Luận văn Nghiên cứu tạo cơ chất peptide đặc hiệu cho protease của Hiv - 1

đa ̃đƣợc tổng hơp̣ với đầu thu không phát quang (dark quencher) là DABCYL (acid 4-[4'-(dimetylamino) phenyl] azo-benzoic) và đầu phát EDANS (acid 5-[(2'aminoethyl)-amino] naphtalenesulfonic). Khi cơ chất chƣa bi ̣ thủy phân bởi hoaṭ tính của protease HIV - 1, EDANS bi ̣ dâp̣ tắt bởi DABCYL do chúng gần nhau ; khi có hoạt tính của enzyme, DABCYL tách ra khỏi EDANS , nhờ đó EDANS phá t huỳnh quang và tín 17 hiêụ đƣợc máy quang phổ huỳnh quang thu lại. Tuy nhiên , căp̣ EDANS /DABCYL có nhƣợc điểm là tín hiệu và độ ổn định thấp , DABCYL ki ̣ nƣớc, vì vậy ảnh hƣởng tới tính tan của cơ chất, có xu hƣớng làm giảm ái lực của cơ chất với enzyme . Ngoài ra, một số cặp huỳnh quang khác cũng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ Abz/Nph [68] hoặc Fluorecein/rhodamine [43]. Tuy nhiên , các căp̣ huỳnh quang này có nhƣơc̣ điểm là tín hiêụ phát quang thấp , đô ̣nhaỵ kém và không bền taị pH thấp . Để khắc phục những hạn chế này , gần đây , môṭ số căp̣ huỳnh quang với hệ số hấp thu cao hơn là FAM /QXL 520 hoặc Hilyte fluor 488/QXL 520 đa ̃đƣơc̣ tổng hơp̣ và sƣ̉ dụng. Trong đó, Hilyte fluor 488 hiêụ quả hơn do hệ số phát quang cao và phổ pH ổn định rộng từ pH 3,5-7,5 [80]. Măṭ khác, các cặp huỳnh quang có bƣớc sóng ngắn thƣờng bi ̣ ảnh hƣởng bởi các chất gây nhiêm̃ hê ̣số hấp thu ̣thấp hoăc̣ taọ tín hiêụ nền cao. Vì vậy, gần đây, căp̣ huỳnh qua ng với bƣớc sóng dài thƣờng hay đƣơc̣ ƣu tiên sƣ̉ duṇg hơn có thể kể đến căp̣ huỳnh q uang IRdyr800CW-VSQNYPIVQNK- QC1 (Ex/Em=780/820) có bƣớc sóng dài hạn chế tối đa ảnh hƣởng của chất gây nhiêũ và tín hiêụ huỳnh quang nền [57]. Bên caṇh các cơ chất đƣơc̣ sƣ̉ duṇg (cơ chất cải biến hoăc̣ huỳnh quang ) môṭ số cơ chất dƣạ trên các nguyên lý khác cũng đa ̃đƣơc̣ thiết kế và tổng hơp̣ . Wang và tâp̣ thể [73] đa ̃thiết kế cơ chất FFSQNYPIVQ dƣạ vào trình tƣ ̣ p17/p24 của protein gag nhƣng có bổ sung thêm 2 gốc Phe tại đầu N và có gắn các biomarker (M113F)7 đóng vai trò là yếu tố cảm ứng lỗ nano . Cơ chất có đô ̣nhaỵ cao và có khả năng phát hiêṇ hoaṭ tính của protease HIV-1 ở nồng độ thấp từ pM. Tuy nhiên, sƣ̉ duṇg các biomarker đa ̃bi ̣ giới hạn do thời điểm xác định phụ thuộc vào bản chất của cộng hƣởng Plasmon bề mặt (surface Plasmon resonance) hoăc̣ vi cân tinh thể thac̣h anh của thiết bi ̣ và dê ̃xảy ra hiêṇ tƣợng dƣơng tính giả . Hầu hết các cơ chất của protease HIV -1 thƣờng đƣơc̣ thiết kế bắt chƣớc các trình tƣ ̣cắt đăc̣ hiêụ của enzyme trong cấu trúc HIV -1. Tuy nhiên, môṭ số cơ chất lại đƣơc̣ thiết kế dƣạ trên trình tự của các pept ide của thƣc̣ khuẩn thể nên có ái lƣc̣ cao với protease HIV -1 [37]. Cơ chất thƣờng là daṇg cảm ứng và cũng dựa trên nguyên tắc FRET . Cụ thể, cơ chất gồm 2 đoaṇ peptide ngắn , peptide 1 (Reporter) gắn chất phát quang có trình tƣ ̣W SRVGYW-AF647, peptide 2 18 có gắn chất hóa học dập tắt (Quencher) có trình tự LLEYSL -BHQ-3. Khi có măṭ của protease HIV-1, cả 2 peptide đều tƣơng tác và taọ phƣ́c hơp̣ với enzyme làm tín hiêụ huỳnh quang giảm . Phƣơng pháp có đô ̣đăc̣ hiêụ và đô ̣nhaỵ cao , giảm tỷ lệ dƣơng tính giả và âm tính giả , tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1. 1.4. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRI ̣HIV/AIDS 1.4.1. Các chất ƣ́c chế protease HIV-1 Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS [13]. Những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc của protease HIV-1 ở dạng dimer và tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất là cơ sở để thiết kế các chất ức chế protease một cách chính xác [19]. Nhìn chung, các chất tổng hợp hoá học đã đƣợc thiết kế ức chế đặc hiệu protease HIV-1, thuộc hai nhóm chính: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các chất ức chế không phải peptide [75]. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng đƣợc thiết kế giống với dạng trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease xúc tác. Cấu hình này giúp cho chất ức chế gắn chặt vào trung tâm hoạt động của protease. Trong khi đó, nhóm chất ức chế không phải peptide lại gắn với phân tử H2O trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn đƣợc với các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình. Do đƣợc thiết kế, các PI tổng hợp hoá học này thƣờng có tính đặc hiệu cao nhƣng nhƣợc điểm là gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả năng kháng thuốc cao. Vì vậy, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống HIV/AIDS là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thƣờng khá phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm và không thân thiện với con ngƣời. Chính vì vậy, bên cạnh các chất tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1. 19 Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã đƣợc sử dụng để chống nhiễm trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng nhƣ có hoạt tính kháng HIV-1 và protease HIV-1 [55]. Ueba và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch chiết thực vật lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều nhất là dịch chiết methanol của cây xà cừ Tây Ấn. 36 dịch chiết trong chloroform, methanol và nƣớc của một số thực vật ở Thái Lan đã đƣợc sử dụng để sàng lọc hoạt tính ức chế protease HIV-1. Kết quả cho thấy, các dịch chiết chloroform và MeOH từ thân, rễ của cây Ngãi bún (Boesenbergia pandurata) thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất chống lại protease HIV-1 [71]. Ở trong nƣớc, Nguyễn Văn Dũng và tập thể (2015) [2] đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức chế của 136 dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của hạt Bơ , lá Gối hạc, cây Ma hoàng, lá Ổi và lá Thạch châu ức chế mạnh hoạt tính của pepsin . Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã đƣợc phân tách và tinh sạch. Các hợp chất tự nhiên có khả năng chống HIV đã đƣợc mô tả thành từng nhóm dựa trên tính chất hóa học nhƣ các flavonoid có hoaṭ tính chống oxi hóa có khả năng chống HIV - 1 [16, 63], các ligin [65]; các hợp chất phenol có khả năng chống v irus hiêụ quả thƣờng ngăn chăṇ và làm giảm hấp thu ̣của virus lên màng tế bào chủ thông qua liên kết với các protein của virus hoăc̣ bề măṭ của tế bào chủ [63]; đăc̣ biêṭ, các triterpen và dẫn xuất của chúng đã đƣợc nghiên cứu nhiều và có tiềm năng ức chế mạnh protease HIV-1 [1]. Cụ thể, acid ursolic, acid maslinic và một số triterpen khác đã đƣợc phân lập từ nhiều nguồn thực vật khác nhau [1, 2, 30], trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 mạnh nhất. Các nghiên cứu cũng chỉ ra vai trò quan trọng của nhóm carboxyl tại mạch bên C-3 và C-17 trong cấu trúc vòng của triterpen đã tƣơng tác với các gốc amino acid của protease qua liên kết hydrogen và tƣơng tác tĩnh