Luận văn Nghiên cứu sản xuất Pectinmethylesterase từ Aspergillus oryzae

là 5 % bột cà rốt hoặc vỏ bưởi và bổ sung amon sulfat và amon clorua 1%, amon phosphat 2%. Độ ẩm môi trường là 60-65% . Đem môi trường thanh trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội và bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus oryzae vào môi trường đã được trộn đều, trãi mỏng trên khay. Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ úm ổn định ở nhiệt độ khoảng 37oC. Trong khoảng 36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm enzyme thô ở giai đoạn này (Nguyễn Đức Lượng, 2003).  Trích ly enzyme Chiết tách enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính, có thể chiết tách được 90- 95% và trong nước chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25-28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường, đẩy một lượng nước lớn. Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn-nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3-5oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60-70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5-5,6 bằng (NH4)2SO4 (600g/lít). Khi kết tủa bằng ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu dùng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21  Ly tâm Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước, protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, thường tiến hành ly tâm lạnh (3- 5oC) (Nguyễn Đức Lượng, 2001).  Sấy kết tủa Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%.  Nghiền và bảo quản Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hoặc túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh. Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tinh chế. 2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính của PME • Độ ẩm Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng tạo enzyme. • Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme. • Thời gian nuôi Thời gian nuôi để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22 • pH Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt thường ít ảnh hưởng do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. Đa số nấm sẽ phát triển tốt và tạo ra enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm ẩm môi trường. 2.5 Một số ứng dụng của pectinmethylesterase 2.5.1 Trong sản xuất nước quả và rượu vang Bảng 4. Một số ví dụ về ứng dụng của enzyme trong ngành sản xuất thực phẩm (Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007) Ngành sản xuất thực phẩm Enzyme sử dụng Ghi chú Chế biến quả, SX dịch quả Các enzyme phân giải thành tế bào: pectin lyase, pectin methylesterase, polygalacturonase, arabanase, các hemicellulase, các amylase acid của nấm mốc và glucoamylase Các enzyme này đều tách từ Aspergillus. Sử dụng các pectinase làm tăng chất lượng, năng suất, tạo được nhiều loại sản phẩm mới từ quả, kéo dài thời gian bảo quản, giữ màu bền. Bánh nướng α-amylase, xylanase, protease, lipase, và một số oxidoreductase, transglutaminase Các enzyme nhằm đảm bảo chất lượng bột nhão dùng làm bánh, cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm. Làm phomat Enzyme làm đông sữa, chủ yếu là các asparticprotease như: chymosin, mucorpepsin, endo thiapepsin, Ngoài ra còn dùng lipase, lysozyme Lipase, lysozyme cũng có vai trò làm chín phomat, tăng hương vị, chất lượng phomat. Chế biến sữa β-galactosidase thuỷ phân lactose trong sữa thành glucose và galactose. Hai đường này có độ ngọt lớn hơn lactose. - Sản xuất sữa không có lactose cho những người thiếu lactase bẩm sinh. - Làm tăng độ ngọt của các loại nước uống từ sữa, sữa chua. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23 Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào được phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong. a. Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần nước quả thu được sẽ kéo theo lượng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào, giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra. Khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30% vì PME sẽ thuỷ phân pectin tách động lên vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase (PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Pectin cũng chính là một trong những nguyên nhân làm cho dịch quả có tính nhớt. Độ nhớt dịch quả cao là trở ngại lớn cho quá trình lọc hay ly tâm. Vì vậy việc sử dụng enzyme để cắt pectin thành những phần tử nhỏ hơn sẽ góp phần đáng kể làm giảm độ nhớt của dịch quả. Dịch quả thu được khi xử lý bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế rất rõ. Liều lượng enzyme được sử dụng được tạo lập tuỳ theo loại quả và điều kiện công nghệ (nhiệt độ, thời gian tác dụng, loại hình ép). Thường chúng được dùng với liều lượng 100-150 g/tấn