Luận văn Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A

mã hoá protein 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh (Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV ñặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera). Sau ñó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng (Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992) Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ñộc tố (gồm 140 gen ñã ñược công bố) ñược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera). + Cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao (môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ñộc tố δ (Hoftey, H. và Whiteley, H.R, 1989) [33]. Mục tiêu chính của ñộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels, 1994) [34], [35]. Các tiền ñộc tố không hoạt ñộng cho ñến khi chúng bị hoà tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa, 1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37], [39], [46]. Các ñộc tố gắn vào chất nhận ñặc hiệu ở trong màng của tế bào biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, ñộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh của tế bào ñể gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao ñổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành ñộc tố sẽ tạo thành các lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ñổi ion nhanh chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22 1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993) [34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn trùng chết ñói hoặc nhiễm trùng ñường tiêu hoá. 2.3.2.2. ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng + Phân loại: Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25], [26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm chính: Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy + Cơ chế tác ñộng của VIP Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21]. 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) [28]. Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần 1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23 thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994). 100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs (1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh (H. armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hoặc cry1A(c). Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53]. Mới ñây nhất, Thủ tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020. Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm. Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit vector. Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá. Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24 30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A. tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0. Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 3.1.1 Vật liệu - Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau: Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày; thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt. Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước. - Các vật liệu khác: + Các plasmit Plasmit Kích thước (bp) ðặc tính Nơi cung cấp pCR@ 2.1-TOPO 3900 Ampiciline Kanamycine hãng Invitrogen pBI121 13000 Kanamycine Phòng CNTBTV + Nguồn gen vip3A do phòng Công nghệ tế bào thực vật phân lập + Chủng khuẩn: Chủng DH5α (E.coli) và C58 (A. tumerfaciens) 3.1.2 Hoá chất, thiết bị - Các enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI - Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp - Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine.... và các hoá chất thông dụng khác - Thiết bị máy móc: Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy ño pH, bộ ñiện di, máy PCR, bể ổn nhiệt.... Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26 3.2 ðịa ñiểm và thời gian - ðịa ñiểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 ñến tháng 9 năm 2009 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 3.3.1.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn - Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani) Yeast extract 5g/l Trypton 10 g/l NaCl 10 g/l Bacto agar(cho môi trường ñặc) 15g/l pH 7 - Phương pháp nuôi cấy: Khuẩn giữ trong glycerol ñược lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi lắc 200v/p ở 37oC qua ñêm. Sau ñó cấy ria trên ñĩa petri chứa LB ñặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt ñộ và thời gian thích hợp. - Giữ chủng: Bổ sung glycerol vô trùng ñến nồng ñộ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua ñêm, trộn ñều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và giữ chủng ở ñiều kiện -800C. 3.