Luận văn Nghiên cứu Sugarcane Yellow Leaf Virus gây bệnh vàng gân lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR

ần thể 65 cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng). Trong số 216 microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band. Kết quả đã chỉ ra rằng có 3 band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV. Phân tích kiểu gene trên 47 cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhƣng không liên kết với locus SSR khác. Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có thể di truyền đƣợc (Schenck và Lehrer, 2001). Những nghiên cứu về tính kháng trên mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV, nhƣng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). Ở Hawaii các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 đƣợc báo cáo là kháng với ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000). Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (nhƣ là S. robustum. Saccharum spontaneum, S. sinensis và Erianthus sp.) thƣờng không có virus ở trên cánh đồng mía ở Maunawili, nó đƣợc cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV Giống mía kháng ScYLV có thể đƣợc tạo ra thông qua biến nạp. Sự bất hoạt gene đƣợc coi nhƣ một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm của virus. Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã đƣợc hƣớng tới trong cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV. Bộ gene của ScYLV và chức năng các protein của virus đã đƣợc biết đến (F. Moonan, 2000), vì thế chiến lƣợc tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng. 17 Giống H62-4671 đã đƣợc biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã (non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus. Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu hiệu (Y. J. Zhu, 2003). Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 đƣợc bắn với plasmids pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV. Những cây đã biến nạp đƣợc ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari. Sự nhiễm đƣợc kiểm tra sau một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR. Kết quả thu đƣợc 37 cây từ 66 cây đƣợc kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005). 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Có 3 phƣơng pháp để loại bỏ virus đƣợc sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử lý bằng hóa chất. Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc loại bỏ virus ScYLV (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Có thể tạo cây sạch ScYLV bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (M. Chatenet và cộng sự, 2001; Y. Parmessur và cộng sự, 2002). Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là phƣơng pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất cây sạch virus và cũng là phƣơng pháp đƣợc chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhƣng chỉ đạt 29% khi nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, theo Parmessur (2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi cấy bằng chồi nách. Nhƣng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y. Parmessur và cộng sự, 2002). 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV 2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus. Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC. Nhóm chỉ thị theo hệ 18 thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). 2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, … Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi. 2.2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng Brix kế Độ brix đƣợc đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân chính lá +1 và đƣợc chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau: ­ Không bị bệnh: không có triệu chứng, độ brix nhỏ hơn 7. ­ Nhiễm nhẹ: độ brix từ 7 đến 14. ­ Nhiễm trung bình: Nhìn mặt trên và mặt dƣới lá có màu vàng, độ brix lớn hơn 14, phiến lá có màu vàng lan ra từ gân chính. ­ Nhiễm nặng: toàn bộ phiến lá và gân lá chính có màu vàng, triệu chứng khô từ cổ lá xuống bẹ lá, toàn bộ cây trong bụi có triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi có thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004). 2.2.7.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi huỳnh quang Những lát cắt tƣơi đƣợc cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam đƣợc làm tiêu bản trên một giọt nƣớc cất hai lần trên lam kính và đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Toàn bộ mô đƣợc nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh bởi đèn huỳnh quang. Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh đƣợc tiến hành thông qua một kính tách màu nhị sắc ở bƣớc sóng 510nm và một kính lọc màu vàng chặn lại tại bƣớc sóng 510nm. 19 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. (A) Chất huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá. (B) Cây không có triệu chứng các bó mạch libe bình thƣờng (J. Vega và cộng sự, 1997). Kiểm tra những lát cắt từ cây có triệu chứng vàng gân lá bởi phƣơng pháp phát huỳnh quang đã phát hiện ra những bó mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A). Trong những cây không có biểu hiện triệu chứng thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B). 