Luận văn Nghiên cứu thành phần aglycon của loài huệ (polianthes tuberosa l.)

nh qua quá trình tiến hóa. Củ và rễ: Cây Huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 0-15cm, củ của thực vật này thực chất chính là thân ngầm của nó. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 9 Ảnh 1.1. Hình ảnh loài Huệ Ảnh 1.2. Củ và rễ của loài Huệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 1.2.2.2. Phân bố trong tự nhiên Cây Huệ có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện nay đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Singapore, Indonexia, Iran,... Loài cây này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu. Hiện nay, loài cây này đang được trồng phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là các vùng trồng hoa lân cận Hà Nội. Cây Huệ là cây ưa ánh sáng, do vậy vườn trồng cần phải không bị cây che ánh sáng, cho hoa quanh năm, ưa khí hậu mát, nhiệt độ thích hợp 20-25oC, phù hợp với đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng [16, 17]. Ở Việt Nam, hoa Huệ là thứ hoa được dùng nhiều trong việc cúng lễ, mà ít dùng để tặng nhau [1]. 1.2.3. Kinh nghiệm sử dụng trong y học dân gian [1, 16] - Hoa Huệ có tác dụng lợi tiểu và chống nôn. - Ở Ấn Độ, củ được phơi khô và tán bột dùng làm thuốc trị lậu. - Ở Việt Nam, củ hoa Huệ thường dùng củ chữa bệnh sốt rét. Nhiều nơi dùng củ chữa hóc xương bằng cách giã nát củ, vắt lấy nước, nhỏ vào cuống họng. - Huệ được trồng rộng rãi ở các phía nam của Ở Trung Quốc. Các củ của loài này sử dụng như một thuốc dùng để điều trị các bệnh truyền nhiễm cấp tính, điều trị ghẻ và viêm gây sốt. 1.3. Tổng quan về nghiên cứu hoá học thực vật Huệ 1.3.1. Hợp chất saponin Trên thới giới, đến nay có một số công trình đã công bố nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Huệ. Các chất đã phân lập ra từ loài thực vật này được xác định chủ yếu thuộc nhóm saponin có khung aglycon như là tigogenin, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 hecogenin, 9-dehydroxyhecogenin, 5α-spirostan-12-one và một số hợp chất có khung đã được mở dị vòng 6 cạnh chứa oxi ở vị trí cacbon số 22 [3-5,7, 12-15]. Ở vị trí cacbon số 3 thường có các liên kết glycozit với một hoặc nhiều phân tử đường. Cấu trúc của aglycon trong các hợp chất glycoside đã phân lập được từ loài Hoa huệ được tổng hợp dưới đây: Năm 2000, Yoshihiro Mimaki và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học bộ phận trên mặt đất của Huệ. Họ đã phân lập được bisdesmosidic cholestane glycosides (1) và ba saponin có khung spirostanol (2-4). Cấu trúc hóa học của các chất này được xác định bằng cách phân tích phổ 1D và 2D NMR, đồng thời đánh giá khả năng ức chế trên tế bào ung thư bạch cầu (HL- 60) ở người [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 12 OH CH3 H H H CH3 CH3 O O OH OH OO CH3 CH3 CH3 CH3 OH OH CH3 CH3 OH OH O O O O OH OHO OH OH OH O O O CH3 CH3 H R1 R2 H H CH3 CH3R3 O O OH OOH OH OH O OH OH OH Năm 2002, cũng nhóm nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự (ở Nhật bản) đã phân tích thành phần hóa học và phân lập được trong củ của loài Huệ bốn saponin có khung là spirostanol liên kết với năm phân tử monosacarit (5-8) [15]. Cấu trúc của các hợp chất đó được xác định bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D. Các hợp chất (5-8) có tác dụng ức chế tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người [15] (2) R1=OH, R2=H, R3=2H (3) R1=H, R2=H, R3=O (4) R1=OH, R2= -, R3=O (1) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 13 O O R CH3 H H O H CH3 O H CH3 CH3 (5-8) OH OH OH OH O O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH O O OH OH OH OH (5) OH OH OH O O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH O O OH OH OH OH (6) OH OH OH O O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH O OOH OH OH OH OH (7) OH OH OH O O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH O OOH OH OH OH OH (8) R2 = R1 = R3 = R4 = Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 Ngoài ra, một vài hợp chất glycosides bao gồm: (22S)-2β, 3β,22- trihydroxycholest-5-en-16β-yl-β-D-apiofuranoside[4], 29-hy-droxystigmast-5-en- 3β-yl-β-D-glucopyranoside [5] và diribo-furanosyl ethyleneglycol [7] được phân lập từ các bộ phận dưới mặt đất của loài này. Một số saponin gồm polianthosides B (9), C (10), và