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmit của vi khuẩn E.coli a. Hoá chất sử dụng: Dung dịch I: - 50 mM glucose - 25 mM Tris HCl pH 8,0 - 10 mM EDTA pH 8,0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27 Dung dịch II: - 0,2 N NaOH - 1% SDS Dung dịch III: - 60 ml kali acetate 5M - 28,5 ml H2O Dung môi loại protein: - Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1) - chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - TE 0,01M pH 8,0 b/ Quy trình: - Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua ñêm ở 37oC, 200 v/p. - Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf loại 2 ml và ñem ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4oC ñể thu tế bào. - Cặn ñược hoà trong 100 µl dung dịch I . - Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, ñảo nhẹ nhàng - Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, ñảo nhẹ nhàng - Thêm 550 µl dung dịch Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 : 24 : 1), ñảo nhẹ nhàng - Ly tâm 12.000 v/p, 4oC, 15 phút. - Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - Bổ sung 1ml cồn tuyệt ñối và 10 µl 3M Sodium acetate, ñể lạnh -200C trong 3 giờ sau ñó ly tâm 12.000v/p trong 15 phút ñể thu DNA - Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 40 µl TE 0,01M, giữ ở -200C Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28 - Bổ sung RNase vào mẫu ñến nồng ñộ cuối cùng là 100 µg/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiết lại bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa bằng cồn 100% - ðiện di trên gel agarose 0,8% ñể xác ñịnh ñộ sạch của DNA. 3.3.1.3 Phương pháp ñiện di DNA trên gel agarose Các ñoạn DNA có khối lượng và ñiện tích khác nhau ñược tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng ñiện trường có ñiện thế và cường ñộ thích hợp a. Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch ñệm TAE 1X (Tris HCl, EDTA ...); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, ñệm tra mẫu 10X. b. Quy trình: - Chuẩn bị gel agarose: cho 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc ñều và ñun cho agarose tan hoàn toàn, ñể nguội ñến khoảng 50 - 60oC, ñổ dung dịch vào khay ñiện di có cài sẵn răng lược, ñể gel ñông cứng, rút lược và ñặt bản gel vào bể ñiện di, ñổ dung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm - Tra mẫu và ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với ñệm tra mẫu 10X theo tỷ lệ 1: 10, mix ñều và tra vào giếng, chạy ñiện di với thang DNA chuẩn ñể xác ñịnh trọng lượng phân tử DNA - Nhuộm bản gel: bản gel ñược lấy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút trong dung dịch nước có chứa EtBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh ñược chụp bằng máy soi gel. 3.3.1.4 Tinh sạch DNA từ bảng gel agarose a. Dụng cụ và hoá chất: - Cột thôi gel; eppendorf; tip các loại... - Dung dịch QG (solubilization buffer), dung dịch PE (washing buffer), dung dịch EB (elution buffer) hoặc nước cất khử ion .. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………29 b. Tiến hành: ðiện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy ñoạn gel chứa ñoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ 1Vmẫu : 3VQG và ủ trong 50oC trong 15 phút. Sau khi gel tan hoàn toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực ñại trong 1 phút và loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 1 phút. Bổ sung tiếp 750 µl dung dịch PE vào cột, ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút. Sau ñó ly tâm cực ñại 1 phút, ñổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút ñể loại bỏ hết PE. Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 µl nước cất. 3.3.1.5 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn Các vector ñược xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng: + Với một enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,5 - ðệm 10X riêng của enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme (10 U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 + Với hai enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,0 - ðệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme 1 (10U/l) 0,5 - Enzyme 2 (10U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 Phản ứng ñược ủ ở 37oC trong 3 -5 giờ. Sản phẩm cắt ñược kiểm tra bằng ñiện di trên gel agarose 0,8%. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………30 3.3.1.6 Phản ứng ghép nối ñoạn gen với vector: ðoạn DNA cần nối ghép và vector ñã ñược mở vòng ñược trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử. T4 ligase ñược cho vào phản ứng với nồng ñộ 1 ñơn vị/10µl phản ứng. Hỗn hợp phản ứng ñược trộn theo thứ tự: Thành phần Thể tích (µl ) - H20 1,5 - ðệm T4 ligase 10X 1,5 - ðoạn gen cần gắn 7,0 - Vector ñã mở vòng 3,0 - r ATP 1,0 - T4 ligase 1,0 - Tổng thể tích 15,0 Phản ứng ñược ủ qua ñêm ở 14oC 3.3.1.7 Biến nạp DNA plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ñược tiến hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất hoặc ñiện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN có thể chui vào. a. Chuẩn bị tế bào khả biến: Chủng khuẩn ñược cấy ria trên môi trường LB ñặc và nuôi qua ñêm ở 37oC, sau ñó lấy một khuẩn lạc ñơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37oC qua ñêm. Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 37oC khoảng 3 giờ cho ñến khi OD 660nm ñạt từ 0,6 - 0,8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm ñã giữ lạnh trên ñá và ly tâm 6000 v/p, 10 phút. Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl 2 0,1M . Chia vào mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung thêm 50 µl glycerol 60%, làm ñông nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -80 oC. Sau ñó, các tế bào ñược phục hồi trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………31 môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp ñược phát hiện trên môi trường thích hợp. Cấy trải lên ñĩa môi trường LB không có kháng sinh ñể kiểm tra. b. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt. - Bổ sung 5 µl ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 µl tế bào khả biến ñã ñể trên ñá 30 phút, giữ trên ñá 30 phút. - Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong ñá 5 phút. - Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải dịch tế bào lên trên ñĩa LB ñặc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua ñêm ở 37oC. 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung ñiện - Chuẩn bị tế bào A. tumefaciens khả biến trong các cuvet ñã khử trùng. - ðặt các ống cuvet ñã khử trùng vào ñá. - Bổ sung 5 µl plasmit tái tổ hợp vào 100 µl ñựng sẵn tế bào A. tumefaciens khả biến - ðảo nhẹ, ñặt trong ñá trong 5 phút, chuyển dịch sang ống cuvet mới - Xung ñiện: 2,5kw; 25 µF và 400 Ω trong 4 - 5 µ - Chuyển ngay ống dịch vào ñá, sau 5 phút, bổ sung 1 ml môi trường YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bào sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong 28oC trong 1 giờ - Cấy trải 100 µl tế bào vào ñĩa chứa môi trường chọn lọc và nuôi từ 24- 48 giờ. 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………32 Môi trường Thành phần cơ bản MS Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962) Tái sinh chồi (GM) MS + 1 mg/l BAP + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Ra rễ (RM) MS + 0,1 mg/l IBA + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc chồi (GM Kan 50) GM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan+ 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc cây (RM Kan 50) RM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan + 8g/l agar. pH = 5,8 Quy trình tái sinh cây thuốc lá từ mảnh lá 3.3.3.1 Tạo dịch huyền phù A.tumerfaciens Chủng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa vector quan tâm bảo quản trong glycerol trong ñiều kiện lạnh sâu (-80oC) ñược cấy sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC qua ñêm, sau ñó cấy vạch trên môi trường LB ñặc có kháng sinh thích hợp, nuôi trong ñiều kiện tối, 28oC trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc tròn, ñều, ñứng ñộc lập ñể cấy chuyển sang 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p, 37oC trong 7 - 8 giờ, hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua ñêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC. Dịch khuẩn thu ñược có OD660nm từ 0,6 - 1 là ñủ ñiều kiện ñể biến nạp 3.3.3.2 Biến nạp Từ những cây thuốc lá invitro, chọn những lá bánh tẻ, cắt các mảnh lá có kích thước khoảng 1cm2 và ñặt trong môi trường tái sinh ña chồi (GM) Môi trường tái sinh ña chồi (GM) Môi trường ra rễ (RM) Môi trường trấu cát (1: 1) Mảnh lá thuốc lá (MS) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………33 trong 2 ngày. Sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên GM, các mảnh lá ñược chuyển sang môi trường MS lỏng (khoảng 5 ml), ñổ dịch huyền phù vi khuẩn vào bình chứa các mảnh lá và lắc nhẹ nhàng. Sau 10 phút gắp các mảnh lá lên giấy thấm vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường GM , ñồng nuôi cấy 2 ngày, sau ñó cấy chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh ña chồi chọn lọc GM Kan 30. 3.3.3.3 Chọn lọc chồi sau biến nạp Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 cấy chuyển sang môi trường tái sinh ña chồi có bổ sung kháng sinh thích hợp ñể tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh. 3.3.3.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi ñộc lập, có 2 - 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (RM Kan 50). Sau 3 tuần, từ những cây tái sinh hoàn chỉnh và phát triển tốt trên môi trường ra rễ chọn lọc tiếp tục cấy chuyển sang môi trường ra rễ chọn lọc lần 2 ñể thu cây hoàn chỉnh. 3.3.3.5 Ra cây trên giá thể trấu cát: Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm ñể ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu ñất trong nhà lưới. 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Sau khi trồng vào bầu ñất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá ñể phân tích cây chuyển gen. 3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá thuốc lá a. Hoá chất sử dụng: Thành phần dung dịch ñệm Shorty buffer: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………34 1. 0,2 M Tris - HCl, pH = 9,0 2. 0,4 M LiCl 3. 25 mM EDTA 4. 