2.2.7.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hóa chất đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Virus đƣợc tìm thấy ở dạng kết tụ vô định hình trong tế bào chất của tế bào kèm của mạch libe. Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất không thấy ở trong nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất. Đƣờng kính của hạt virus từ 22 đến 24 nm. 20 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía (VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thƣớc 100nm). (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS-ELISA Kháng nguyên thu đƣợc (hạt virus tinh sạch) sẽ đƣợc tiêm vào thỏ New Zeland để thu globulin miễn dịch. Kháng thể sau khi sản xuất sẽ đƣợc sử dụng cho DBIA, TBIA, ISEM để phát hiện các mô bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). DAS-ELISA đƣợc thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nƣớc mía cho thấy kháng nguyên từ dịch nƣớc mía có chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004). 2.2.7.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng tissue blot immunoassay (TIBA) Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số 21 lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus. Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) (Comstock và Gilbert) Sự nhiễm ScYLV đƣợc xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV. Lá đƣợc cắt khỏi cây và bản lá đƣợc cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn. Vị trí gốc của gân lá đƣợc cắt bằng dao mỏng. Miếng cắt gân lá đƣợc cố định trên màng nitrocellulose. Sau đó màng đƣợc rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho ScYLV đƣợc tạo ra bởi B. E. Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo Comstock và Miller (2003)). Sau đó đƣợc phủ bởi cơ chất tạo màu. Kính hiển vi ba chiều đƣợc dùng để kiểm tra vết lá in. Vì ScYLV đƣợc xác định ở trong mạch libe nên mẫu dƣơng tính cho sự hiện diện của virus khi những bó mạch libe trong vết lá in có màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9). 22 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh của BYDV-PAV. Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C), thân (D). Tỷ lệ thƣớc 200µm. (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.8 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting) Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting). Màng đƣợc ngâm 2 phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 40C với kháng thể sơ cấp (toàn bộ huyết thanh) đƣợc pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin. Những band protein đƣợc phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide đƣợc xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A). Protein 58, 27 và 17 kDA (6 band) đƣợc xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV (hình 2.11,lane1). Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000) 23 2.2.7.9 Real -Time PCR Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong chẩn đoán virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác. Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide (NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, đƣợc gọi là AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998). NASBA là phƣơng pháp khuếch đại RNA đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 410C sử dụng hai oligonucleotide primer đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA polymerase. Gần đây, AmpliDet RNA đã đƣợc sử dụng để xác định một số virus thực vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002). AmpliDet RNA có độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mô cây phức tạp nhƣ vỏ, chồi, củ và quả. Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện đƣợc đồng thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và cộng sự, 2002). Hình 2.11. Phân tử Beacon (Nguồn: Phân tử beacon MB ScYLV đƣợc thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’. Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm NASBA đặc hiệu cho ScYLV đƣợc chọn để lai với vùng tƣơng tự nhƣ biotinylated probe BIO ScYLV. Phân tử beacon đƣợc kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị kích thích ở bƣớc sóng 494 nm, phát sáng ở bƣớc sóng 530 nm) và quencher 4-[4 - Vùng mang trình tự bổ sung với DNA đích 24 dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’. Đầu 6 nucleotide cấu trúc sợi đôi ở 410C sẽ kìm hãm sự phát quang khi không có sự bắt cặp với trình tự đích. Khi có mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 530nm sau mỗi 2 phút. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao với ScYLV, có thể phát hiện ScYLV ở mật độ rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10-15g). Phƣơng pháp cho phép phát hiện ScYLV sau khi pha loãng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002). 