bốn polianthosides D- G (11)-(14), cùng với tám saponin (15) đến (22) cũng được phân lập ra từ củ tươi loài thực vậy này [3, 7-9, 12]. O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH OH O R3 R2 O O O CH3 CH3 H R1 H H H CH3 CH3 O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH OH O R3 R2 O O CH3 CH3 H R1 H H H CH3 CH3R1 OH O CH3 OH OH OH (9) R1 = H, R2 =Glc, R3 = Xyl (10) R1 = H, R2 =R3 = Glc (19) R1 = R2 = H, R3 = Xyl (20) R1 = H, R2 = R3 = Xyl (21) R1 = OH, R2 = R3 = Xyl (11) R1 = O, R2 =Xyl, R3 = H (12) R1 = O, R2 =R3 = Xyl (13) R1 = 2H , R2 =R3 = Xyl (14) R1 = 2H, R2 = Glc, R3 = Xyl (22) R1 = 2H, R2 = Xyl, R3 = H Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 O OH OH O O O O OH OHO OH OH OH OH O R3 R2 O O CH3 CH3 H R1 H H H CH3 CH3O O 1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần tinh dầu Hoa Huệ Tinh dầu cũng là thành phần hóa học quan trọng của loài Hoa huệ. Trong loài thực vật này ngoài các hợp chất glycoside đã phân lập được còn chứa nhiều tinh dầu và các thành phần dễ hóa hơi. Tinh dầu Hoa huệ được chiết xuất bằng các phương pháp như: Chiết xuất bằng lôi cuốn hơi nước, chiết siêu âm siêu tới hạn, chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Dựa trên phương pháp GC/MS đã xác định được hơn ba mươi thành phần hóa học có trong loài hoa này [11]. Hình 1.1: Sắc ký đồ GC của nước ép hoa Huệ[11] (15) R1 = R2 = H (16) R1 = Xyl, R2 =H (17) R1 = R2 = Xyl (18) R1 = Glc, R2 = Xyl Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 16 Bảng 1.1: Thành phần các chất trong nước ép hoa Huệ [11] TT Peak Thời gian lưu(phút) % Diện tích píc Chất 1 10.996 30.17 methyl benzoate 2 12.896 12.11 Methylsalicylate 3 14.567 1.78 Indole 4 14.818 1.47 (E)-citral 5 15.297 4.45 methyl anthranilate 6 16.021 1.80 Methyleugenol 7 17.306 8.83 (E)-methyl isoeugenol 8 17.373 13.33 7-decen-5-olide 9 20.755 2.43 (z)-beta-farnesene 10 21.943 23.64 benzyl benzoate Hình 1.2. Sắc ký GC của dịch chiết n-hexan của hoa Huệ [11] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 17 Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong dịch chiết n-Hexan[11] TT Peak Thời gian lưu (phút) % Diện tích píc Chất 1 14.804 3.70 (Z)-3-hexenyl 2- oxopropanoate 2 16.009 1.07 Methyleugenol 3 16.744 2.32 methyl isoeugenol 4 17.294 1.89 (E)-methyl isoeugenol 5 17.364 14.96 7-decen-5-olide 6 17.494 8.36 2,4,-di-tert-butylphenol 7 18.449 8.85 1-hexadecene 8 20.736 1.94 alpha-farnesol 9 21.901 24.25 benzyl benzoate 10 24.198 1.39 benzyl salicylate 11 26.245 4.96 Ecosanol 12 32.440 2.47 Tricosane 13 36.972 19.23 Pentacosane 14 43.542 4.60 Heptacosane Từ nghiên cứu trên ta có thể thấy trong tinh dầu Hoa huệ thành phần chính gồm: 7-decen-5-olide, 2,4,-di-tert-butylphenol, 1-hexadecene, benzyl benzoate, pentacosane. Đến nay, theo tìm hiểu của tôi ở Việt Nam chưa có báo cáo nào về thành phần hóa học của loài Huệ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 18 1.4. Tổng quan các nghiên cứu hoạt tính sinh học Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật này thì thành phần hóa học chủ yếu là các saponin. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng định hướng theo hoạt tính của loại hợp chất đó, đồng thời tinh dầu của loài thực vật này (nhất là trong hoa) thể hiện nhiều hoạt tính và công dụng tốt. 1.4.1. Hoạt tính của hợp chất saponin 1.4.1.1. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư Năm 2002, Yoshihiro Mimaki và công sự đã tiến hành thử hoạt tính ức chế của các saponin phân lập từ loài Huệ. Kết quả cho thấy các hợp chất glycozit của spirostan (5-8) có khả năng ức chế tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người [15]. Năm 2015, Gasparotto và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của hecogenin (là một sapogenin có trong loài Hoa huệ) ức chế sự gia tăng các loại phản ứng trong tế bào gây ra bởi H2O2. Ngoài ra, hecogenin ngăn chặn sự phosphoryl hóa của ERK1/2 và ức chế sự tăng MMP-2 gây ra bởi H2O2, làm giảm sự tăng trưởng các tế bào ung thư [8]. Bên cạnh đó, từ hecogenin cũng được điều chế một số loại dẫn xuất dị vòng có hoạt tính mạnh hơn so với hecogenin [6]. 