1% SDS 5. Nước de ion b. Quy trình - Nghiền mẫu lá trong Eppendorf loại 2 ml bằmg Nitơ lỏng thành dạng bột mịn - Bổ sung 500 µl dịch ñệm “Shorty buffer” - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Hút 350 µl dịch nổi chuyển sang Eppendorf loại 1,5 ml có chứa sẵn 35 µl iso-propanol - Mix bằng cách ñảo ngược các ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Loại dịch nổi - Bổ sung 700 µl cồn 70%/ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút - Loại bỏ dịch nổi - Làm khô bằng không khí - Bổ sung 50 µl nước ñề ion, lắc nhẹ cho mẫu tan 3.3.4.2 Phản ứng PCR - Thành phần 1 phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất hai lần 10,3 ðệm (10X) 2,0 MgCl2 2,0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………35 dNTPs 1,6 Taq polymerase 0,5 Primer F 0,8 Primer R 0,8 DNA mẫu 2,0 Tổng 20,0 - Chương trình thực hiện phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt ñộ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 2 Biến tính 94 * 3 Bắt cặp * * 4 Kéo dài 72 * 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Từ bước 2 ñến bước 4 thực hiện 35 chu kỳ Ghi chú: *các thông số thay ñổi theo cặp mồi ñặc hiệu Các thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3 lần, mỗi thí nghiệm bao gồm 50 mẫu. Thí nghiệm ñược ñặt trong ñiều kiện ánh sáng ñiện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt ñộ trong phòng duy trì ở mức 26oC. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………36 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi ∑ số mảnh lá tái sinh ña chồi Tỷ lệ mảnh lá tái sinh ña chồi (%) = x 100 ∑ số mảnh lá biến nạp ∑ số cụm chồi tiếp tục tái sinh ña chồi Tỷ lệ cụm chồi tái sinh (%) = x 100 ∑ số cụm chồi sau biến nạp ∑ số chồi ra rễ Tỷ lệ cây ra rễ (%) = x 100 ∑ số chồi ñưa vào chọn lọc ∑ số cây sống sót Tỷ lệ cây sống sót (%) = x 100 ∑ số cây ñưa ra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………37 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A ðể tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen vip3A, việc thiết kế vector mang gen vip3A ñể chuyển vào cây trồng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo cây chuyển gen. Sơ ñồ 4.1: Sơ ñồ thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal protein) (protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa) xuất hiện trong pha sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây 35S gus NOST BamHI SacI S¶n phÈm PCR vip3A vip3A BamHI SacI Bam HI & SacI BamHI SacI 35S NOST BamHI SacI T4 ligase 35S NOST vip3A Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………38 ñộc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây ñộc ñối với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera). Trong nhóm gen vip thì gen vip3A ñược ñặc biệt quan tâm nghiên cứu vì chúng mã hóa cho các protein có hoạt lực diệt sâu mạnh cùng với phổ hoạt ñộng rộng. Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy mà protein Cry hầu như không có tác dụng. Gen sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen mã hóa cho protein có kích thước 2369 bp, mã hoá 793 axít amin, ñược công bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số AJ971413). 4.1.1 Thiết kế mồi ðể nhân thành công một gen, ñiều kiện ñầu tiên là có cặp mồi ñặc hiệu của gen ñó. Cặp mồi ñặc hiệu V2.1 và V2.2 ñược thiết kế ñể nhân gen vip3A dựa trên cơ sở trình tự gen vip3A ñã ñược công bố (phụ lục 2). Ngoài ra mồi V2.3 ñược thiết kế thêm ñể kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong cây sau khi chuyển gen. Các mồi này có những trình tự và thông số cần thiết thể hiện trên bảng 4.1. Bảng 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A STT Trình tự mồi Tm %GC Vị trí gắn V2.1 5'-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3' 61oC 42,8 1 - 20 V2.2 5'-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3' 62,5oC 42,8 2350-2370 V2.3 5'-GGAGAGCCATCCTTTTTTACTT-3' 55oC 40,9 579 - 605 Trên cặp mồi nhân vip3A ñược thiết kế thêm ñiểm cắt của 2 enzyme giới hạn là BamHI và SacI ñể phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này. Mồi xuôi (V2.1) gắn từ vị trí 1 ñến vị trí 20, mồi ngược (V2.2) gắn từ vị trí số 2370 về vị trí số 2350, mồi ngược V2.3 gắn từ vị trí 605 về vị trí số 579. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………39 GGATCC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn BamHI GAGCTC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn SacI 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR Theo lý thuyết, nếu ta cung cấp cặp mồi ñặc hiệu thì sẽ nhân chính xác ñược ñoạn gen nằm giữa hai mồi ñó. Cặp mồi ñược thiết kế ñể nhân toàn bộ gen vip3A có kích thước 2370 bp, nếu phản ứng PCR xảy ra ñặc hiệu thì theo lý thuyết sẽ thu ñược băng duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR cho thấy ñoạn DNA mã hoá protein Vip3A ñã ñược nhân lên một cách ñặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb, phù hợp với kích thước gen vip3A dự kiến. Sản phẩm PCR sau ñó ñược tinh sạch theo bộ Kit thôi gel (Gel purification Kit) của hãng Bioneer và ñiện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch. Kết quả ñược thể hiện trên hình 4.1. Hình 4.1: Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 1: marker 2: Tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A Ảnh chụp cho thấy một băng duy nhất có kích thước 2,4 kb, không có 2,4 kb 2,0 kb 2,5 kb 1 2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội