Luận văn Nghiên cứu tạo chế phẩm Enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma SP. phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua

bề mặt xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẵn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ ấm 3 - 4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt dung dịch lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm: + Hình dạng cuống sinh BT. + Hình dạng thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm BT đính, màu sắc, kích thước BT 2.2.4. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS  Nguyên tắc Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrobenzoic acid), sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm [10]. * Thuốc thử DNS - Dung dịch A: hòa tan 300 g muối Na-K tartrat kép vào trong 500 ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan 10 g 2-hydroxy 3,5-dinitrobenzoic acid vào 200 ml dung dịch NaOH 2N. - Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí.  Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine như sau [10]: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 37 Nồng độ N-acetyl-β-D- glucosamine 10μmol/ml chuẩn (μmol/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Thể tích dung dịch N-acetyl- β-D-glucosamine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan nồng độ glucosamine và giá trị OD.  Cách tiến hành thí nghiệm - Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày. - Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm thứ tự các chất theo bảng trên, lắc đều, đem đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút, sau đó làm lạnh nhanh. - Thêm 5 ml nước cất vào mỗi ống, lắc đều, tiến hành đo OD ở bước sóng 535 nm. 2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase  Nguyên tắc: Hoạt độ enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan [3], [56].  Cách tiến hành thí nghiệm Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1% - Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 g chitin hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 400C. Sau đó cho nước cất lạnh 50C từ từ tới 500 ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. - Dịch huyền phù sẽ được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính. - Sau đó bảo quản dịch huyền phù ở tủ lạnh (4 - 60C). Bước 2: Xác định hoạt độ enzyme chitinase  Với enzyme làm thí nghiệm - Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày. - Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1 ml huyền phù chitin 1% và 1 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 400C trong vòng 60 phút. - Ngừng phản ứng bằng 1 ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút. - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút hoặc lọc, thu dịch nổi. 38 - Cho 1 ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh. - Thêm 5 ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm.  Với dịch enzyme làm đối chứng Cho 1 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1 ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1 ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên. Lượng glucosamine tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson- Morgan.  Cách tính kết quả Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μg glucosamine từ chitin huyền phù trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ phản ứng 400C [56]. Hoạt tính chung (đvht/g CPE ) = Trong đó a: hàm lượng glucosamine (μg /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng v1: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) v2 : thể tích enzyme TN (ml) t : thời gian phản ứng (phút) m : khối lượng enzyme (g) 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn  Nguyên tắc: NS sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong MT để sinh trưởng, tổng hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô từ MT [21].  Cách tiến hành: Cân 10 gam MT bán rắn nuôi cấy NS thu enzyme chitinase vào các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó để nguội. Dùng giống trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết BT tạo dạng huyền phù. Tiến hành đếm BT bằng buồng đếm hồng cầu. Cho 1 ml huyền phù BT vào mỗi bình tam giác chứa MT đã chuẩn bị sao cho mật độ bào tử a.n.v1 v2.t.m 39 là 105 đến 106 bào tử/1 gam MT. Nuôi ở nhiệt độ phòng. MT nuôi cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian, điều kiện nhiệt độ, độ ẩm nhất định theo mục đích nghiên cứu cụ thể. 2.2.7. Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy  Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất vô trùng hòa tan tạo dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy ở nhiệt độ dưới 400C, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khô [16], [18].  Thực hiện: Sau khi nuôi cấy NS trong các điều kiện MT cụ thể, cho vào mỗi bình tam giác (chứa 10 gam MT) 80ml nước cất. Lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vòng/ phút, lọc qua vải, thu dịch lọc. Đem dịch lọc li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, ta được dịch enzyme thô. Để thu được CPE dạng bột khô, sử dụng tác nhân tủa là các dung môi hữu cơ hay muối trung tính để kết tủa enzyme, ly tâm thu tủa enzyme, sấy nhiệt độ dưới 400C thu được sản phẩm (CPE) [16], [18]. 2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE  Nguyên tắc: Dựa trên khả năng kết tủa các protein enzyme bởi ethanol, aceton và muối sulfat amon ở các tỉ lệ % độ bão hòa khác nhau, chúng tôi lần lượt khảo sát khả năng tủa enzyme với từng loại tác nhân trên ở các tỉ lệ khác nhau nhằm xác định điều kiện tủa cho hàm lượng và hoạt tính enzyme chitinase cao nhất.  Cách tiến hành: thu dịch enzyme chitinase, xác định lại thể tích dịch chiết, cho tác nhân tủa theo đúng tỉ lệ hoặc nồng độ khảo sát. Đối với tác nhân tủa (NH4)2SO4, tiến hành khảo sát ở các tỉ lệ % độ bão hòa từ 60 - 80% ; đối với tác nhân tủa ethanol và aceton, tiến hành khảo sát ở các tỉ lệ 1:2  1:4 (theo thể tích). Sau 12h (đối với ethanol và aceton) và 3 – 4 h (đối với sulfat amon) (4000 – 5000 vòng/ phút trong 10 phút), thu phần tủa, sấy khô ở 35oC. Xác định hoạt tính chitinase của CPE [16], [21]. Lưu ý: các dung môi ethanol và aceton phải được làm lạnh trước để hạn chế gây biến tính cho enzyme trong quá trình tủa. Khi cho ethanol, aceton vào dịch enzyme phải cho từ từ và khuấy đều để tránh hiện tượng tủa cục bộ. 40 2.2.9. Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane  Nguyên tắc: Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) với nước hay với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex [21].  Cách tiến hành: cho dung dịch enzyme vào cellophane, sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là enzyme – protein có phân tử lớn [21]. 2.2.10. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ chitinase của NS Yếu tố MT ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của NS như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, MT nuôi cấy, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng NS nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất.  Khảo sát ảnh hưởng của thành phần MT nuôi cấy Thành phần MT có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của NS. Tiến hành nuôi chủng NS nghiên cứu trong 3 MT bán rắn đề xuất MT 7, MT 8 và MT 9 trong 168h. Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168h nuôi cấy tiến hành thu dịch lên men và xác định hoạt độ chitinase.  Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng Chất cảm ứng trong MT nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sự tổng hợp enzyme của NS. Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT cảm ứng sinh chitinase, trong đó sử dụng nguồn cơ chất cảm ứng lần lượt là bột chitin, chitin huyền phù 1%, bột vỏ tôm, bột vỏ cua. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase.  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, lần lượt bổ sung chitin huyền phù với các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%. Sau 72h nuôi cấy, tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase. 41  Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cấy Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, ủ trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 200C, 250C, 300C, 350C, 400C. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase.  Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu của MT nuôi cấy Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, sử dụng NaOH 1N và HCl 1N để điều chỉnh pH ban đầu của MT nuôi cấy để đạt các giá trị pH là 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5. Thanh trùng MT, để nguội, cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nhiệt độ đã xác định ở trên. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme tiến hành xác định hoạt độ chitinase.  Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy Sử dụng MT9, bổ sung các lượng nước khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70, 75%. Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nhiệt độ đã xác định ở trên. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme tiến hành xác định hoạt độ chitinase.  