Luận văn Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

h chiết. Real-time PCR có thể là một trang thiết bị hữu hiệu trong những phòng thí nghiệm trọng điểm phục vụ cho công tác chẩn đoán và kiểm soát tình hình bệnh nhân mắc bệnh lao. Ngoài ra, trên thế giới một số các xét nghiệm phát hiện M. tuberculosis đã được thương mại hóa. Chẳng hạn như, Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD) được phát triển bởi Gen-Probe, có ưu điểm là phát hiện rRNA, rRNA theo lý thuyết là tồn tại nhiều hơn hàng nghìn lần so với DNA trong hệ gen của vi sinh vật, do đó độ nhạy cao hơn. Thực chất nó là một hệ thống khuyếch đại gián tiếp vùng đặc hiệu của RNA ribosome 16S thông qua sự sao chép của vùng gen đó ở một điểm đẳng nhiệt 42oC [10, 12, 16]. Tuy nhiên sản phẩm khuếch đại là RNA dễ bị phân huỷ hơn so với DNA. 1.3.6. Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán Ở Việt Nam hiện nay phương pháp để phát hiện lao chủ yếu vẫn là nhuộm Ziehl - Neelsen và nuôi cấy trên môi trường Lowenstein. Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trong chẩn đoán lao, các cơ sở này mới chỉ sử dụng các kít chẩn đoán của công ty Nam Khoa nhằm vào nhân đoạn IS 6110 là một trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao. Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR như tác giả Trần Thị Thanh Hoa và cộng sự (2005) đã sử dụng kết hợp phương pháp hoá sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của vi khuẩn lao [7]. Tác giả Phan Thị Thu Hương và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường bệnh viện lao [9]. Các tác giả Đặng Đức Anh (2001) và Nguyễn Văn Hưng (2001) nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao và khả năng đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao [1, 8]. Đã có nhiều tác giả trong nước tiến hành nghiên cứu về multiplex PCR như tác giả Phạm Hùng Vân (2006) và (2007), các nghiên cứu này tập trung vào các mầm bệnhkhác không phải vi khuẩn lao [17]. Năm 2007 tại Học Viện Quân Y các tác giả Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các quy trình multiplex PCR khuyếch đại nhiều gen đích đặc trưng cho vi khuẩn lao vào chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao. Với nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành hoàn thiện quy trình PCR cho hai gen đích mới là IS 1081 và 23S rDNA dùng để chẩn đoán lao, và tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quy trình multiplex PCR đồng thời cho cả 3 gen đích IS1081, IS6110 và 23S rDNA trong nâng cao hiệu quả chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao [13, 14]. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao Các chủng vi khuẩn gây bệnh lao (M. tuberculosis complex) được thu thập từ các bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh Viện Đa Khoa TW Huế, Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW. Các chủng vi khuẩn ngoài lao (Mycobacterium other than tuberculosis – MOTT) được thu thập từ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch gồm M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. Kansasii. Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết DNA và sử dụng làm panel mẫu đối chứng. 2.1.2. Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thập từ các bệnh nhân lao và nghi lao tại Bệnh viện 103. Mẫu bệnh phẩm chủ yếu là dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, đàm, dịch khớp, dịch màng tim, dịch màng bụng, nước tiểu, dịch não tủy. Các mẫu này được xử lý và tách chiết thu DNA làm mẫu chẩn đoán. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y. Các hóa chất và thiết bị Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính Tên hóa chất Hãng sản xuất 1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA PBS Rectopur(CE- EMB) Tris – Base Applied BioSiciences (Mỹ) Protease K Sigma (Mỹ) Lyzozyme Fermentas Các dung môi hữu cơ Gibco BRL Life technology Ethanol Wako (Japan) Natri acetat Wako (Japan) Phenol/Chloroform/Isomyl Wako (Japan) 2. Hóa chất trong mPCR Dream Taq polymerase Fermentas Primers Bioneer MgCl2 Fermentas Dream Taq Fermentas DNTPs Fermentas 3. Hóa chất trong điện di và soi gel Fermentas Agarose Fermentas Thang chuẩn DNA Fermentas Loading Dye Fermentas Red safe Sigma (Mỹ) Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính Tên thiết bị Hãng sản xuất Máy PCR iCyler (Gradient nhiệt) Bio-Rad Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700) Appiled BioSystems Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Heraeus Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thomas Scientific Máy làm khô chân không Eppendorf Máy chụp ảnh Gel – Doc Dolphin Tủ lạnh 0oC, 4oC, -20oC; -80oC Nuaire Lò vi song Sanyo Cân điện tử (Electronic balances) Adam Pippetman Gilson, Haminlton, Bio-Rad Vortex OSI Rotolab Bể ổn nhiệt Memmert Khối ổn nhiệt có lắc Eppendorf Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument Bộ điện di DNA Labnet Tủ cấy an toàn sinh học Nuaire Tủ ấm Shelab 2.2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR Các mồi đặc hiệu để phát hiện trực khuẩn lao được sử dụng cho phản ứng multiplex PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự và độ dài như sau: Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dung trong nghiên cứu Gen đích Mồi Trình tự Sản phẩm (bp) 23S rDNA 23S-F 5’ ACC TGA AAC CGT GTG CCT AC 3’ 206 23S-R 5’ GGT CCA GAA CAC GCC ACT AT 3’ IS1081 IS1081-F 5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’ 300 IS1081-R 5’ CGC AGC TTG GGG ATC GCG AC 3’ IS6110 IS6110-F 5’ GGT CGC CCG TCT ACT TGG TG 3’ 416 IS6110-R 5’ TGG ACG CGG CTG ATG TGC TC 3’ Dựa trên trình tự các gen quan tâm (IS6110, IS1081, 23S rDNA) đã công bố trên ngân hàng dữ liệu gen chúng tôi kết hợp sử dụng các phần mềm thiết kế primer như Primer3, DNAclub, Oligo...để tạo ra các primer thích hợp cho mục tiêu nghiên cứu và giúp loại bỏ các cặp primer không tối ưu. Các cặp mồi IS6110, IS1081 và 23S được thiết kế nhằm khuếch đại các đoạn gen đích quan tâm dựa trên trình tự gen đích của các chủng đã được công bố trên genbank như: NC_000952; CP000611.1; AM408590.1; AB244270.1; AB244268.1; AB244265.1; PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ đồ nghiên cứu Tạo mPCR với 3 gen đích Chủng vi khuẩn MTBC và MOTT Bệnh phẩm Panel DNA chủng vi khuẩn DNA bệnh phẩm Tối ưu hóa phản ứng mPCR Đánh giá độ ổn định kit mPCR Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện Sơ đồ nghiên cứu 2.3.2. Tách chiết DNA 2.3.2.1. Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn lao Vi khuẩn được thu hoạch trong nước muối sinh lý, nồng độ vi khuẩn đạt 109 vk/ml. Bước 1: Votex kĩ dịch nuôi vi khuẩn lao, lấy 200 µl vào tube eppendorf, bất hoạt ở 80oC trong 20 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng [33, 35, 44]. Bước 2: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút, thu cặn lắng chứa khuẩn lạc, bỏ nước nổi. Bước 3: Thêm 500µl lysis buffer và 12µl lysozyme 25mg/ml (nồng độ cuối cùng đạt 500µg/ml), vortex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút. Bước 4: Thêm 3 µl proteinase K (nồng độ cuối 100µg/ml), lắc kỹ bằng pipetting. Bước 5: Ủ 56oC trong bể ổn nhiệt có lắc 900rpm trong 3h (hoặc qua đêm). Bước 6: Thêm 550µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis bufer), vortex kỹ. Bước 7: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút. Bước 8: Chuẩn bị trước 1 tube eppendorf có chứa 1300 µl Ethanol 100% + 50µl NaAC 3M, (trường hợp cồn 95% cần 2 tube loại 2ml, mỗi tube chứa 775µ cồn 95% +25µl NaAC 3M) trộn đều, đặt trong khay nước đá (nồng độ cuối cùng của cồn ít nhất 70%). Bước 9: Hút lấy phần dịch nổi ở phía trên ở cuối bước 7 (tránh hút lớp ngăn cách giữa 2 pha dịch) cho vào tube chứa sẵn cồn và NaAC đã chuẩn bị ở bước 8 (trường hợp cồn 95% cần chia đều dịch nổi vào 2 tube đó), lắc đảo ngược vài lần. Bước 10: Ủ - 20oC trong 3 giờ hoặc qua đêm. Bước 11: Ly tâm 13000g/phút trong 30 phút. Bước 12: Hút nước nổi, giữ lại phần cặn (không hút kiệt để tránh mất DNA). Bước 13: Thêm 1000µl cồn 70%, lắc ngược vài lần. Bước 14: Ly tâm 13000g/phút trong 20 phút, bỏ nước nổi lấy cặn (để lại khoảng 20µl tránh mất DNA). Bước 15: Ly tâm 13000g/phút trong 15 phút, bỏ nước nổi cẩn thận bằng pipet 20µl, giữ phần cặn có DNA. Bước 16: Làm khô hoàn toàn, thêm vào 200µl nước khử ion, lắc trọn bằng tay, chia ra 02 tube (nếu đã chia 02 tube ở bước 8 thì cho vào mỗi tube 100µl nước khử ion) ghi mã số chủng kèm số (1) và số (2), đo nồng độ OD. Ủ -4o C qua đêm, sau đó bảo quản tube số (2) ở -80oC, tube số (1) dùng ngay hoặc để ở -20oC. 2.3.2.2. Tách chiết DNA từ bệnh phẩm Đối với mẫu bệnh phẩm lâm sàng cần được xử lý trước khi tách chiết. Tuy nhiên việc tách chiết DNA trực tiếp từ bệnh phẩm thường gặp khó khăn trong việc loại bỏ các tác nhân ức chế đến phản ứng PCR, nồng độ và độ tinh sạch của DNA thấp. Các tác nhân có thể ức chế sự hoạt hóa của enzyme Taq DNA polymerase làm ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Notte và cộng sự đã sử dụng chứng nội tại trong phản ứng PCR và thấy rằng Taq polymerase bị ức chế ở 1/3 số mẫu đờm. Clairridge và cộng sự khi sử dụng PCR khuếch đại gen đích IS6110 để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng đạt độ nhạy là 86,1% và có tới 7,3% số mẫu có chứa các tác nhân ức chế Taq polymerase [24]. Forbers và cộng sự khi không sàng lọc tác nhân ức chế của phản ứng thu được độ đặc hiệu 87,2% [32]. Do vậy vấn đề loại bỏ các tác nhân ức chế phản ứng PCR từ khâu tách chiết rất quan trọng nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán. Bước 1: Bệnh phẩm cho vào ống facol sạch, đánh số kí hiệu, ly tâm 6000v/p trong 30 phút (nếu bệnh phẩm là đàm cho 5ml tan đàm lắc trộn và để yên khoảng 20 phút cho tan hết đàm rồi mới ly tâm) [34, 42, 47]. Bước 2: Đổ bỏ nước nổi, giữ lại cặn. Thêm 5ml PBS 1X trộn đều, ly tâm tiếp 6000v/p trong 30 phút. Bước 3: Đổ bỏ nước nổi, giữ cặn, bổ sung 1000 µl lysis buffer + 40 µl lyzozyme trộn đều, để ở tủ tạnh thường 30 phút. Bước 4: Thêm 25 µl proteinase K lắc đều, ủ ở tủ ấm 56oC có lắc trong ít nhất 2h hoặc qua đêm. Bước 5: Chia làm 2 tube eppendorf 1,5ml, thêm vào mỗi tube 550 µl Phenol/ Isoamyl/ Alcohol, vortex kĩ. Bước 6: Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Bước 7: Chuẩn bị sẵn 2 tube mới có đánh số tương ứng, chứa 1000 µl Ethanol 100% + 100 µl CH3COONa 3M, để trong khay đá. Bước 8: Cẩn thận hút dịch nổi từ ống eppendorf vừa ly tâm sang ống mới vừa chuẩn bị ở trên, trộn đều. Ủ ở -20oC trong ít nhất 3h hoặc qua đêm. Bước 9: Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn. Bước 10: Thêm 1000 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Bước 11: Hút bỏ dịch nổi cẩn thận, giữ lại phần cặn. Bước 12: Làm khô cặn trong Vacuumdry 2-3 phút. Bước 13: Hoà cặn DNA trong 100µl nước khử ion/tube. Bước 14: Bảo quản ở 4oC qua đêm, sau đó cất vào tủ -80oC nếu chưa dùng ngay. 2.3.3. Kĩ thuật PCR và multiplex PCR Nguyên lý: Phản ứng PCR là một chuỗi chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước. Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation) Phân tử DNA khuôn được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử (95oC) trong vòng 30 giây đến 90 giây. Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Anealing) Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép mồi bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 50 đến 70oC tùy thuộc Tm của mồi sử dụng và thời gian kéo dài từ 30 giây đến 90 giây. Đối với phản ứng multiplex PCR cần sử dụng phương pháp gradient nhiệt để tìm nhiệt độ tối ưu cho từng loại mồi. Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (Extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và đặc tính của DNA polymerase . Kĩ thuật multiplex PCR cũng dựa trên nguyên lý tương tự nhưng cho phép khuếch đại 2 hay nhiều gen đích cùng một lúc trong cùng một ống nghiệm bằng cách sử dụng đồng thời các cặp mồi khác nhau. Phương pháp này tiết kiệm thời gian và hóa chất trong chẩn đoán lao nhưng qui trình tối ưu rất khó khăn. Các gen đích trong cùng một ống phản ứng không khác nhau nhiều về kích thước, nhiệt độ gắn mồi không quá xa nhau. Ngoài ra các gen đích được khuếch đại cùng một lúc phải có kích thước đủ xa nhau để có thể phân biệt trên bản gel sau khi chụp. Thành phần chính của phản ứng: - Nước khử ion: - Taq Buffer - Hỗn hợp mồi - d NTPs - Taq polymerase - Chất phụ gia - DNA template Các thành phần của phản ứng ở các mẫu đều giống nhau chúng chỉ khác khác nhau về DNA template. Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di trên gel Agarose 1,2% để phân tích kích thước các gen đích cần nghiên cứu. 2.3.4. Kỹ thuật điện di Điện di DNA là một phương pháp rất quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được DNA bằng mắt thường. Chúng tôi sử dụng gel Agarose để điện di DNA. Sản phẩm DNA sau khi khuyếch đại bằng PCR được điện di trên gel Agarose đặt trong một bể dung dịch đệm là TBE 0,5X. DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ agarose trong gel, điện thế, nồng độ thành phần chất điện di. Các đoạn DNA sẽ tạo thành các băng có kích thước khác nhau. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel agarose 1,2% với mục đích xác định kích thước các băng khi được điện di cùng thang DNA chuẩn. Chuẩn bị gel agarose : + Pha agarose theo tỉ lệ 1,2% với dung dịch TBE 0,5X trong bình thủy tinh chịu nhiệt. + Đun thạch tan hoàn toàn. + Để nguội đến 70oC, bổ sung Red safe (chất có khả năng gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA) với tỷ lệ 2 µl/100 ml agarose đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược. + Sau khi gel đã đông rút răng lược ra, đặt gel nằm ngang trong bể điện di có dung dịch đệm TBE 0,5X. + Điện di theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110V, cường độ từ 60 – 80 mA trong khoảng 45 phút. + Quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin – DOC [6, 14, 16]. 2.3.5. Tạo kit multiplex PCR ứng dụng trong chẩn đoán lao 2.3.5.1. Nguyên lý tạo kit multiplex PCR Việc sử dụng multiplex PCR sẽ tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA và phân tích định lượng. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu ích cho việc phát hiện trực tiếp M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng và phân biệt các mẫu âm tính giả và âm tính thật [1, 2, 4, 8, 20, 24]. Dựa vào kết quả nghiên cứu của các tác giả về việc khuyết gen IS6110 ở một số chủng lao có mặt ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện tạo kit multiplex PCR đồng thời 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Qua quá trình tham khảo từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới [48], chúng tôi tiến hành thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR. Các cặp mồi được thiết kế phải đảm bảo độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao, được kiểm tra về khả năng bắt cặp tạo dimer lẫn nhau, đồng thời các cặp mồi phải có nhiệt độ bắt cặp khá tương đồng nhau, kích thước của các sản phẩm có thể dễ dàng phân biệt trên bản điện di. Do vậy trong thiết kế mồi cần chú ý đến sự tương đồng của mồi với các trình tự gen đích về độ dài, tỷ lệ G–C và nồng độ mồi. Theo trình tự của các đoạn gen đích công bố trên genbank của M. tuberculosis H37RV, chúng tôi sử dụng các phần mềm thiết kế mồi như Primer3, DNAclub, Oligo để lựa chọn những vùng có độ bảo thủ cao nhất thích hợp cho nghiên cứu và loại bỏ các cặp mồi không tối ưu. Cặp mồi IS6110 được thiết kế từ gen IS6110 có trình tự bảo thủ rất cao đã công bố trên genbank. Cặp mồi này nhân đoạn gen đích IS6110 có kích thước 416 bp. Cặp mồi 23S rDNA được thiết kế để nhân đoạn gen đích 23S rDNA có kích thước 206 bp, theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) cho thấy gen đích này có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh [50]. Cặp mồi IS1081-F/IS1081-R được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của chủng chuẩn quốc tế nhằm khắc phục hiện tượng thiếu gen đích IS6110 ở một số chủng lao ở Ấn Độ, Đông Nam châu Á và Việt Nam. Cặp mồi này khuếch đại gen đích có kích thước 300 bp. Các cặp mồi được thiết kế đều có chiều dài 20 bp và tỷ lệ G-C khá tương đồng nên nhiệt độ bắt cặp của chúng với DNA đích không khác xa nhau, do vậy việc khuếch đại cùng lúc nhiều đoạn gen đích trong cùng một điều kiện về chu kỳ nhiệt và các thành phần của phản ứng multiplex PCR sẽ xảy ra dễ dàng hơn. Các cặp mồi nhân các đoạn gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA lần lượt có kích thước: 416 bp, 300 bp và 206 bp, kích thước của các đoạn gen này đủ để có thể phân biệt rõ ràng trên bản điện di gel agarose. Để xác định điều kiện tốt nhất cho phản ứng multiplex PCR, chúng tôi lần lượt thử các thành phần phản ứng multiplex PCR với các nồng độ khác nhau. Bao gồm dung dịch đệm (buffer PCR), nồng độ MgCl2, nồng độ mồi và nồng độ DNA khuôn. Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nồng độ biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng PCR. Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mỗi nồng độ, thành phần tham gia phản ứng và với mỗi chu trình nhiệt khác nhau, kết quả sản phẩm PCR được lựa chọn là những băng đậm nét nhất, đặc hiệu đúng kích thước mong muốn và không có sản phẩm phụ. Các thông số về nồng độ của các thành phần tham gia phản ứng sẽ được lựa chọn cho các lần tiến hành phản ứng tiếp theo tương ứng với băng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu. Quá trình tối ưu được tiến hành trên panel mẫu chuẩn dương tính là DNA tách từ các chủng Mycobacterium tuberculosis. 2.3.5.2. Tạo master mix Sau khi đã xác định được thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng mPCR chúng tôi tiến hành tạo master mix theo như thành phần đã được lựa chọn để kiểm tra đánh giá hiệu quả của kit m PCR trên các panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng. Kiểm tra và áp dụng kit multiplex PCR Kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của multiplex PCR trên panel mẫu Kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR Panel kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR được tạo ra bởi DNA của các chủng