2.2.7.10 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR RT-PCR đƣợc thực hiện trên dịch trích mô bị nhiễm ScYLV với cặp primer Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhóm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997). Cặp primer Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm có kích thƣớc 530bp đặc hiệu cho gene mã hóa protein vỏ của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)). Những primer này đƣợc sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nó đƣợc chứng minh rằng có khoảng 40% tƣơng đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV. Từ trình tự của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã đƣợc tạo ra (YLS111 và YLS462), nó đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997). Primer này khuếch đại gene mã hóa cho protein vỏ của ScYLV. Sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 352bp. Ngày nay cặp primer này đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi nhƣ Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thông tin cá nhân). Ngoài ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hóa protein vỏ cũng đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV nhƣ các cặp primer: ­ RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT (3660–3882bp). ­ RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T (4091–4109 bp). ­ RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4021bp). ­ RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA (4179–4199bp). ­ NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002). 25 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo Hawaii năm 1989. Chúng đƣợc thấy ở trên những cánh đồng giống H65-7052 và nó không giống nhƣ triệu chứng của sự thiếu dinh dƣỡng. Sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở tất cả các cánh đồng ở Hawaii (Schenck, 1990; trích bởi Schenck, 2001). Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng đƣợc nhập vào Louisiana gần đây. Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở Louisiana (McAllister, 2006). Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV). Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá trên những cánh đồng thƣơng mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nƣớc (Garcés và cộng sự, 2006). Ở Mauritius YLS đã đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72 1210. Tiếp sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện diện của ScYLV đã đƣợc xác định vào năm 1990 (S. M. Aljanabi và cộng sự, 2001). ScYLV đƣợc phát hiện đầu tiên ở Nam Phi năm 1997. ScYLV xuất hiện và lan rộng nhanh chóng trên những cánh đồng chọn lọc và lai tạo giống ở Pongola từ những cây bị nhiễm sang những cây mẫn cảm chƣa nhiễm khi chúng đƣợc trồng gần nhau. Ở Colombia ScYLV đã đƣợc phát hiện năm 1998. Nó đã nhiễm vào một vài giống thƣơng mại, đặc biệt là giống CC 84-75 đƣợc trồng phổ biến thứ hai trên các vùng trồng mía của nền công nghiệp mía Colombia. Vì sự mẫn cảm của hầu hết các giống lai và tính quan trọng của giống CC 84-75, triển vọng tạo ra những cây chuyển gene kháng lại ScYLV đã đƣợc nghiên cứu (Rangel và cộng sự, 2005). Tƣơng tự triệu chứng héo vàng cũng đƣợc nhận thấy ở trung tâm và đông châu Phi ở những năm 1960. Ở Brazil đã xuất hiện trên giống SP 71-6163 năm 1990 với diện tích 750000 ha. Hạt virus và kháng nguyên của ScYLV đã đƣợc xác định bởi EM, ISEM và DAS-ELISA trên các mẫu mô lá mía có triệu chứng YLS từ Australia, Brazil, Colombia, Mỹ, Guadeloupe, Malawi, Mauritius, Reunion Island, và Nam Phi. Kết quả 26 dƣơng tính với ScYLV ở tất cả các mẫu trên (Scagliusi và Lockhart, 2000). Chứng tỏ đã xuất hiện ScYLV ở tất cả các nƣớc trên. Toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) đã đƣợc giải trình tự. Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Cặp primer đặc biệt đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR (Abu Ahmad và cộng sự, 2006). Ở Hawaii một vài kỹ thuật miễn dịch đã thành công trong việc chẩn đoán sự nhiễm của ScYLV dựa trên những kháng thể đặc hiệu. Mặc dù vậy quá trình tinh sạch virus từ cây bị nhiễm gặp phải khó khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện diện với nồng độ thấp. Một lƣợng nhỏ protein của mía còn lại gây trở ngại cho độ đặc hiệu của kháng thể. Vì thế một kháng thể có hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc sử dụng trong chẩn đoán mà không bị trở ngại bởi protein của mía và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 2006). ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley (Colombia). Trong suốt năm 2004, tỉ lệ nhiễm bệnh ScYLS trên các cánh đồng thƣơng mại là 12,2%. Sự hiện diện của các nòi ScYLS đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật RT-PCR với primer o-FM359/323. Kết quả thu đƣợc là một band 1200bp đã đƣợc khuếch đại. Khi cắt sản phẩm này với enzyme cắt Sau 3AI thì thu đƣợc 3 band. Band 100bp và 200bp đƣợc phát hiện thì phù hợp với nòi ở Brazil và band 300bp là đặc thù của nòi Texas- Florida. Những mẫu xuất hiện đồng thời 3 band thì có thể là một nòi mới (Angel và cộng sự, 2006). Comstock và cộng sự (2005) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng ScYLV trên mía. 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam Hà Đình Tuấn (2004) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá. Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá. Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Việt Nam. 27 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR 2.4.1 PCR Kĩ thuật PCR PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế ADN đích 1 Biến tính (94o) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o) 1 2 3 4 n 28 các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sense primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisense primer hay reverse primer). Từ “xuôi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen. PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature). - Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing). - Tổng hợp mạch mới (Extension). Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. 2.4.2 RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR) thì tƣơng tự nhƣ kỹ thuật PCR, nó cho phép khuếch đại một lƣợng nhỏ RNA. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện RNA của virus. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (reverse trascriptase) (hình 2.13). Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên. Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 29 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR Khuôn RNA Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene). cDNA đƣợc tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase. Sợi cDNA đƣợc tạo thành. Khuôn RNA đƣợc loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA đƣợc sử dụng để thực hiện PCR. Sự gắn của primer với cDNA. Sợi bổ sung của cDNA đƣợc tổng hợp nhờ taq polymerase. cDNA sợi đôi đƣợc hình thành. Ba bƣớc biến tính, bắt cặp, kéo dài đƣợc lặp lại nhiều lần. 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu ­ Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bến Cát, Bình Dƣơng. ­ Xã Tân An, thị xã Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. ­ Xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. ­ Xã Mỹ Thạnh Tây, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An. Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu Chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá ở vị trí +2 (Hình 3.1). Mỗi mẫu lấy ở năm bụi khác nhau. Hình 3.1. Vị trí lá trên cây. Đối với tập đoàn giống mía gốc và giống mía mới nhập từ Thái Lan chúng tôi tiền hành lấy mỗi giống một mẫu. Đối với mía đƣợc nhân giống để sản xuất và mía nguyên liệu, số lƣợng mẫu đƣợc lấy tùy vào diện tích canh tác. Mẫu sau khi lấy đƣợc mã hóa, ghi nhãn và bảo quản cẩn thận (-200C) trong suốt quá trình phân tích. 31 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Máy móc, thiết bị - Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh). - Máy li tâm (Sigma, Hettich). - Tủ mát (nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo). - Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert). - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert). - Máy vortex (IKA Works). - Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Eppendorf). - Lò viba (Electrolux). - Cân phân tích. - Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad). - Máy đọc gel (Biorad). - Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus). - Kính hiển vi quang học (Olympus). - Máy chụp hình 4.0 (Olympus). - Màn hình Sony. 3.3.2 Dụng cụ - Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu. - Kéo. - Eppendorf 1,5 ml. - Eppendorf 0,2 ml. - Hộp đựng eppendorf. - Micropipette P1000. - Micropipette P100. - Đầu tip 1000 μl. - Đầu tip 100 μl. - Ống đong 20, 50, 100ml. - Khay đổ gel điện di. - Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel). - Lame và lamelle. 32 3.4 Hóa chất 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR Hóa chất dùng trong tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp gồm: - Dung dịch ly giải. - Dung dịch rửa nhẹ (5X). - Dung dịch rửa mạnh. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng). - Dung dịch pha loãng DNase. - Dung dịch pha loãng RNA. - β- mercaptoethanol 14,2 M (catalog #161-0710) (*). - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % ( * ) . - Ethanol 100 % và 70 % (*). - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) (*). - Nitơ lỏng (*). - NaOH 0,1M (*). - EDTA 1mM (*). - DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (*). ( * ): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit. Hóa chất sử dụng tạo cDNA và PCR - Nƣớc không chứa nuclease. - iTaq buffer 10X (Biorad). - iTaq DNA polymerase (Biorad). - MgCl2 (50 mM) (Biorad). - dNTP mix (10 mM) (BioRad). - Primer: Hai primer YLS 462 và YLS 111 (trình tự primer đƣợc cung cấp bởi TS. M. Irey). YLS111: 5' - TCT CAC TTT CAC GGT TGA CG-3’ YLS462: 5' - GTC TCC ATT CCC TTT GTA CAG C-3’ 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di - Agarose. 33 - TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8). - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega). - Ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 %. 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới. Sau đó, thiết vật đƣợc đặt trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame. Đặt lamelle l