điện, qua đó ức chế hoạt động của enzyme [30]. Cụ thể nhƣ, acid oleanoic phân lập từ dịch chiết methanol của gỗ cây Văn quan (Xanthoceras sorbifolia) ức chế HIV-1 trong các tế bào H9 với IC50 là 1,7 µg/ml. Tuy nhiên, este hóa nhóm carboxyl ở vị trí C-3 đã tạo ra acid 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic có khả 20 năng ức chế các tế bào H9 đã tăng lên đáng kể với IC50 là 0,0039 µg/ml và ức chế protease HIV-1 với IC50 là 10 mg/ml [63]. Không chỉ có ở thực vật, nhiều triterpen phân lập từ nấm Việt Nam và Trung Quốc cũng cho thấy hoạt tính ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 dao động từ 20 đến hơn 200 µM [31]. Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt chất này cũng sẽ là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tƣơng tự nhƣng đƣợc cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1. Một trong các ví dụ tiêu biểu phải kể đến là bevirimat (DSB, PA-457) hay acid 2,2-dimethyl succinic dẫn xuất của acid betulinic, đƣợc tạo ra trên cơ sở biến đổi cấu trúc của acid betulinic - acid đƣợc phân lập đầu tiên từ cây Trâm (Syzygium claviforum) - một loại thảo dƣợc của Trung Quốc với hoạt tính ức chế HIV cùng các triterpen khác. Bevirimat không nhƣ các chất ức chế protease HIV-1 khác, nó hoạt động bằng cách gắn vào protein gag tiền thân và ức chế quá trình phân cắt gag tạo các protein cấu trúc cần thiết cho HIV-1 hoàn chỉnh. Bevirimat đang đƣợc xem là một chất ức chế protease HIV-1 mới và chống AIDS khá tiềm năng vì nó ức chế quá trình sao chép của cả HIV-1 và HIV-1 kháng thuốc ức chế reverse transcriptase và protease. 1.4.2. Ứng dụng chất ƣ́c chế protease HIV-1 trong điều tri ̣ HIV/AIDS Những nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, thành phần và chức năng của các protease HIV-1 là cơ sở tạo ra các PI đầu tiên vào những năm đầu thập kỷ 90. Thiết kế chất ức chế dựa trên các nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế thuỷ phân cơ chất của protease HIV-1 là ứng dụng lớn nhất của protease giúp kéo dài cuộc sống của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những chất ức chế này đã đƣợc cải biến bằng nhiều cách để ăn khớp chính xác vào trung tâm hoạt động của protease HIV-1 [39]. Cho đến nay, đa ̃có 10 thuốc PI đƣợc FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, bao gồm: Lopnavir (LPV), Atazanavir (ATV), Darunavir (DRV), Fosamprenavir (FPV), Tipravir (TPV), Amprenavir (APV), Indinavir (IDV), Nelfinavir (NFV), Saquinavir (SQV) và Ritonavir. (RTV) [77]. Để đánh giá mức độ 21 mạnh yếu của các chất ức chế các nhóm nghiên cứu trƣớc thƣờng sử dụng giá trị IC50, IC90 và IC95 (nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50%, 90% và 95% hoạt tính của enzyme bị ƣ́c chế ). Để phát triển các chấ t ƣ́c chế thành thuốc , ngoài việc thử nghiêṃ trong điều kiêṇ in vitro thì các chất ức chế đƣợc thử nghiệm lâm sàng , thông qua phát hiêṇ các thông số dƣơc̣ đôṇg hoc̣ , bƣớc đầu thiết lâp̣ hoaṭ tính chống virus trong điều kiêṇ in vivo, bằng cách xác điṇh số bản sao của RNA HIV trong huyết tƣơng để đánh giá hiêụ quả hoaṭ tính của chất ƣ́c chế . Các thuốc PI cho điều trị HIV/AIDS thƣờng đƣợc sử dụng theo đƣờng uống hoặc tiêm, trong đó, Indinavir, đƣợc phát triển bởi Merck & Co., là chất ức chế protease HIV thứ ba đƣợc cấp phép. Đây là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ 0,6 nM. Indinavir đƣợc tăng cƣờng độ hòa tan và hoạt tính sinh học theo đƣờng uống rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50-100 nM [24]. Mặc dù vậy, có một số vấn đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5-25% số bệnh nhân. Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và nhiều bệnh nhân bị tăng bilirubin không triệu chứng. Các thuốc PI khác cũng có hiệu lực kháng HIV cao và đặc hiệu, tuy nhiên tác dụng phụ và kháng thuốc vẫn là vấn đề lớn đối với điều trị bệnh nhân HIV/AIDS bằng PI nói riêng cũng nhƣ liệu pháp ARV (liệu pháp dùng thuốc kháng HIV) nói chung hiện nay. Chính vì vậy, các PI mới hiệu quả hơn cũng nhƣ các PI có nguồn gốc tự nhiên thân thiện với con ngƣời vẫn đang đƣợc sàng lọc và tìm kiếm. Tuy nhiên, cho đến nay, chƣa một liệu pháp sử dụng các hợp chất tự nhiên nào đƣợc công nhận bởi các chuyên gia y tế cho phòng ngừa hoặc điều trị HIV/AIDS. Các sản phẩm tự nhiên hoặc thảo mộc chủ yếu đƣợc sử dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS nhằm hỗ trợ giúp ngƣời bệnh tăng cƣờng khả năng miễn dịch, nâng cao chất lƣợng cuộc sống hoặc đối phó với các tác dụng phụ do điều trị bằng liệu pháp ART gây ra. Dù vậy, các nghiên cứu về biến đổi cấu trúc triterpen đã dẫn đến tạo ra bevirimat và hiện nay, nhiều dẫn xuất triterpen khác hứa hẹn kháng virus vẫn đang đƣợc nghiên cứu bởi các nhà khoa học. Nhƣ vậy, tiềm năng có đƣợc một dẫn xuất mới cho thử nghiệm lâm sàng kháng HIV là tƣơng đối cao [31]. 22 Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc , vị thuốc của Viêṭ Nam sẽ là nguồn nguyên liệu phong phú cho viêc̣ sàng lọc và phát hiêṇ ra các hoạt chất ức chế protease HIV -1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. 23 Chƣơng 2. NGUYÊN LIÊỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. NGUYÊN LIÊỤ - Enzyme protease HIV-1 tái tổ hợp là sản phẩm của đề tài mã số ĐT- PTNTĐ. 2012-G/02 [52]. - Cơ chất peptide cải biến mã số L6525 (Lys-Ala-Arg-Val-Nle-NPh-Glu- Ala-Nle-NH2) của hãng Sigma Aldrich (Mỹ) - Cơ chất Peptide cải biến và cơ chất huỳnh quang Peptide HF đƣợc tổng hợp và tinh sạch bởi hãng Gencript (Mỹ) và Anaspec (Mỹ), 20 hơp̣ chất thực vật thƣ́ sinh đƣơc̣ cung cấp bởi Viêṇ Dƣợc liệu Trung ƣơng. - Các hoá chất khác đều đƣợc mua từ các hãng uy tín và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu. 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: Máy ổn nhiệt khô Multi Block® Heater (Lab-Line Instruments), máy quang phổ khả kiến DU 800 (Beckman coulter), quang phổ kế huỳnh quang Nanodrop 3300 (Thermo Scientific) và nhiều máy móc thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.3.1. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 sƣ̉ duṇg cơ chất pep tide cải biến trên máy quang phổ khả kiến [60] Nguyên tắc: Cơ chất Peptide cải biến chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dƣới dạng cải biến Nle và Nph có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 300 nm (A300). Dƣới tác dụng thủy phân của protease HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS DU800 (Beckman Coulter). Tiến hành: Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) đƣợc ủ trƣớc ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau theo tỷ lệ đƣợc trình bày ở Bảng 3. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, tiến hành đo trên hệ thống máy quang phổ khả kiến DU800 của hãng Beckman Coulter tại bƣớc sóng A300 trong 5 phút ở 37 o C. Môṭ đơn vi ̣ hoaṭ đô ̣ protease HIV -1 là lƣợng enzyme chuyển hóa một micromole cơ chất thành sản phẩm trong 1 phút ở điều kiện phân tích. 24 Hoạt độ của protease HIV-1 đƣơc̣ tính nhƣ sau: HĐ = A300 0 −A300 (5) 5 *Ccơ chất*300 (µmol/phút) Trong đó: HĐ: hoạt độ của protease HIV-1 A300(0): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm ở thời gian t=0 phút A300 (5): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm taị thời gian t=5 phút Ccơ chất : Nồng đô ̣cơ chất (µM) 300 : Thể tích của phản ƣ́ng xác điṇh hoaṭ đô ̣(µl) Bảng 3: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣protease HIV-1 sƣ̉ duṇg cơ chất Peptide đặc hiệu cải biến Thành phần Thể tích (μl) H2O khử ion, khử trùng 128 Đêṃ 2X (Na-acetate 200 mM, pH 4,7, EDTA 8 mM, -ME 10 mM, NaCl 1,8 M, CaCl2 2 mM) 150 Cơ chất (1mg/ml) 20 Protease HIV-1 (150 ng/l) 2 Tổng thể tích 300 Đối với các phản ứng xác định tác dụng ức chế của các chất lên hoạt đô ̣của protease HIV-1: Chất nghiên cứu đƣợc hoà tan trong dung môi thích hợp (thƣờng là DMSO) và ủ trƣớc 2 phút với protease HIV -1, sau đó đệm và cơ chất mới đƣợc bổ sung để bắt đầu phản ứng xác định hoạt đô ̣còn lại của enzyme . Thể tích các chất nghiên cứu bổ sung luôn là 1 µl ở các nồng độ thích hợp vào tổng thể tích của phản ứng 300 µl để đạt nồng độ cuối cùng của chất nghiên cứu nhƣ mong muốn. Theo đó, nồng độ DMSO 100% để hoà tan các chất nghiên cứu đã bị pha loãng 300 lần nên không ảnh hƣởng đến hoạt tính của protease HIV-1. Hoạt độ của protease HIV- 1 đƣợc xem là 100% (mâũ không có chất ƣ́ c chế) trong trƣờng hợp 1 µl chất nghiên 25 cứu thay bằng 1 µl DMSO. Mƣ́c đô ̣ƣ́c chế (%) protease HIV-1 đƣơc̣ tính dƣạ trên hoạt độ enzyme còn lại khi có mặt chất ức chế so với hoạt độ enzyme của mẫu kiểm tra không có chất ƣ́c chế (đƣơc̣ xem là 100%). 2.3.2. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 bằng cơ chất huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang [33] Nguyên tắc: Cơ chất của protease HIV-1 là một chuỗi peptide tổng hợp có vị trí cắt đặc hiệu của enzyme. Một đầu peptide có gắn chất phát huỳnh quang HiLyte Fluor488 còn đầu kia là chất thu tín hiệu huỳnh quang QXL 520. Trong điều kiện bình thƣờng , HiLyte Fluor 488 và QXL 520 ở tƣơng đối gần nhau (thƣờng 10- 100Å) nên khi có ánh sáng kích thích (excitation) tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc QXL 520 thu lại. Dƣới tác dụng của hoạt tính protease HIV-1, liên kết đặc hiệu bị thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc máy quang phổ thu lại (Hình 5). Kết quả sẽ cho tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo thời gian. Hình 5: Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Peptide HF Tiến hành: Cơ chất HF của protease HIV -1 có trình tự QXL 520-GABA- SFNFPQITK-HiLyte Flour 488-NH2 đƣợc hoà tan ở nồng đô ̣ 0,5 mg/ml (tƣơng ứng 235 µM) trong Dimethyl sulfoxide (DMSO). Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) (Bảng 4) đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau . Protease HIV-1 đƣợc bổ sung, trộn đều và đo giá tri ̣ Ex /Em (excitation/emission) ở bƣớc sóng tƣơng ƣ́ng 488 nm/520 nm (bằng máy quang phổ huỳnh quang ND 3000, Thermo 26 scientific) trong 5 phút ở 37oC. Mỗi phản ứng đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Bảng 4: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣protease HIV-1 sƣ̉ duṇg cơ chất đặc hiệu huỳnh quang Peptide HF Thành phần Thể tích (μl) dd H2O khử ion, khử trùng 12 Đêṃ 2X (CH3COONa 200 mM; NaCl 2 M; EDTA 2 mM; DTT 2 mM; DMSO 10%; BSA 1 mg/mL) 15 Cơ chất 0,1 mg/mL 2,0 Protease HIV-1 100 ng/L 1,0 Tổng thể tích 30 2.3.3. Xác điṇh các hằng số đôṇg hoc̣ của protease HIV-1 Km hằng số Michaelis - Menten, phản ánh ái lực của enzyme và cơ chất , khi Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn , và hiệu quả phản ứng do enzyme xúc tác càng cao và ngƣợc lại. Trị số kcat là số phân tử cơ chất có thể đƣợc chuyển hóa thành sản phẩm bởi 1 phân tử enzyme trong 1 đơn vị thời gian. Tỷ lệ Kcat/Km là hiệu năng xúc tác của enzyme, cũng đƣợc dùng để so sánh tính đặc hiệu của enzyme với các cơ chất khác nhau. Trong nghiên cứu này, các hằng số động học đƣợc tính theo hai phƣơng pháp: Theo phƣơng trình Michaelis – Menten: Trong đó: V0: Vận tốc ban đầu của phản ứng Vmax: Vận tốc phản ứng cực đại Km: Hằng số Michaelis – Menten [S]: Nồng độ cơ chất 27 Theo phƣơng trình Lineweaver - Burk: Theo đó, phƣơng trình Lineweaver – Burk có dạng đƣờng thẳng tuyến tính y = ax + b, cắt trục tung ở điểm 1/Vmax và cắt trục hoành tại điểm -1/Km, qua đó dễ dàng xác định đƣợc các giá trị Km, Vmax. Phƣơng trình Lineweaver – Burk vẫn đƣợc dùng phổ biến hiện nay vì có thể nhận đƣợc các dẫn liệu thực nghiệm tốt với nhiều nồng độ cơ chất khác nhau, cho kết quả chính xác và tin cậy. 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA CƠ CHẤT PEPTIDE CHO XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1 Hiện nay, một số cơ chất đặc hiệu cho xác định hoạt tính của protease HIV-1 với trình tự amino acid khá đa dạng, đƣợc gắn với các nhóm chất hoá học khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và thƣơng mại hoá. Trong đó, cơ chất Peptide cải biến tại vị trí P1-P1' tạo liên kết có khả năng hấp thụ cực đại trong vùng tử ngoại; hoạt độ của protease HIV-1 đƣợc đánh giá dựa trên sự giảm độ hấp thụ của cơ chất theo thời gian trên máy quang phổ thông thƣờng có thể phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm. Dựa trên nguyên tắc này, chúng tôi tiến hành thiết kế cơ chất đặc hiệu cho protease HIV-1, sử dụng cho các phản ứng xác định hoạt tính và sàng lọc chất ức chế của enzyme. 3.1.1. Trình tự amino acid của cơ chất protease HIV-1 Cơ chất peptide cải biến thƣờng có trình tƣ ̣gồm 7 amino acid với các gốc tƣ̀ P4-P3’ [18], trong đó, P1 luôn là Leu hoặc Nle và P1' là Nph để tạo liên kết hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng tử ngoại. Cơ chất này thƣờng đƣợc thiết kế tại vị trí p24/p2 trên polyprotein gag với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Ala-Glu-Ala-NH2 (* là vị trí cắt của protease HIV-1), Leu thƣờng đƣợc biến đổi thành Nle, Ala biến đổi thành Nph [60]. Cụ thể, Nle không có mạch bên R phân nhánh; Nph có chƣ́a nhóm NO2 là nhóm hút điêṇ tƣ̉ làm cho liên kết CO*NH giữa CO của Nle và NH của N ph; trở nên lỏng lẻo hơn so với CO*NH của Leu và Nph, giúp tăng hiệu quả phân cắt cơ chất bởi enzyme. Bên cạnh đó, Nph có khả năng hấp thụ cực đại ánh sáng tại bƣớc sóng 300 nm giúp xác định đƣợc hoạt tính của protease trên cơ sở giảm độ hấp thụ ánh sáng của cơ chất. Tuy nhiên, trên chuỗi polyprotein gag-pol tiền thân, vị trí P6pol-PR đƣợc phân cắt đầu tiên để giải phóng protease HIV-1 có hoạt tính cho các bƣớc thuỷ phân tại gag-pol và gag tiếp theo tạo