M. tuberculosis complex để đánh giá khả năng phát hiện M. tuberculosis của kit multiplex. Độ nhạy của kit multiplex PCR được đánh giá dựa vào công thức sau: Se = a / (a + b) x 100% Trong đó: a: Dương tính thật b: Âm tính giả Kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR Panel kiểm tra độ đặc hiệu được tạo ra bởi DNA tách chiết từ các chủng Mycobacterium other than tuberculosis để đánh giá khả năng phát hiện các mẫu không phải M. tuberculosis. Độ đặc hiệu của kit multiplex PCR được đánh giá dựa vào công thức sau: Sp = d / (d + c) x 100% Trong đó: c: Dương tính giả d: Âm tính Kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng mPCR trên panel chuẩn từ chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis: DNA tách chiết từ các chủng M. tuberculosis complex được pha loãng theo tỷ lệ nhất định, dải DNA sau khi pha loãng được chạy multiplex PCR để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng. 2.3.6.2. Kiểm tra hiệu quả chẩn đoán của kit multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng Chúng tôi thu thập 100 mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ các bệnh nhân lao và nghi lao ở Bệnh viện 103. Các bệnh phẩm này đã được tiến hành soi và nuôi cấy, sau đó được xử lý và tách chiết thu DNA tổng số. Tiến hành phản ứng multiplex PCR với DNA bệnh phẩm để kiểm tra khả năng áp dụng trên bệnh phẩm lâm sàng. 2.3.6.3. Kiểm tra tính ổn định của kit multiplex PCR Kit multiplex PCR sau khi tối ưu hóa nhiệt độ, thời gian và nồng độ các thành phần được mix sẵn thành các master mix cho phản ứng multiplex PCR chẩn đoán lao. Chuẩn bị 120 master mix, bảo quản ở điều kiện -20oC (các hóa chất có trong thành phần bộ kit cũng được bảo quản ở nhiệt độ này). Sau đó theo định kì hàng tháng tiến hành 10 phản ứng mPCR bằng master mix. Các kết quả này được lưu lại và so sánh từ tháng thứ nhất đến tháng hiệu suất chẩn đoán giảm để tính thời gian ổn định của bộ kit. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được thu thập, phân tích và xử lý theo các phương pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel, Epi-Info 6.0. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TẠO KIT MULTIPLEX PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN LAO 3.1.1. Tách chiết DNA Có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA khác nhau, trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã thử nghiệm các phương pháp khác nhau để thu được DNA có độ tinh sạch cao, loại bỏ tối đa các tác nhân ức chế phản ứng multiplex PCR. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch lysis buffer để dung giải tế bào cùng với lysozyme và proteinase K, tách chiết bằng phenol – chloroform – isoamyl, tủa DNA bằng cồn đã đem lại hiệu quả tinh sạch tương đối cao. Khuẩn lạc vi khuẩn lao sau nuôi cấy được thu hoạch vào trong các tube chứa nước muối sinh lí, nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 109 vk/ml, sau đó được bất hoạt ở 80oC trong 20 phút. Ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn để chuẩn bị cho quá trình tách chiết. Tế bào thu được sau đó được ly giải bằng dung dịch đệm lysis buffer với thành phần gồm Tris-HCl 1M (pH 8.5), EDTA 0,5M, SDS 10%, NaCl 5M và lysozyme 25mg/ml, đem votex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút. Quá trình này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng các bào quan và vật chất di truyền. Bổ sung Proteinase K 10mg/ml vào dung dịch và ủ lắc ở 56oC trong 2 đến 3 giờ. Proteinase K giúp phân hủy protein. Sau khi ủ lắc dung dịch ly giải được chiết bằng hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl – Alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 so với dung dịch ly giải. Votex kĩ sau đó ly tâm thu lấy dịch nổi có chứa DNA. Dịch nổi chứa DNA này sau đó được tủa trong hỗn hợp cồn 100% và CH3COONa 3M, ly tâm thu cặn. DNA tiếp tục được rửa lại bằng cồn 70%, ly tâm thu cặn, làm khô, hòa cặn có chứa DNA trong 100µl khử vô trùng. Kết quả chúng tôi thu được DNA tổng số của vi khuẩn lao. Các mẫu DNA sau khi tách chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bước sóng 260nm và của protein ở bước sóng 280nm. Nồng độ của DNA được tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260nm, độ tinh sạch được đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260nm/OD280nm. DNA thu được có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 được coi là khá tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác [6, 28, 42]. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng làm panel mẫu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao từ Bệnh viện TW Huế Stt Tên mẫu Nồng độ Ng/µl OD (260/280) 1 TB05-101 27,8 1,92 2 TB05-102 20,5 1,78 3 TB05-103 16,5 1,85 4 TB05-104 17,8 1,85 5 TB05-105 30,3 1,65 6 TB05-106 91,8 1,82 7 TB05-107 86,1 1,69 8 TB05-108 49,2 1,69 9 TB05-109 39,5 1,71 10 TB05-110 33,3 1,75 Bảng 3.2. Kết quả tách chiết DNA một số bệnh phẩm từ Bệnh viện 108 Stt Tên mẫu Nồng độ Ng/µl OD (260/280) 1 TB08-171 89,1 1,67 2 TB08-172 159,5 1,69 3 TB08-173 5,2 2,72 4 TB08-174 81,5 1,70 5 TB08-175 34,7 1,60 6 TB08-176 13,5 2,39 7 TB08-177 6,5 1,76 8 TB08-178 63,5 1,57 9 TB08-179 20,5 1,54 10 TB08-180 4,8 1,88 3.1.2. Tạo panel 3.1.2.1. Tạo panel kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit mPCR Panel kiểm tra độ nhạy của kit mPCR gồm 50 mẫu DNA của chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Các mẫu này đã được kiểm tra có đủ 3 gen đích là IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Panel kiểm tra độ đặc hiệu của kit mPCR gồm 50 mẫu DNA được tạo từ các mẫu DNA của Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT). Các mẫu này không có các trình tự đặc trưng của 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. 50 mẫu panel độ nhạy và 50 mẫu panel độ đặc hiệu được mã hóa để đảm bảo tính khách quan cho các kiểm tra đánh giá về độ nhạy và độ đặc hiệu. Bảng 3.3. Panel kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR Stt Mã chủng Mã số bộ panel Stt Mã chủng Mã số bộ panel 1 TB02-01 DNA-TB01 26 TB02-30 DNA-TB26 2 TB02-02 DNA-TB02 27 TB02-31 DNA-TB27 3 TB02-03 DNA-TB03 28 TB02-32 DNA-TB28 4 TB02-04 DNA-TB04 29 TB02-33 DNA-TB29 5 TB02-05 DNA-TB05 30 TB02-34 DNA-TB30 6 TB02-06 DNA-TB06 31 TB05-01 DNA-TB31 7 TB02-07 DNA-TB07 32 TB05-02 DNA-TB32 8 TB02-08 DNA-TB08 33 TB05-03 DNA-TB33 9 TB02-09 DNA-TB09 34 TB05-04 DNA-TB34 10 TB02-10 DNA-TB10 35 TB05-05 DNA-TB35 11 TB02-15 DNA-TB11 36 TB05-06 DNA-TB36 12 TB02-16 DNA-TB12 37 TB05-07 DNA-TB37 13 TB02-17 DNA-TB13 38 TB05-08 DNA-TB38 14 TB02-18 DNA-TB14 39 TB05-09 DNA-TB39 15 TB02-19 DNA-TB15 40 TB05-10 DNA-TB40 16 TB02-20 DNA-TB16 41 TB06-83 DNA-TB41 17 TB02-21 DNA-TB17 42 TB06-88 DNA-TB42 18 TB02-22 DNA-TB18 43 TB06-89 DNA-TB43 19 TB02-23 DNA-TB19 44 TB06-90 DNA-TB44 20 TB02-24 DNA-TB20 45 TB06-91 DNA-TB45 21 TB02-25 DNA-TB21 46 TB06-92 DNA-TB46 22 TB02-26 DNA-TB22 47 TB06-93 DNA-TB47 23 TB02-27 DNA-TB23 48 TB06-94 DNA-TB48 24 TB02-28 DNA-TB24 49 TB06-95 DNA-TB49 25 TB02-29 DNA-TB25 50 TB06-96 DNA-TB50 Bảng 3.4. Panel kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR Stt Mã chủng Mã số bộ panel Stt Mã chủng Mã số bộ panel 1 TB02-201 DNA-TB51 26 TB02-229 DNA-TB76 2 TB02-203 DNA-TB52 27 TB02-230 DNA-TB77 3 TB02-204