thịt quả. Hoặc dùng liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03-0,05%, chế phẩm thô là 0,5-2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân là 43-45oC. Thời gian thủy phân là 4-8 giờ. Trong sản xuất nước quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đường , trong thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thường không có hiệu suất cao. Chính vì thế người ta phải xử lí nước nho bằng chế phẩm enzyme. Lượng enzyme sử dụng trong trường hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lượng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, người ta cũng xử lí Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24 enzyme với liều lượng 0,2% so với khối lượng nho. Thời gian xử lí bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 45oC. Bằng phương pháp xử lí này người ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66 lên 82,2% đối với nho đỏ (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Còn trong sản xuất nước táo và nước quả vả, sử dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất tách dịch quả lên 20-25%. Hoạt động chính của enzyme endo-polygalacturonase, pectimetylesterase và pectin lyase giúp quá trình ép là thủy phân các khung xương chính của pectin, phá vỡ thành tế bào làm các tế bào khó liên kết lại với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Khi xử lý nước quả bằng enzyme đối với nước táo, người ta thường cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá. Trong sản xuất nước táo, khi sử dụng chế phẩm pectinase đã mang lại hiệu quả cao. Bảng 5. Hiệu quả xử lý nước táo và nước quả vả bằng chế phẩm enzyme pectinase ( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Stt Loại nước quả Hiệu suất nước quả (%) Hàm lượng chất khô (%) Độ acid chẩn (%) Pectin (%) Chất chát (%) Đường (%) Điểm đánh giá cảm quan 1 Nước quả từ táo a-Không chế phẩm enzyme b-Có chế phẩm enzyme 71,2 78,8 10,2 11,5 0,53 0,62 0,33 0,15 0,04 0,02 6,7 8,0 4,5 4,8 2 Nước quả vả a-Không chế phẩm enzyme b-Có chế phẩm enzyme 49,2 72,4 8,5 10,2 0,91 1,16 0,26 0,12 0,09 0,16 5,62 7,4 3,8 4,3 Bên cạnh việc sử dụng enzyme để thuỷ phân pectin làm tăng hiệu suất thu hồi khi ép lấy dịch quả thì sự thuỷ phân một phần tế bào bởi enzyme cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lượng cảm quan của dịch quả. Hoạt động thủy phân pectin bởi enzyme đã được ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt nước trái cây vì thế làm tăng nồng độ các thành phần chất chiết đến các giá trị Brix cao hơn như bình thường có thể. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 Khi sử dụng PME cần lưu ý là hoạt động của PME cũng sẽ bị ức chế bởi nồng độ cao của đường. Khi nước ép cô đặc đến 60oBx enzyme sẽ không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nước). Sơ đồ công nghệ thu nhận dịch quả có ứng dụng enzyme Quả Rửa Nghiền nát Thu khối nghiền Gia nhiệt Ép Thu dịch ép dạng sệt - Làm sáng Làm nóng nhanh - Ổn định sạch - Lọc Ly tâm Siêu âm Nước quả trong Nước quả trong Nước quả Xử lý enzyme Xử lý enzyme Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 26 Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ VSV. Trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). b. Làm trong Quá trình ép có được sử dụng hay không chế phẩm enzyme, thì dịch quả thu được đầu là dịch quả thô, với độ nhớt và độ đục của nó rất cao do có chứa một lượng lớn pectin gây hiện tượng độ nhớt cao và đục nước. Làm trong là loại bỏ các phần tử gây đục. Loại bỏ các chất pectin có thể thực hiện bằng cách kết tủa hay thủy phân, sản phẩm tạo thành mất đi tính keo làm dễ dàng hơn quá trình lắng các hạt tử gây vẻ đục. Các hạt tử bấy giờ dễ tách ra bằng ly tâm, lọc hay lắng. Trường hợp kết tủa, enzyme pectimetylesterase được sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion calci kéo theo sự tạo thành các gel Calcium pectate, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trong dịch quả, hay ngược lại chúng nổi trên bề mặt khi lên men do tác dụng của CO2, đây là trường hợp sản xuất nước quả lên men độ rượu. Trường hợp thủy phân, làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzyme PME và PG. PME sẽ phân cắt nhóm metyl của pectin tạo điều kiện cho PG phân cắt pectin thành những đoạn ngắn hơn, những phân tử nhỏ hơn và rời rạc tạo điều kiện để cặn lắng thu được nước quả trong. Ngoài ra, do các phần tử đục được tạo nên từ protein liên kết với các pectin thường có mạch bên giàu arabinan và galactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dương và bao quanh nó là các pectin tích điện âm. Phân huỷ pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dương và pectin tích điện âm. Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhau và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với enzyme, lớp vỏ pectin sẽ bị phân cắt làm các protein lộ ra làm các hạt sẽ hút nhau bằng lực hút tĩnh điện. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng với nhau và dịch quả được làm trong. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 27 Hình 12. Tác dụng của PME trong quá trình làm trong nước quả Sử dụng enzyme pectinase để làm trong được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất rượu vang nho, rượu lên mên từ dịch trái cây như: táo, chuối, Ngoài ra, pectinase còn có thể được dùng làm chất tạo đông khi sản xuất mứt quả cô đặc, mứt đông. c. Cải thiện cấu trúc PME cũng được khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca++, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn tạo được cấu trúc mong muốn. Hình 13. Cấu trúc của pectate calcium 2.5.2 Trích ly dược liệu Các dược liệu có nguồn gốc thực vật, trong thành phần chúng ngoài các hoạt chất thì luôn luôn có pectin. Enzyme pectinase được sử dụng để phân giải các mô thực vật giúp các hoạt chất được giải phóng ra dễ dàng và triệt để hơn. Tuy nhiên, vì sử dụng zz Nước táo Nước quả có múi Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 28 cho mục đích sản xuất thuốc chữa bệnh nên khi dùng chế phẩm enzyme phải có độ tinh khiết rất cao để không mang theo những hoạt chất lạ vào thuốc, phải có hoạt độ cao để chỉ dùng với một lượng tối thiểu. 2.5.3 Trong chăn nuôi Trong lĩnh vực chăn nuôi, người ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn. Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bị đề ester hoá bởi PME được khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc. Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đưa pH về giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca++ cao, làm kích hoạt PME, quá trình đề ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra. Chất lỏng được tiết ra và được ép, để chỉ có một phần nước còn lại cần được loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nước ép có thành phần tương tự như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được làm thức ăn cho gia súc (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Lượng chế phẩm pectinase thường dùng là 0,03 – 0,05% so với nguyên liệu. 2.5.4 Những bất lợi khi sử dụng chế phẩm enzyme Nước quả được sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng có nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi. Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu xử lý enzyme trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV. Người ta ngăn ngừa sự oxy hoá trong nước quả bằng cách sử dụng: acid ascorbic, anhydric sulfur, ennzyme glucose oxidase. - Sử dụng acid ascorbic: ức chế sự phát triển của nấm men, nấm sợi, không làm thay đổi vị và mùi của sản phẩm. Acid này hoạt động ở khoảng pH rộng từ 3,9-9,2, liều lượng sử dụng 0,03%. - Sử dụng anhydric sulfur: vừa tiêu diệt VSV vừa có khả năng chống oxy hoá. Tuy nhiên, khi sử dụng anhydric sulfur quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế hoạt động enzyme. Hàm lượng anhydric sulfur 0,1% sẽ làm giảm hoạt tính chế phẩm enzyme (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Cũng có thể áp dụng chế độ xử lý nhiệt, người ta sẽ đun nóng dịch quả để bảo quản nước quả. Tuy nhiên việc đun nóng dịch quả không thể quá cao vì chính nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan, thành phần hoá học và hoạt tính enzyme. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 29 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm, thời gian Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. Thời gian: từ 04/01/2008 đến 12/04/2008 3.1.2 Vật liệu Bao gồm cám, trấu, pectin (vỏ bưởi). 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu Nấm sợi Aspergillus oryzae lấy từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ. 3.1.4 Thiết bị, hoá chất - Thiết bị thanh trùng - Máy đo độ ẩm - Máy đo pH - Thiết bị chuẩn độ acid-bazơ tự động 785-Titrino - Khay - Dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật - Tủ ủ - Máy khuấy từ - Một số dụng cụ và thiết bị khác. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 30 Hình 14. Máy phân tích ẩm Hình 15. Máy đo pH Hình 16. Máy chuẩn độ acid-bazơ 785 TITRINO Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 31 Hóa chất: Cồn 90o, NaOH 0,1N, NaOH 0,01N, acid HCl 0,1N, muối NaCl. 3.1.5 Môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy bề mặt với thành phần môi trường là cám, trấu, cơ chất cảm ứng (vỏ bưởi) để sinh tổng hợp enzyme pectinmethylesterase. 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau đến sự tổng hợp pectinmethylesterase - Mục đích: nuôi Aspergillus oryzae ở các môi trường và thu nhận enzyme ở các khoảng thời gian khác nhau. Từ đó, xác định thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp để nấm sợi sinh tổng hợp pectinmethylesterase mạnh nhất. - Nguyên liệu: cám, trấu, vỏ bưởi (cơ chất). - Tiến hành thí nghiệm + Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho mỗi mẫu là 100g, môi trường được hấp thanh trùng, điều chỉnh pH và độ ẩm + Nhân tố thành phần môi trường: A A1: 75% cám + 15% trấu + 10% cơ chất A2: 75% cám + 20% trấu + 5% cơ chất A3: 70% cám + 25% trấu + 5% cơ chất + Nhân tố thời gian: B B1: 30 giờ B2: 36 giờ B3: 42giờ B3: 48giờ + Số nghiệm thức là : 12 nghiệm thức + Bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại  Số mẫu thí nghiệm là : 24 mẫu Kết quả tối ưu của thí nghiệm này được chọn làm cơ sở cho thí nghiệm sau. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 32 * Quy trình tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm thực hiện theo qui trình. Nguyên liệu được xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi Aspergillus oryzae với các thành phần môi trường khác nhau theo các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó thu enzyme và đo hoạt tính enzyme thu được. Xử lí nguyên liệu Hấp thanh trùng (121oC, 15 phút) Làm nguội Trộn giống vi sinh vật Tủ nuôi cấy Nguyên liệu (100g) 0,5% giống Thu nhận môi trường sau nuôi cấy Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 A1 A2 A1 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 33 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm, nhiệt độ, pH môi trường đến sự tổng hợp pectinmethylesterase - Mục đích: Xác định điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase là tốt nhất. - Tiến hành thí nghiệm + Chuẩn mỗi mẫu thí nghiệm 100g, hấp thanh trùng + Nhân tố nhiệt độ: C C1: 32oC C2: 37oC C3: 42oC + Nhân tố độ ẩm: D D1: 50% D2: 55% D3: 60% + Nhân tố pH: E E1: 4,5 E2: 5,0 E3: 5,5 + Số nghiệm thức: 27 nghiệm thức + Bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại  Số mẫu thí nghiệm là : 54 mẫu. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 34 * Quy trình tiến hành thí nghiệm C1 C2 C3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3E1 E2 E3 E1 E 2 E3 Thí nghiệm được tiến hành theo qui trình. Nguyên liệu được xử lí, hấp thanh trùng sau đó trộn giống vi sinh vật và nuôi ở nhiệt độ, pH, độ ẩm môi trường khác nhau. Thu enzyme pectinmethylesterase và đo hoạt tính enzyme. Làm nguội Xử lí nguyên liệu Hấp thanh trùng (121oC, 15 phút) Trộn giống vi sinh vật Nguyên liệu (100g) 0,5% giống Thu nhận môi trường sau nuôi cấy Tủ nuôi cấy Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 35 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (pectin) đến hoạt tính của pectinmethylesterase để xác lập phương trình Michaelis-Menten - Mục đích: tìm hằng số nhạy cảm Michaelis-Menten từ đó xác định được phương trình và đồ thị thể hiện ảnh hưởng của cơ chất đối với hoạt tính pectinmethylesterase. - Tiến hành thí nghiệm + Chuẩn mỗi mẫu thí nghiệm 1ml enzyme + Nhân tố nồng độ pectin: F Các nồng độ pectin (g/l) cần khảo sát là: 1, 1,5, 2,5, 3,5, 4, 5, 7,5, 10, 12,5 và 15 tương ứng từ F1 đến F10 + Số nghiệm thức: 10 nghiệm thức + Bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại  Số mẫu thí nghiệm là : 20 mẫu. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 36 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN Quá trình tạo enzyme pectinmethylesterase của nấm mốc Aspergillus oryzae phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH, độ ẩm,Bên cạnh đó, hoạt tính xúc tác của PME cũng chịu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất mà nó phản ứng. Môi trường nuôi sau khi đã thanh trùng sẽ được trộn giống nấm mốc Aspergillus oryzae vào, sau thời gian nuôi cấy, thu môi trường và đo hoạt tính PME tạo thành bằng máy chuẩn độ acid-bazơ tự động. Kết quả khảo sát các yếu tố này thể hiện như sau: 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành pectinmethylesterase Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường khác nhau, thu nhận môi trường sau nuôi cấy ở các khoảng thời gian khác nhau và đo hoạt tính enzyme thu được. Với: A1 là mẫu 75% cám-15% trấu-10% vỏ bưởi A2 là mẫu 75% cám-20% trấu-5% vỏ bưởi A3 là mẫu 70% cám-25% trấu-5% vỏ bưởi B1 là mẫu 30 giờ B2 là mẫu 36 giờ B3 là mẫu 42 giờ B4 là mẫu 48 giờ Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 37 Hoạt tính PME riêng Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính riêng của pectinmethylesterase được thể hiện ở bảng và hình sau: Bảng 6. Hoạt tính PME riêng theo ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy Môi trường Thời gian nuôi (giờ) Môi trường - thời gian Hoạt tính PME riêng (đv /g) Hoạt tính PME riêng trung bình (đv/g) 0,077 30 A1B1 0,109 0,093f 0,973 36 A1B2 1,110 1,042cde 1,815 42 A1B3 1,306 1,561abc 1,006 A1 (75% cám,15% trấu, 10% vỏ bưởi) 48 A1B4 0,880 0,943de