Khảo sát động học quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng NS nghiên cứu Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9 ở các điều kiện đã khảo sát ở trên trong 168h. Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 giờ nuôi cấy tiến hành xác định hoạt độ chitinase; pH và độ ẩm MT nuôi cấy. 2.2.11. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE chitinase  Nhiệt độ phản ứng: Cân 1 g CPE, hòa tan trong 25 ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ 20, 30, 40, 50, 60, 700C. Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nhiệt độ, xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu của CPE.  pH phản ứng: Cân 1 g CPE, hòa tan trong 25 ml nước cất. Sau đó điều chỉnh pH để đạt các giá trị pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu trên. Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên hoạt độ chitinase theo pH, xác định pH phản ứng tối ưu của CPE. 42  Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm enzym chitinase Cân 1 g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 25 ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ phản ứng và pH phản ứng tối ưu; thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên hoạt độ chitinase theo thời gian phản ứng, xác định thời gian phản ứng tối ưu của CPE chitinase.  Thời gian bảo quản: Điều kiện bảo quản ảnh hưởng trực tiếp đến sự ổn định hoạt tính của CPE. Tiến hành bảo quản CPE chitinase từ chủng NS nghiên cứu ở các điều kiện nhiệt lạnh 4 - 80C và nhiệt độ phòng; không bổ sung thêm cơ chất trong 6 tháng. Cách 1 tháng lấy mẫu 1 lần, tiến hành xác định hoạt tính chitinase. 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác Nguyên tắc: khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối vi nấm gây bệnh cây trồng dựa trên việc định lượng sinh khối nấm bệnh sau khi cho CPE chitinase và các thuốc trừ nấm đặc hiệu tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh. Tiến hành Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh: Dùng que cấy lấy các bản thạch mỏng có tơ nấm cho vào bình tam giác có sẵn 20 ml nước cất vô trùng . Lắc dung dịch trên máy lắc 1000 vòng/phút trong 15 phút. Chuẩn bị dung dịch CPE chitinase 4%, enzyme β-glucanase 4%, dịch Vi-ĐK 4%, dịch thuốc trừ nấm 4%: Cân 2 g CPE, 2 g tác nhân kháng nấm khác (hoặc 2 ml đối với thuốc trừ nấm dạng lỏng) hòa tan trong 50 ml nước cất vô trùng. Chuẩn bị các bình tam giác, mỗi bình chứa 10 ml MT dịch thể CYA . Bảng 2.1. Cách tiến hành bố trí TN khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng khối vi nấm gây bệnh bởi CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác Lô TN Dịch huyền phù nấm bệnh Liều lượng các tác nhân kháng nấm 1 0,5 ml 0 (đối chứng) 2 0,5 ml 1,0 ml CPE 4% 43 3 0,5 ml 1,0 ml enzyme β-glucanase 4% 4 0,5 ml 1,0 ml dịch chế phẩm Vi-ĐK 4% 5 0,5 ml 1,0 ml dung dịch Anvil 4% 6 0,5 ml 1,0 ml dung dịch COC85 4% 7 0,5 ml 0,5 ml CPE 4% + 0,5 ml enzyme β-glucanase 4% 8 0,5 ml 0,5 ml CPE 4% + 0,5 ml dịch Vi-ĐK 4% 9 0,5 ml 0,5 ml CPE 4% + 0,5 ml dung dịch Anvil 4% 10 0,5 ml 0,5 ml CPE 4% + 0,5 ml dung dịch COC85 4% Đánh giá kết quả: Tiến hành nuôi cấy tĩnh các chủng vi nấm Fusarium sp., Phytophthora sp.; sau 5 ngày, thu sinh khối bằng giấy lọc (đã tính bì). Rửa nhẹ bằng nước cất và sấy khô ở nhiệt độ 80 – 100oC đến trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng sinh khối nấm (trừ đi phần bì) và so sánh khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác với đối chứng [19]. 2.2.13. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác Nguyên tắc BT vi nấm thường chỉ cấu tạo bởi một tế bào và chỉ có một nhân. Vách BT có thành phần cấu tạo là chitin, cellulose, hemicellulose, các hợp chất pectin, protein và các sắc tố, Dưới tác dụng của các nhân tố kháng nấm (chitinase, thuốc trừ nấm đặc hiệu), BT vi nấm gây bệnh cây trồng sẽ bị tiêu hủy. Quá trình tiêu hủy BT xảy ra khi vách BT bị phá vỡ bởi các enzyme phân giải, nguyên sinh chất thoát ra ngoài MT hoặc khi BT bắt đầu nảy mầm, các tác nhân trừ nấm sẽ ngăn chặn quá trình hình thành vách bảo vệ của sợi tơ nấm tạo điều kiện cho các enzyme phân giải phá vỡ sợi tơ nấm mới hình thành và BT nảy mầm bị tiêu hủy. So sánh số lượng BT trước và sau khi cho các tác nhân kháng nấm tác dụng sẽ xác định được khả năng tiêu hủy BT vi nấm gây bệnh cây trồng của tác nhân đó. Tiến hành Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh: Dùng que cấy lấy các bản thạch mỏng có tơ nấm cho vào bình tam giác có sẵn 20 ml nước cất vô trùng . Lắc dung dịch trên máy lắc 1000 vòng/phút trong 15 phút. 44 Chuẩn bị dung dịch chitinase 4% và các tác nhân kháng nấm khác 4%: Cân 2 g CPE, 2 g tác nhân kháng nấm khác (hoặc 2 ml đối với thuốc trừ nấm dạng lỏng) hòa tan trong 50 ml nước cất vô trùng. Bảng 2.2. Cách tiến hành bố trí TN khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác Số lô TN Dịch BT nấm bệnh Liều lượng các tác nhân kháng nấm 1 0,5 ml 0,5 ml nước cất vô trùng (đối chứng) 2 0,5 ml 0,5 ml dung dịch CPE 4% 3 0,5 ml 0,5 ml dịch Vi-ĐK 4% 4 0,5 ml 0,5 ml β-glucanase 4% 5 0,5 ml 0,5 ml Anvil 4% 6 0,5 ml 0,5 ml COC85 4% 7 0,5 ml 0,25 ml CPE 4% + 0,25 ml β-glucanase 4% 8 0,5 ml 0,25 ml CPE 4% + 0,25 ml dịch Vi-ĐK 4% 9 0,5 ml 0,25 ml CPE 4% + 0,25 ml Anvil 4% 10 0,5 ml 0,25 ml CPE 4% + 0,25 ml COC 85 4% Cách tính: Số lượng KL vi nấm (tương ứng với số lượng BT có khả năng nảy mầm) được tính theo công thức: Số lượng KL(CFU) = Ai x Di/V (với Ai là số KL đếm được trên đĩa, Di là độ pha loãng, V là dung tích huyền phù BT cho vào mỗi đĩa (ml)) [19]. 2.2.14. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] Chuẩn bị MT trồng cây con, đất Tribat. Gây nhiễm nhân tạo: trộn dịch huyền phù BT vi nấm gây hại sau 4 ngày nuôi cấy vào đất trồng cây con sao cho BT vi nấm gây bệnh có mật độ từ 107 – 108 BT/g đất. Sau đó chuyển cây cà chua con vào đất đã nhiễm bệnh. Quan sát kết quả sau khi trồng so sánh triệu chứng bệnh, tái phân lập vi nấm gây bệnh từ mẫu bệnh cây được gây nhiễm để xác định đúng tác nhân gây bệnh và đánh giá tỉ lệ phòng bệnh của chế phẩm. 45 2.2.15. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19]  Nguyên tắc: Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL được hình thành từ một TB duy nhất.  Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù BT đưa sang ống nghiệm có 9 ml NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4, 10-5. Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT5 được vô trùng cẩn thận. Cấy và dàn đều dịch pha loãng. Dùng pipetman lấy 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-4, 10-5 cho vào mỗi đĩa petri, mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa. Dùng que gạt vô trùng, gạt mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng TB. Ghi vào nắp hộp petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy mẫu. Gói kín các đĩa petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 25 - 300C. Sau 48 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ 25 đến 250 KL/đĩa.  Cách tính kết quả: Số lượng tế bào trong 1 ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai × Di/V Trong đó: Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa Di: độ pha loãng V: dung tích huyền phù BT cho vào mỗi đĩa (ml) 2.2.16. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14]  Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có mối tương quan thuận với số lượng VSV trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD (Optical Density) đo được ở bước sóng 535 nm (OD535) trên máy quang phổ (dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD535 và mật độ TB (CFU/ml).  Cách tiến hành:  Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ BT (đường chuẩn) Pha loãng huyền phù BT của NS cần xác định thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD535 đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6. Xác định giá trị thực tế OD535 của các huyền phù BT vừa được pha. 46 Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (CFU/ml) của các huyền phù này. Tính số lượng TB (CFU/ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi giá trị độ đục. Vẽ đường chuẩn biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa số lượng BT (CFU/ml) (trục tung) và OD535 (trục hoành).  Xác định mật độ TB theo độ đục và OD535 Sau khi nuôi cấy NS trong MT tương ứng với các điều kiện thích hợp, lấy dịch huyền phù BT đo OD535 (dịch huyền phù BT cần được pha loãng trước khi đo OD535). Từ giá trị OD535 đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng BT (CFU/ml) của mẫu và nhân với độ pha loãng. 2.2.17. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phòng vi nấm gây hại trên cây cà chua Kí hiệu: (A): Vi nấm gây bệnh (B): CPE chitinase (C): Tác nhân kháng nấm 1 (D): Tác nhân kháng nấm 2 - Thí nghiệm bao gồm các công nghiệm thức sau: Lô 1. Kí hiệu ĐC (Đối chứng) Gây nhiễm (A) vào đất, sau đó trồng cây con vào và không sử dụng thêm các biện pháp phòng trừ nấm bệnh. Lô 2. Kí hiệu TN 1: Trồng cây con vào đất đã nhiễm (A), sau 1 tuần sử dụng (B) để phòng trừ nấm bệnh. Lô 3. Kí hiệu TN 2: Trồng cây con vào đất đã nhiễm (A), sau 1 tuần sử dụng kết hợp (B) và (C) để kháng nấm bệnh. Lô 4. Kí hiệu TN 3: Trồng cây con vào đất đã nhiễm (A), sau 1 tuần sử dụng kết hợp (B) và (D) để kháng nấm bệnh. Bảng 2.3. Kế hoạch thực phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua Tuần 1 Nhiễm Phytophthora sp., Fusarium sp. vào đất. Làm bầu đất và gieo hạt. Tuần 2 Cho cây con (đã có 4 lá thật) từ bầu đất vào chậu đã nhiễm nấm bệnh. Mỗi chậu 10 cây (cách đều nhau). Mỗi lô TN lập lại 3 lần. Tuần 3 Phun dịch CPE và các tác nhân kháng nấm khác vào đất theo lô TN. Tuần 4 Theo dõi sự phát triển, triệu chứng bệnh, tỉ lệ bệnh, khả năng kháng 47 Tuần 5 bệnh khi sử dụng các biện pháp phòng trừ Thống kê các kết quả của từng lô TN. Tiến hành đánh giá kết quả, tính TLB và HLĐK theo công thức Abott. TLB (%) = 𝐴 𝐵 . 100% Trong đó: TLB: Tỉ lệ bệnh (%) A: Số cây bị bệnh B: Tổng số cây điều tra HLĐK (%) = 𝐶−𝑇 𝐶 . 100% Trong đó: HLĐK (%): Hiệu lực đối kháng (%). C: Tỷ lệ bệnh (%) ở công thức đối chứng sau xử lý T: Tỷ lệ bệnh (%) ở công thức thí nghiệm sau xử lý 2.2.18. Phương pháp xử lí số liệu thống kê Các TN trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình bày trong luận văn là số liệu trung bình ± sai số, được tính bằng phần mềm Microsoft Execl [5]. Kết quả thí nghiệm được xử lí thống kê bằng phần mềm Statgraphics plus 3.0 [22]. 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao Chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 4 chủng Trichoderma bằng cách xác định đường kính vòng phân giải và đo hoạt độ chitinase ban đầu của các chủng NS nghiên cứu. Kết quả trình bày trong bảng 3.1 và minh họa ở hình 3.1. Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải chitin và hoạt độ chitinase của các chủng NS nghiên cứu Chủng NS Đường kính vòng phân giải chitin (D-d, cm) Hoạt độ chitinase (UI/ml) Trichoderma BL1 4,9 ± 0,25 14,144± 0,159 Trichoderma BL2 6,1 ± 0,31 15,578 ± 0,089 Trichoderma BL3 3,4 ± 0,20 11,494 ± 0,029 Trichoderma BL4 2,5 ± 0,17 10,615 ± 0,059 Trichoderma BL1 Trichoderma BL2 Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy tất các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng tổng hợp enzyme chitinase. Trong đó, enzyme chitinase của chủng BL4 có khả năng phân giải chitin yếu nhất; đường kính vòng phân giải khoảng 2,5 ± 0,17 (cm) và hoạt độ Hình 3.1 Khả năng phân giải chitin của các chủng Trichoderma khảo sát Trichoderma BL3 Trichoderma BL4 49 chitinase đạt 10,615 ± 0,059 (UI/ml). Ba chủng còn lại BL1, BL2, BL3 có đường kính vòng phân giải chitin khá lớn và hoạt độ chitinase mạnh. Mạnh nhất là chủng BL2 có hoạt độ chitinase là 15,578 ± 0,089 (UI/ml) với đường kính vòng phân giải chitin là 6,1 ± 0,31 (cm). Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng Trichoderma BL2 để tiếp tục nghiên cứu. 3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma BL2 Các điều kiện nuôi cấy như thành phần MT, nhiệt độ nuôi cấy, pH, độ ẩm,có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, tạo BT cũng như khả năng tạo enzyme của NS. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là điều cần thiết. 3.2.1. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn Để chọn MT thích hợp nhất cho chủng Trichoderma BL2 sinh tổng hợp chitinase, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ chitinase của chủng NS nghiên cứu trên 3 MT đề xuất MT 7, MT 8 và MT 9 trong 168h. Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168h nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ chitinase. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và minh họa ở hình 3.4. Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thành phần MT bán rắn đến hoạt độ enzyme chitinase chủng Trichoderma BL2 theo thời gian Thời gian Hoạt độ chitinase (UI/ml) MT 7 MT 8 MT 9 24 h 9,320 + 0,177 7,533 + 0,068 12,833 + 0,124 48 h 14,676 + 0,112 14,418 + 0,166 15,713 + 0,177 72 h 13,231 + 0,064 18,206 + 0,064 20,609 + 0,118 Hình 3.2 Hình thái đại thể chủng Trichoderma BL2 Hình 3.3 Hình thái vi thể chủng Trichoderma BL2 50 96 h 9,376 + 0,101 13,365 + 0,101 14,671 + 0,110 120 h 5,483 + 0,051 7,024 + 0,105 7,914 + 0,061 144 h 5,281 + 0,599 7,757 + 0,195 7,606 + 0,086 168 h 4,189 + 0,064 4,777 + 0,042 5,690 + 0,109 Kết quả cho thấy, ở 3 MT, chủng NS nghiên cứu đều có khả năng tổng hợp chitinase. Ở MT 7 hoạt độ chitinase thấp nhất, MT 8 và 9 hoạt độ chitinase cao hơn nhiều. Theo El- Katatny M. H. và cs, MT 7 là MT nuôi cấy được đề nghị để sinh tổng hợp enzyme chitinase ở chủng T. harzianum. Thành phần của MT này chỉ có khoáng và nguồn ca