các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho HIV-1 [22]. Mặt khác, theo Kausslich và tập thể cơ chất dựa trên trình tự cắt tại P6pol-PR trên polyprotein gag-pol lại hiệu quả nhất [41]. Nghiên cứu của Perez và tập thể 29 [59] còn cho thấy một số cơ chất mang trình tự khác trên gag , gag-pol không bị protease HIV-1 cắt theo lý thuyết và không đƣợc dùng làm cơ chất nhƣng thực tế thí nghiệm lại có ái lực cao với trung tâm hoạt động của protease HIV-1 hơn cơ chất. Nghiên cứu cũng cho thấy, kích thƣớc, trình tự và đặc tính các amino acid đều ảnh hƣởng đến cấu hình và ái lực của cơ chất với trung tâm hoạt động của protease HIV-1. Do đó, có thể các trình tự phân cắt trên gag-pol tạo ra các enzyme (protease, reverse transcriptase và integrase) có ái lực hơn so với các vị trí khác trên gag. Trong nghiên cứu này, với tiêu chí thiết kế cơ chất có ái lực và hiệu quả cắt cao bởi protease HIV-1, vị trí cắt tại RT -IN của gag -pol với trình tự Arg-Lys-Ile- Leu*Phe-Leu-Asp trên gag-pol đƣợc chúng tôi lựa chọn để thiết kế cơ chất peptide cải biến. Trong đó, tại P1*P1' là Leu*Phe đƣơc̣ biến đổi thành Nle*Nph làm cho liên kết không bị thay đổi nhiều so với cấu trúc tự nhiên. Ngoài ra, bổ sung Gly- Nle-NH2 vào đầu C sẽ giúp cơ chất ổn định hơn (giá trị Km thấp và Kcat cao) [60]. Vì vậy, cơ chất Peptide cải biến của protease HIV-1 đƣợc thiết kế với trình tự: Ac-Arg- Lys-Ile-Nle*Nph-Leu-Asp-Gly-Nle-NH2 (ký hiệu Peptide CH). Cơ chất đƣợc đăṭ tổng hợp bởi Genscript (Mỹ) với độ tinh sạch trên 95%. 3.1.2. Xác định một số đặc tính của cơ chất Peptide CH 3.1.2.1. Xác định nồng độ enzyme thích hơp̣ cho phản ứng xác định hoạt đô ̣của protease HIV-1 Trong phản ƣ́ng xác điṇh hoaṭ đô ̣của bất kỳ enzyme nào , nồng đô ̣ enzyme phải phù hợp để có sự biến đổi tuyến tính giữa mức độ chuyển hóa cơ chất theo thời gian phản ƣ́ng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ enzyme protease HIV-1 phù hợp trong phản ứng thuỷ phân cơ chất Peptide CH. Kết quả thƣc̣ nghiêṃ cho thấy nồng đô ̣protease HIV -1 134 nM tƣơng đƣơng với 1 g trong thể tích phản ƣ́ng là 300 µl là thích hơp̣ nhất đối với phản ƣ́ng thủ y phân cơ chất CH (Hình 6). Theo các nghiên cƣ́u trƣớc đây , nồng đô ̣protease HIV-1 phù hợp dao đôṇg trong khoảng 8-70 nM [6, 10] hoăc̣ 50-200 nM [34, 70], tùy thuộc vào kiểu cơ chất và bản chất của phƣơng pháp xác điṇh hoaṭ đô ̣ . Ngoài ra, kết quả Hình 6 cho 30 thấy, phản ứng thuỷ phân Peptide CH của protease HIV-1 trong 5 phút sẽ đảm bảo mức độ tuyến tính của tốc độ với thời gian phản ứng nên đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 6: Ảnh hƣởng nồng đô ̣protease HIV-1 đến tốc độ phản ứng sử dụng cơ chất Peptide CH 3.1.2.2. Xác định nồng độ thích hợp của cơ chất Peptide CH Với nồng độ protease HIV-1 134 nM, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với dải nồng độ Peptide CH từ 50-350 µM. Kết quả thu đƣơc̣ (Hình 7) cho thấy nồng độ từ 50-60 µM vẫn đảm bảo mức độ tuyến tính của tốc độ hình thành sản phẩm; điều này chứng tỏ đây là nồng độ thích hợp cho phản ứng xác định hoạt tính của protease HIV-1 sử dụng cơ chất Peptide CH. 0.26 0.27 0.28 0.29 0.3 0 1 2 3 4 5 A ­ 3 0 0 Thời gian (phút) 40,2 nM 67 nM 134 nM 201 nM 227,8 nM 268 nM 335 nM 31 Hình 7: Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Peptide CH đến phản ƣ́ng thủy phân bởi protease HIV-1 Trên cơ sở sƣ̉ duṇg cơ chất Peptide CH để xác định tốc