Luận văn Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi Y - Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

h thể của amylose và amylopectin được xếp chặt vào bên trong các hạt tinh bột có kích thước từ 10 đến 35µm đối với củ sắn (Tongdang, 2001). Tinh bột sắn có độ trong cao hơn các tinh bột ngũ cốc do sự liên kết yếu giữa các phần tử tinh bột trong hạt. Độ nhớt của tinh bột sắn cũng đạt giá trị khá cao. Nhiệt độ hồ hóa trung bình 67-75oC. Hồ bột sắn thường dai là do hàm lượng amylose tương đối thấp (20-25%) và do cấu trúc của amylopectin. 1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31] Bắp là cây trồng chiếm 36% sản lượng trên thế giới. Bên cạnh vai trò lương thực, nguồn tài nguyên tự nhiên, tái sinh được, đa dụng và có tính tự hoại này đang có nhiều ứng dụng khác trong thương mại. Tinh bột, thành phần chính có trong bắp, là một polysaccharide hình thành từ nhiều nhóm đường đơn α-glucose với liên kết carbon 1-4 tạo thành mạch dài chứa 500-2000 đơn vị đường đơn glucose. Hạt tinh bột bắp (bắp vàng) có kích thước trung bình 5-20μm, hình đa giác, tròn. Có thành phần (%) hóa học chính như sau: amylose: 20; protein: 6-10; độ ẩm trung bình khoảng 9,5; chất tro: 1,6; chất béo: 5,1; cellulose: 4.1; Nhiệt độ hồ hóa khoảng 52-59oC. 23 1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10] Một tính chất quan trọng của tinh bột là quá trình thủy phân liên kết α-D (1,4); (1,6)- glycoside giữa các đơn vị glucose bằng acid hoặc bằng enzyme. Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường. 1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32] Dưới tác dụng của axit một phần các liên kết giữa các phân tử và trong phân tử tinh bột bị đứt, làm giảm kích thước phân tử, tinh bột thu được những tính chất mới. Acid được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất dextrin, maltodextrin và một vài loại siro có đương lượng dextro (dextrose equivalent - DE) khoảng 40. Sản phẩm có DE thấp thường bị thoái hóa do thủy phân không hoàn toàn, còn sản phẩm DE cao hơn lại có độ ổn định màu và vị kém. Sự thủy phân tinh bột bằng acid đã được sử dụng rộng rãi trong quá khứ. Nhưng hiện nay gần như được thay thế bằng các quá trình thủy phân bằng E. Vì sử dụng acid đòi hỏi các vật liệu chống ăn mòn, tăng độ màu và hàm lượng muối trong sản phẩm, cần nhiều năng lượng để nâng nhiệt độ phản ứng và tương đối khó kiểm soát. Ngoài ra, các acid mạnh dùng trong thủy phân không thân thiện với môi trường và gây nhiều khó khăn cho xử lí nước thải. 1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33] Tinh bột có thể bị thủy phân bởi hệ E đặc hiệu với liên kết α-1,4 như hệ enzyme amylase; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 như pululanase,; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 và liên kết α-1,4 như γ-amylase, Trong sản xuất công nghiệp các đặc điểm và các tính chất của các sản phẩm thường phụ thuộc vào nguồn E được sử dụng, nồng độ E và thời gian thủy phân. Quá trình thủy phân tinh bột từ E vi sinh vật tạo dung dịch đường có thể chia làm 3 giai đoạn theo sơ đồ: 24 1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14] Hiện nay, nấm mốc được dùng phổ biến để thu chế phẩm amylase đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong sản xuất rượu, bia, sinh khối nấm men, Trong công nghệ sản xuất sinh khối nấm men, sản phẩm thu được là những tế bào chứa hàm lượng protein rất cao (40-60%), đồng thời còn chứa lượng không nhỏ các chất béo, vitamin và các chất khoáng. Đặc biệt, protein vi sinh vật theo hàm lượng axit amin, vitamin và mức độ hấp thụ còn vượt trội hơn nguồn protein động vật. Vì vậy, việc dùng sinh khối nấm men khô làm nguồn protein-vitamin bổ sung trong khẩu phần thức ăn chăn nuôi gia súc và gia cầm đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn. Sản phẩm này thường được gọi là Men gia súc hay Men thức ăn chăn nuôi, hay nguồn protein đơn bào (SCP) có ý nghĩa rất quan trọng đối với ngành kinh tế quốc dân. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men từ sản phẩm đường hóa nguồn nguyên liệu tinh bột nhờ Asp. niger được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật [14] Tinh bột Dextrin hóa α - amylase Glucoamylase β - amylase Pululanase Oligosaccharid, maltose, α - glucose Đường hóa Dextrin mạch thẳng và mạch nhánh Glucoisomerase Fructose Đồng phân hóa 25 Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men[14] Asp. niger Tinh bột α - glucose γ - amylase Nhân giống Nấm men D-glucose, các muối vô cơ Li tâm Nuôi thu sinh khối Môi trường dinh dưỡng Xử lý Sinh khối Thải bỏ Sấy khô Thành phẩm Phaàn 2 Vaät lieäu – Phöông phaùp 26 PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu - Vi sinh vật: Nấm mốc Asp. niger từ Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM. Nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm (Hãng Angel, Trung Quốc). - Enzyme: γ-amylase hòa tan thương phẩm (Hãng Novo Đan mạch). - Cơ chất: Bột năng (mua tại các chợ trong thành phố) và tinh bột tan (phòng thí nghiệm sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp). - Chất mang vô cơ diatomite (celite) và hữu cơ chitosan (phòng thí nghiệm sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp). 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm do phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM và phòng thí nghiệm Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20] * Nguyên tắc Nấm mốc Asp. niger có khả năng sinh bào tử nên có thể giữ giống bằng cách cấy trên môi trường thạch nghiêng PGA (Potato glucose agar). * Môi trường PGA gồm: Khoai tây: 100g; Glucose: 10g; Agar: 10g; Nước cất: 500ml; pH = 6.5; Hấp khử trùng 1210C, 15 phút. * Cách tiến hành: - Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và nấu chín. - Chiết dịch nấu khoai tây, nếu dịch có quá nhiều tinh bột phải lọc qua vải lọc. 27 - Cho agar vào dịch đang đun, khuấy liên tục cho đến khi agar tan hoàn toàn, tiếp tục cho glucose vào, khuấy đều cho tan rồi đổ vào các ống nghiệm, đậy nút bông, hấp khử trùng. Sau đó, đặt nghiêng các ống nghiệm tạo thạch nghiêng. - Cấy chuyền từ ống giống sang các ống thạch nghiêng, nuôi ở t0 = 30-350C trong 2-3 ngày cho bào tử mọc đều bề mặt thạch nghiêng, bảo quản ở t0 = 5-90C. 2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20] 2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20] Sau khi hoạt hóa giống ta tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ theo các bước sau: - Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến (gồm : 1,5g KH2PO4; 3,5g NaNO3; 20g glucose; 0,5g KCl; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,1g FeSO4.7H2O; 20g agar; 1000ml nước cất; khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút) đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 3mm. - Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng rồi cấy chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. - Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C trong khoảng 7 ngày. - Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, dạng sợi nấm mọc ở trên mặt thạch, đặc điểm mép khuẩn lạc, 2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20] - Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 1mm. Khi thạch đã đông, dùng khoan nút chai vô trùng có d ≈ 9mm khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, lame, lamelle, giấy thấm vô trùng. - Đặt khối thạch lên lame. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lamelle lại và cho vào hộp petri có sẵn giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. - Sau 2-3 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng 30 – 320C, gỡ lamelle ra, úp lên một lame sạch khác. Gỡ bỏ khối thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamelle lên trên ta được tiêu bản để quan sát các đặc điểm hình 28 thái nấm sợi ở vật kính x40: giá bào tử thể, thể bình, cuống thể bình, sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn, đặc điểm bào tử, 2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu [9][12][20] * Cấu trúc buồng đếm Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở phần giữa là lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 4,5 hình vuông có diện tích tổng cộng là 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn (1/25 mm2 / 1 ô). Mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, mỗi ô lớn có thể tích là 4.10-6 ml. * Cách tiến hành Lắc mạnh dịch huyền phù, dùng pipetman nhỏ một giọt dịch huyền phù lên bề mặt khung đếm. Đặt khung đếm lên bàn kính hiển vi. Đếm ít nhất 5 ô lớn, lấy trị số trung bình (không quá 10 tế bào/1 ô nhỏ ≈ 2.5 < a <10). * Cách tính kết quả: Số tế bào trên 1ml mẫu phân tích (N): N (tế bào/ml) = Trong đó: a: số tế bào trung bình có trong một ô lớn. v: thể tích một ô lớn = 4 x 104. K: hệ số pha loãng mẫu. Vậy N (tế bào/ml) = = 0.25 x a x K x 106. * Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang a/ Nguyên tắc Tế bào VSV là 1 thực thể nên khi hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới và làm đục môi trường. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào 1 cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm. 29 b/ Cách tiến hành Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách: - Pha loãng 1 huyền phù chứa bào tử nấm mốc cần kiểm nghiệm có mật độ bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế. - Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng khung đếm hồng cầu), xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này. - Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD610nm. * Xác định mật độ tế bào theo độ đục - Đo độ đục của 1 huyền phù tế bào cần xác định mật độ. - Từ trị số OD610nm đo được, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10a với a= log(N/ml)) từ đường chuẩn. 2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy Asp. niger thu γ – amylase [8] * Môi trường nuôi cấy: Cám: 70% - 75%; Trấu: 25%; Bột năng (hay bột bắp): 1 - 5%. * Dung dịch khoáng bổ sung vào môi trường tạo độ ẩm 50% gồm: NaNO3: 3g; K2HPO4: 1g; MgSO4: 0.5g; KCl: 0.5g; FeSO4: 0.1g; Nước cất: 1000ml; Khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút. * Cách tiến hành - Hỗn hợp cám, trấu, bột năng (hay bột bắp) sau khi bổ sung dung dịch khoáng được trộn đều rồi chia đều vào các erlen, bịt bông gòn. - Dùng pipet hút 1 ml dung dịch huyền phù nấm mốc cấy vào mỗi erlen (30g môi trường/1 erlen) (lượng bào tử cho vào khoảng 15x107). - Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng dùng tay lắc đều môi trường để giữ độ xốp và thoáng khí. 30 2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger [3][7][9] 2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy - Tại mỗi thời điểm nuôi cấy (2; 2,5; 3; 3,5; 4 ngày), lấy 10g môi trường nuôi cấy nấm mốc hòa trong 20 ml nước cất, để trên máy lắc 30 phút, nghiền rồi lọc qua vải, sau đó li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. - Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc, thu dịch E thô. - Pha loãng dịch E thô lần lượt 10 lần, 50 lần, 100 lần tùy vào thời điểm cần khảo sát hoạt độ. - Tiến hành phản ứng xác định hoạt độ E theo từng thời điểm nuôi cấy theo mục 2.2.7. - Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến đổi của hoạt độ γ – amylase theo thời gian nuôi cấy khác nhau của chủng nấm mốc Asp. niger. 2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi - Lần lượt thay đổi tỷ lệ cám gạo và bột năng (hay bột bắp) trong thành phần môi trường nuôi cấy theo các tỉ lệ: 75/1; 74/2; 73/3; 72/4; 71/5 (gram). - Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt độ γ – amylase theo sự thay đổi thành phần môi trường của nấm mốc Asp. niger theo mục 2.2.4, 2.2.6 và 2.2.7. 2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25] - Nuôi cấy nấm mốc trong khoảng thời gian và môi trường tối ưu. - Tách chiết, thu nhận chế phẩm E bán tinh khiết được thực hiện bằng cách sau: Môi trường nuôi nấm mốc được khuấy trộn với nước cất (tỷ lệ nước cất và môi trường là 2:1), lọc qua vải lọc lấy dịch lọc, thu được phần dịch chứa E. Làm lạnh nhanh dịch chiết E xuống còn 3-50C, kết tủa E bằng cồn theo tỷ lệ 4 cồn : 1 dịch enzyme (cồn cũng đã được làm lạnh 3-50C). Ly tâm dịch tủa trong 15 phút ở tốc độ 31 6000 vòng/phút. Thu tủa, sấy ở nhiệt độ 35-400C cho đến khi độ ẩm của tủa đạt 11- 14%. Thu được chế phẩm E khô. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9] 2.2.7.1. Nguyên tắc Hoạt độ γ – amylase (gluco-amylase) được tính dựa trên lượng glucose tạo ra khi thủy phân tinh bột bằng enzyme. Hàm lượng glucose được xác định bằng cách đo mật độ quang của dung dịch tạo màu khi có mặt thuốc thử DNS (3, 5 dinitro salicilic acid) tại bước sóng 530nm. Một đơn vị hoạt tính γ – amylase xúc tác thủy phân tinh bột, giải phóng 1 μg glucose trong 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ 450C, pH 5. 2.2.7.2. Cách tính HđC = Với: m: Hàm lượng glucose (μg/ml). L: Độ pha loãng mẫu. 5: Thể tích dung dịch phản ứng (ml). t: thời gian phản ứng (10 phút). HđC: hoạt độ chung γ – amylase (UI/g_CPE). 2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26] Phương pháp này dùng để xác định lượng protein hòa tan có trong 1 gram chế phẩm enzyme (hay 1ml chế phẩm enzyme lỏng), từ đó xác định hoạt tính riêng của enzyme trên 1mg protein enzyme. Phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng protein trong các nguyên liệu khác. 2.2.8.1. Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau. m. L. 5 t 32 Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức chất có màu, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì thế có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1μg/ml. 2.2.8.2. Hóa chất Dung dịch albumin 0.1%: 0.1g albumin pha nước cất thành 100ml dung dịch. Dung dịch A: 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml dung dịch. Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4 hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% thành 100ml dung dịch. Dung dịch C: chỉ pha để dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỷ lệ 49/1. 2.2.8.3. Cách tiến hành Hút 0.4ml dung dịch có chứa protein cho vào ống nghiệm sạch khô, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Sau đó thêm 0.2ml thuốc thử Folin vào, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sóng 520nm. 2.2.8.4. Cách tính * Dựng đường chuẩn Thực hiện xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thông thường dùng albumin tinh khiết. Hút 0.4ml dung dịch albumin chuẩn có nồng độ theo thứ tự: 0; 50; 100; 150; 200; 250 μg/ml vào các ống nghiệm sạch khô đã đánh số phân biệt. Thực hiện phản ứng tương tự như trên. Muốn vậy phải thực hiện theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn với nồng độ khác nhau: Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein (μg/ml) 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Nước cất (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 33 Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ở bước sóng 750nm (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). * Tính kết quả Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu thí nghiệm có chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần đo. 2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9] Hoạt độ của chế phẩm enzyme được xác định theo công thức: CPE CPE UIHđC / gHđR mg _ protein _ E / g mg _ protein _ E = = ∑ Với: + HđR: hoạt độ riêng. + HđC: hoạt độ chung. + ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g hay ∑UI/ml). + C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE. + CPE: chế phẩm enzyme + UI: đơn vị hoạt độ enzyme. + ∑ UI: tổng đơn vị hoạt độ enzyme. 2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19] 2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị * Nguyên tắc Dựa vào liên kết cộng hóa trị được hình thành giữa γ-amylase lên màng chitosan. 34 * Cách tiến hành Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1g chitosan trong 100ml acid acetic 1%. Sau đó đổ dung dịch chitosan 1% lên phiến kính phẳng và để khô trong trong không khí trong tủ hút. Màng chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH 0.1M/24h để trung hòa lượng acid dư. Sau đó màng được rửa nhiều lần với nước cất cho đến khi nước rửa trung tính và để khô ở nhiệt độ phòng. Màng chitosan chuẩn có bề dày khoảng 50μm. 1g chitosan tạo được 250m2 màng. * Hoạt hóa màng chitosan Màng chitosan được ngâm và lắc trong dung dịch glutaraldehyde 2%/4h ở nhiệt độ phòng, rửa mẫu nhiều lần với nước cất nhằm loại hết dư lượng glutaraldehyde. * Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị Màng chitosan đã được hoạt hóa bằng glutaraldehyde được ngâm và lắc với 50ml dung dịch đệm chứa 0.2g chế phẩm γ-amylase/1-5h ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục dùng dung dịch đệm (với thể tích xác định) rửa màng chitosan đã có enzyme cố định để loại bỏ các enzyme không gắn kết lên màng. Lượng protein cố định và hoạt tính γ-amylase được xác định gián tiếp qua lượng protein và tổng đơn vị hoạt độ E hiện diện trong nước rửa. 2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương pháp hấp phụ [14] * Nguyên tắc Dựa vào khả năng hấp phụ γ-amylase lên chất mang Celite. * Cách tiến hành - Cân 0.2g enzyme pha thành 50ml với dung dịch hệ đệm pH 5. - Cân 5g diatomite, cho từ từ vào 50ml dung dịch enzyme trên, khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở 40C, lọc dịch lọc bằng giấy lọc. - D ịch sau khi l enzyme trên giấy lọc được bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 35 * Cách tính hiệu suất gắn protein: HScố định protein (%) = (Hàm lượng Pr cố định = HLPr trước khi cố định – HLPr còn trong dịch lọc) Với: + HS: hiệu suất. + HL: hàm lượng. + Pr : protein. * Cách tính hiệu suất hoạt độ enzyme γ-amylase cố định: HS hoạt độ E cố định (%) = x100% 2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylasecđ từ Asp. niger và thương mại để thủy phân các loại tinh bột [12][15] * Nguyên tắc Chế phẩm γ-amylase cố định trên chất mang phù hợp ở trên sẽ được dùng thủy phân tinh bột sắn và tinh bột bắp ở nhiệt độ 450C và pH=5 với độ biến thiên thời gian là 30 phút. Khả năng thủy phân dựa vào lượng đường khử tạo thành. * Cách tiến hành Cho 20ml dung dịch cơ chất 2% vào erlen 100ml, thêm vào 20ml dung dịch đệm pH 5, rồi bổ sung lượng enzyme cố định, để trên bồn ổn nhiệt và giữ ổn định ở nhiệt độ 450C để thực hiện phản ứng thủy phân của γ-amylase trên cơ chất. Cứ mỗi 30 phút lấy ra 1ml đem xác định lượng đường khử tạo thành, từ đó xác định được thời gian phù hợp để có lượng đường tối đa. 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPE γ-amylasecđ * Nguyên tắc HL Pr cố định HL Pr trướ khi cố định x 100 ƩUI ban đầu – ƩUIcòn lại trong dung dịch ƩUI ban đầu 36 Quá trình thủy phân tinh bột bởi Ecđ được lặp lại nhiều lần trong bình chiết để hạn chế sự hao tổn Ecđ. Kết quả mỗi lần lặp lại được xác định qua lượng đường khử tạo thành. * Cách tính Từ kết quả thu được ở các lần tái sử dụng đem so sánh với kết quả ban đầu có thể suy ra được số lần tái sử dụng của enzyme cố định. 2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm men [6], [9], [12] 2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy phân tinh bột Từ kết quả thu được theo phương pháp 2.2.10 ta xác định được nồng độ α – glucose của dung dịch sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylasecđ. 2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein Lấy dung dịch glucose tạo thành sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylasecđ điều chỉnh nồng độ đường và bổ sung cao nấm men, thanh trùng để làm nguyên liệu cho quá trình nuôi nấm men bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm trong điều kiện hiếu khí, to = 25 – 35oC, pH = 3.5 để thu sinh khối giàu protein. Khi lượng sinh khối đạt 25 – 50g/l, ly tâm thu được bột nhão có 15 – 20% chất khô, sấy khô đến độ ẩm 7% và nghiền bột để thu chế phẩm sinh khối giàu protein thô. Nếu muốn thu protein ta cần phá tế bào, chiết thu dung dịch và kết tủa thu protein. Với mục đích xác định điều kiện tối ưu để đạt lượng sinh khối tối đa chúng tôi tiến hành khảo sát thêm: - Nồng độ đường phù hợp từ 4-12% (sau bổ sung đường). - Thời gian nuôi từ 2 – 6 ngày. - Nhiệt độ nuôi: 30-350C. 37 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12] Sử dụng cách tính xác suất thống kê để xử lý các số liệu thực nghiệm thu được. 2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo. n iX .xn = ∑ Với: + x : giá trị trung bình. + ix : giá trị của một lần đo. + n : số lần đo Nếu đo lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật, nhưng thực tế không dễ đạt được điều này. Vì vậy, để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, cần dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo. 2.2.14.2. Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn * Độ lệch mẫu: Độ lệch mẫu là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. ia x x= − Với: + a : độ lệch mẫu. + x : giá trị trung bình. + ix : giá trị của một lần đo. * Độ lệch chuẩn: Độ lệch chuẩn là sự sai số có thể có trong một lần thu thập số liệu với n lần đo. 2 i(x x)S n 1 − = − ∑ 38 2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số góc a dựa trên phần mềm excel [4] Phương pháp này nhằm ứng dụng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn và xác định nồng độ protein “C” của dung dịch protein cho tất cả các thí nghiệm, dùng các giá trị ∆OD và ứng dụng hàm Linest (∆OD, nồng độ) có sẵn trong Excel để xác định hệ số góc “a”, từ đó xác định giá trị OD đường chuẩn theo công thức: ODC a ∆ = Phaàn 3 Keát quaû – Bieän luaän 39 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger Chúng tôi nhận chủng giống có kí hiệu AN2 do phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. Để thuận tiện cho các nghiên cứu phục vụ đề tài, sau khi hoạt hóa giống, chúng tôi gửi mẫu tới phòng xét nghiệm NK – Biotek để định danh bằng sinh học phân tử đến loài. Sau đó, chúng tôi tiến hành bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng PGA trong tủ lạnh 40C theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.1. Kết quả giải trình tự 28S rRNA được tra cứu trên BLAST SEARCH cho thấy chủng AN2 thuộc loài Aspergillus niger (phụ lục 5.5) 3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.2. Sau 4 ngày nuôi trên môi trường Czapek Dox cải tiến tạo được một khuẩn lạc có đường kính 46mm. Kết quả được thể hiện trong các hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4. Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger A: Bào tử đính; B: Bộ cuống đính bào tử; C: Sợi cuống Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger Mặt trước khuẩn lạc tròn, nhung mịn, bột rời, màu đen, viền mép màu trắng, không có giọt tiết và sắc tố. Mặt sau có màu vàng nhạt. Có những nếp nhăn hướng tâm, tiết sắc tố màu vàng cam nhạt vào môi trường. Sợi nấm có vách ngăn, đa nhân, phân nhánh, không màu. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, khối bào tử trần. Bào tử hình cầu, nhẵn, mịn. B A A: Sợi nấm; B: Vách ngăn ngang A B C 40 Nhận xét: Từ các quan sát đại thể và vi thể khẳng định chủng tuyển chọn từ trường Đại học Khoa học Tự nhiên là chủng Asp. niger. 3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.3. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1. Bảng 3.1 : Tương quan giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD OD610nm Mật độ tế bào 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 N (tế bào / ml) 737,5 x 104 887,5 x 104 1338 x 104 2250 x 104 2975 x 104 log (N) 6,87 6,95 7,13 7,35 7,47 Đồ thị 3.1: Tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và OD Nhận xét: Trong giai đoạn đầu của sự phát triển nấm mốc có sự tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD. Từ đó chọn mật độ bào tử phù hợp để thu sinh khối tế bào cao và hoạt độ E cao. 3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương ph