40 SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH TỔNG VÀO MÔI TRƯỜNG 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PH _ ĐỘ ẨM H O Ạ T TÍN H TỔ N G 25oC 30oC 35oC Hình 17. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase tổng Kết quả ở Bảng 12 và Hình 17 cho thấy môi trường nuôi cấy với độ ẩm bằng 55%, độ và pH bằng 5,0 cho hoạt tính cellulase tổng cao nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, trong khi môi trường ứng với độ ẩm bằng 50% và pH bằng 4,5 được nuôi cấy ở nhiệt độ 35oC cho hoạt tính cellulase tổng thấp nhất. Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tổng hợp enzyme của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp để nấm mốc phát triển tạo ra enzyme cao nhất là ở 30oC. Cùng với nhiệt độ thì độ ẩm môi trường nuôi cấy cũng có ý nghĩa quan trọng nhất định ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc cũng như khả năng sinh enzyme. Khi độ ẩm môi trường cao (60%) sẽ làm giảm mức độ thoáng khí và khi đó cũng tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn, nấm mốc khác phát triển. Còn ngược lại nếu độ ẩm thấp (50%) làm môi trường nuôi cấy khô sự sinh bào tử của nấm mốc cũng sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Như vậy, độ ẩm 55% là độ ẩm tối ưu. Tóm lại, từ kết quả thu được thí nghiệm 2, ta thấy điều kiện môi trường để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất là độ ẩm 55%, nhiệt độ 30 oC và pH = 5,0. Ta chọn các điều kiện như trên là điều kiện tối ưu cho thí nghiệm. 50% 55% 60% 50% 55% 60% 50% 55% 60% 4,5 4,5 4,5 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 41 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chế phẩm enzyme cellulase thu được là chế phẩm ở dạng thô. Trong quá trình nuôi cấy nếu không đảm bảo các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc sẽ làm giảm khả năng tổng hợp hoạt tính enzyme cellulase, hay kéo dài thời gian nuôi cấy cũng làm giảm năng suất sản xuất. Qua thời gian khảo sát, kết quả cho thấy để nuôi cấy Aspergillus oryzae sản xuất enzyme cellulase đạt hoạt tính tổng cao nhất thì điều kiện môi trường bao gồm: - Thành phần môi trường gồm 75% cám, 15% trấu, 9% mùn cưa, 1% bột gạo sau khi thanh trùng tiến hành cấy giống Asp. oryzae vào và nuôi trong thời gian 40 giờ thì enzyme thu được có hoạt tính cao nhất. - Điều kiện độ ẩm là 55%, pH = 5,0, nhiệt độ nuôi cấy 30oC Quy trình sản xuất đề nghị Môi trường (75% cám, 15% trấu, 9% mùn cưa, 1% bột gạo) Thanh trùng (121oC, 15 phút) Cấy giống mốc Ủ (nhiệt độ 30oC, 40 giờ) Thu môi trường Sấy lạnh Nghiền Bảo quản Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 42 5.2 Đề nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chế phẩm enzyme thu được là chế phẩm thô chưa có điều kiện thử nghiệm vào thực tế và cũng chưa thể khảo sát đầy đủ: - Nghiên cứu để bảo quản chế phẩm enzyme cellulase : sấy lạnh, - Nghiên cứu sản xuất cellulase từ vi khuẩn hay loại nấm mốc khác - Nghiên cứu sự tổng hợp cellulase trên các nguyên liệu khác: cám ngô,cám mì, bả củ cải, - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme, đến khả năng hoạt động xúc tác của cellulase. . Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng và ctv (2004), Công Nghệ Enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2002), Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Trần Minh Tâm (2000), Công Nghệ Vi Sinh Ứng Dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2005), Hóa Sinh Công Nghiệp, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. Lê Xuân Phương (2001), Vi Sinh Vật Công Nghiệp, NXB Xây Dựng Hà Nội. Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ Sở Vi Sinh Vật Học, NXB Giáo Dục. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải (2005), Động Học Các Quá Trình Xúc Tác Sinh Học, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. Rukhliadeva, AP and Goriache, M, G (1968), Method ò determination ò the activity ò cellulotic enzyme, Bùi Hữu Thuận, Dương Thị Phương Liên, Bùi Thị Quỳnh Hoa (2004), Bài giảng sinh hóa thực phẩm. Chiêm Thị Bích Vân ( 2007), Nghiên cứu sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae, luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Đặng Thị Thu và ctv, Công nghệ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. Hà Thanh Toàn (2002), Bài giảng kỹ thuật các quá trình sinh học. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh Jans.Tkacz (2004), Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Agriculture and Medicine, NewYork, pp 237-283. Ly Nguyen B. (2004), The combined pressure temperature stability of plant pectin methylesterase and their inhabitor, Docteraasproefschrift Nr. 630 aan de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen van de KU. Leuven. 0tcpgpmo.alexandra. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi PHỤ LỤC Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase (Theo Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) + Hoạt tính cellulase được kiểm tra căn cứ vào lượng đường khử sinh ra khi cho enzyme thu được thủy phân CMC. Một đơn vị hoạt tính cellulase được hiểu là lượng đường glucose sinh ra khi cho 1 ml enzyme chế phẩm tác dụng với 3ml dung dịch CMC 1% trong 1 giờ. + Cách kiểm tra: - Pha dung dịch CMC 1%: Cân 10 g CMC cho vào 800 ml nước nóng 80-90 0C, khuấy đều cho thêm vào 50 ml đệm citrate pH 5,0 rồi cho nước cất vào đủ đến 1000 ml. Bảo quản dung dịch này ở 5 0C. - Chiết rút enzyme: Cân 20 g môi trường nghiền nhỏ cho vào 100 ml đệm citrate pH 4,8 khuấy để khoảng 1 giờ rồi chiết rút lấy phần nước trong, có thể cho muối và natri benzoate vào để bảo quản ở 4 0C. - Để kiểm tra hoạt tính enzyme, ta cho 1ml enzyme tác dụng với 3ml dung dịch CMC 1% trong 1 giờ ở nhiệt độ 40 0C rồi đem chuẩn độ đường khử sinh ra sẽ biết được hoạt tính của enzyme. + Cách xác định lượng đường khử: - Chuẩn bị dung dịch thuốc thử: dung dịch Fehling A (hòa 6,928 g CuSO4.5H2O vào trong 100 ml nước cất), dung dịch Fehling B (hòa 34,6 g Na, K tatrate và 10g NaOH vào trong 100 ml nước cất) - Tiến hành chuẩn độ: Cho 5ml dung dịch Fehling A vào trước, sau đó cho 5ml dung dịch Fehling B lắc đều rồi cho 15 ml dung dịch để kiểm tra hoạt tính đã chuẩn bị sẵn ở trên vào, đun sôi 2-5 phút, tiếp tục cho từng 1ml dung dịch cần chuẩn vào đến khi mất hoàn toàn màu xanh của Fehling và xuất hiện kết tủa đỏ gạch, thì cho 2-3 giọt xanh methylene rồi tiếp tục đun cho mất hoàn toàn màu xanh (nếu chưa mất màu xanh thì cho thêm dd chuẩn) - Đọc kết quả là số ml dung dịch chuẩn đã dùng hết, tra bảng ta tìm được hàm lượng đường glucose tính theo mg từ đó tính được hoạt tính của enzyme. Bảng chuẩn so sánh Dung dịch đường chuẩn (ml) Dung dịch đường nghịch đảo (mg) Dung dịch đường chuẩn (ml) Dung dịch đường nghịch đảo (mg) 15 336 33 156 16 316 34 152,2 17 298 35 147,1 18 282 36 143,9 19 276 37 140,2 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii 20 254,5 38 136,6 21 242,9 39 133,3 22 231,8 40 130,1 23 222,2 41 127,1 24 213,3 42 124,2 25 204,8 43 121,4 26 197,4 44 118,7 27 190,4 45 116,1 28 183,7 46 113,7 29 177,6 47 111,4 30 171,7 48 109,2 31 166,3 49 107,1 32 161,2 50 105,1 Kết quả thống kê thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase Hoạt tính cellulase riêng ANOVA Table for hoạt tính cellulase riêng theo thành phần môi trường _ thời gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1618.62 7 231.231 80.90 0.0000 Within groups 45.7321 16 2.85826 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1664.35 23 Căn cứ vào bảng trên ta thấy có sự khác biệt giữa các mẫu với mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for hoạt tính cellulase riêng theo thành phần môi trường _ thời gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A2B1 3 15.0 X A1B1 3 16.3 X A2B4 3 23.6233 X A1B4 3 26.6533 X A2B3 3 27.0333 X A1B3 3 31.5167 X A2B2 3 33.66 X A1B2 3 41.3133 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1B1 - A1B2 *-25.0133 2.92632 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng viii A1B1 - A1B3 *-15.2167 2.92632 A1B1 - A1B4 *-10.3533 2.92632 A1B1 - A2B1 1.3 2