1.4.1.2. Hoạt tính chống viêm và ức chế enzym Năm 2012, Kelly Barbosa Gama đã nghiên cứu về khả năng kháng viêm của hecogenin. Nghiên cứu này đã được thực hiện để đánh giá hecogenin có tác dụng hạ sốt [9]. Năm 2016, Lai-King Sy và các công sự đã khảo sát khả nắng chế enzym β-Amyloid protein 42 một trong những tác nhân gây ra bệnh alzheimer Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 19 và parkison, của tigogenin và timosaponin. Kết quả nhận thấy tigogenin có hoạt tính kém hơn so với timosaponin [10]. 1.4.2. Hoạt tính và công dụng của tinh dầu hoa Huệ - Cải thiện thần kinh và hệ hô hấp: các mùi thơm dễ chịu và các thành phần hóa học khác nhau của tinh dầu có ảnh hưởng đến não, dây thần kinh và giúp các cơ bắp được thư giãn; làm giảm stress, căng thẳng, lo âu, trầm cảm, co giật và tiêu chảy. Tuy nhiên, để có hiệu quả tốt nhất khi sử dụng tinh dầu này với tác dụng an thần, nên sử dụng với nồng độ thật loãng [16]. - Tác dụng làm ấm: Tinh dầu hoa Huệ có tác dụng làm ấm vào các cơ quan vì nó làm tăng lưu thông máu. Giữ cho hệ hô hấp ấm áp, ngăn ngừa sự lắng đọng đờm, tăng hoạt động, và cũng giúp để chữa trị các rối loạn tình dục [16]. - Tác dụng giảm đau: Tinh dầu này có hiệu quả rất tốt trong giảm đau, kháng viêm [1, 17]. - Độc tính: bên cạnh các tác dụng trên, các hợp chất phân cực nhỏ của hoa loài Huệ thể hiện độc tính tế bào nhưng hoạt tính không quá mạnh [16,17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 20 Chương 2 PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là thân, lá của loài Huệ (Polianthes tuberosa L.) được thu hái tại huyện Phú Lương - tỉnh Thái Nguyên vào tháng 6 và 7 năm 2015. Thu hái cây Hoa huệ sau khi đã ra hoa và lấy cả các bộ phận thân và lá, rửa sạch mẫu bằng nước lọc. Phần hoa tươi bảo quản trong tủ lạnh để xác định thành phần tinh dầu. 2.2. Hóa chất - dụng cụ 2.2.1. Hóa chất Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure). Còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết. - Dung dịch H2SO4 đặc. - Dung dịch NaOH loãng. - Silicagen ( cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g). - Dung môi n-hexan, Etanol, Metanol, Cacbon tetraclorua, Etylaxetat, axeton, Clorofom. - Giấy pH. - Thuốc hiện màu là hỗn hợp axit sunfuric đặc (H2SO4) và etanol 90% (C2H5OH) theo ti lệ axit sunfuric : etanol là 3:7. Các hệ dung môi khai triển SKLM: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 21 1. n-hexan – axeton 25:1 Hệ A 2. n-hexan – etyl axetat 25:1 Hệ B 3. n-hexan – etyl axetat 4. n-hexan – etyl axetat 5. n-hexan – etyl axetat 6. CCl4- CHCl3 7. CHCl3- EA 20:1 15:1 10:1 1:1 25:1 Hệ C Hệ D Hệ E Hệ F Hệ G 2.2.2. Dụng cụ - Máy cất quay chân không IKA*RV-10, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ. - Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader. - Cột sắc ký lớn và nhỏ. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy 500 MHz, Bruker. - Sắc kí lớp mỏng bản nhôm silicagen 60 F254, độ dày 0,2 mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. 2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 2.3.1. Xử lý mẫu thưc vật Mẫu cây tươi cắt lấy phần trên củ gồm thân và lá của loài Huệ rồi rửa sạch và phơi cho ráo nước. Lấy mẫu thái nhỏ từ 1 cm đến 2 cm, đem phơi dưới nắng cho mẫu khô đều rồi cho vào túi kín, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát. Phần hoa tươi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-4oC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 22 2.3.2. Chiết xuất dược liệu Mẫu cây Huệ sau khi đã được xử lí xong được ngâm chiết trong etanol 90% ở nhiệt độ 70-80˚C, mỗi lần 1 kg mẫu/5 lít etanol 90%. Quá trình chiết được lặp lại ba lần, mỗi lần chiết là 4 giờ. Sau khi chiết xong, lọc bỏ bã và thu dịch chiết. Phần dịch chiết được cho vào máy cất quay dưới áp suất thấp để thu hồi dung môi ở nhiệt độ 500C thu được cặn chiết etanol. 2.3.3. Thủy phân mẫu trong axit Cho phần cặn etanol cho vào bình thủy phân, thêm 2 lít nước, và khuấy đều. Cho thêm vào hỗn hợp 70 ml axit H2SO4 đặc vào bình thủy phân, đun hồi lưu ở nhiệt độ 60-70˚C trong 6h. Trong lúc đun, cứ 1 giờ phải khuấy đều 1 lần để quá trình thủy phân hoàn toàn. Sau khi kết thúc thủy phân, axit dư được trung hòa bằng NaOH 1M. Lọc thu phần không tan trong nước. Phần cặn được rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ. Nghiền nhỏ cặn và lần lượt chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần clorofom, etylaxetat, thu được các dịch chiết CHCl3 và EA. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC thu được các cặn chiết tương ứng. 2.3.4. Phương pháp định tính dịch chiết CHCl3 2.3.4.1. Định tính hợp chất phenolic - Phản ứng với muối sắt (III): Tùy theo số lươṇg và vi ̣ trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoăc̣ nâu. - Tác duṇg với H2SO4 đăc̣: Khi nhỏ H2SO4 lên các dâñ xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đâṃ, đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam do sư ̣chuyển thành chalcon. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 23 2.3.4.2. Định tính alkaloid * Các thuốc thử sử dụng: - Thuốc thử Dragendorff. Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 mL dung dịch axit axetic 20%. Dung dịch B: 5 mL dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng trộn 20 mL dung dịch A, 5 mL dung dịch B và 70 mL H2O. - Thuốc thử Mayer: Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60mL H2O. Dung dịch B: Hòa tan 5g KI trong 10mL H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100mL. * Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết cho thêm 5 mL H2SO4 5%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL nước lọc axít rồi thêm: + Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. + Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. * Hiện tượng + Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam. + Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.4.3. Định tính các flavonoit * Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại. * Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết thêm 10mL CH3OH, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2mL nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút đến và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoit. * Hiện tượng: Dịch metanol có màu hồng. Khi thêm thuốc thử thì có màu hồng hơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 24 2.3.4.4. Định tính các cumarin * Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%. * Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axít hoá ống nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính. 2.3.4.5. Phản ứng của steroid Phản ứng Liebermann–Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá. 2.3.5. Phân lập các chất từ dịch chiết loài Huệ Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3 thu được bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi rửa giải thích hợp. 2.3.6. Xác định cấu trúc các chất Cấu trúc của các hợp chất sau khi tách ra được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều trên hệ máy có tần số 500 MHz tại Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội và so sánh với giá trị phổ trong các công trình đã công bố trước đó. 2.3.7. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 25 2.4. Phương pháp xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ Lấy cánh hoa của Hoa huệ tươi cho vào bình sạch ngâm với dung môi n- hexan tinh khiết, đậy kín trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Đem phần dịch lọc bỏ cánh hoa rồi chiết lấy dịch chiết n-hexan. Dịch thu được dùng để thực nghiệm GC (FID) kết hợp với phổ khối MS để xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu trong Hoa huệ. 2.5. Thực nghiệm 2.5.1. Chiết xuất và xác định thành phần tinh dầu Hoa huệ Lấy 50 gam cánh Hoa huệ tươi cho vào bình sạch ngâm với 200ml dung môi n-hexan, đậy kín trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Đem phần dịch lọc bỏ cánh hoa rồi chiết lấy dịch chiết n-hexan. Dịch chiết n-hexan dùng thực nghiệm GC/MS để xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu có trong hoa loài Hoa huệ. Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu tinh dầu Hoa huệ Kết quả nhận thấy trong tinh dầu Hoa huệ thu hái tại Thái Nguyên có chứa 37 thành phần hóa học khác nhau. Trong tinh dầu này có một số các thành phần chiếm hàm lượng lớn. - Chiết lấy tinh dầu - Chiết trong n-hexan( 48 giờ) - Lọc bỏ cánh hoa Dịch n-hexan Tinh dầu hoa Huệ 50 g cánh hoa Huệ Thực nghiệm GC/MS để xác định hàm lượng tinh dầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 26 2.5.2. Phân lập các chất loài Huệ 2.5.2.1.Chiết xuất mẫu nghiên cứu Mẫu hoa Huệ sau khi đã được xử lí xong tiếp tục chia thành các phần nhỏ và chiết hồi lưu trong etanol 90% ở nhiệt độ 80˚C trong thời 3h, lặp lại 3 lần. Sau khi ngâm chiết xong lọc bỏ phần bã hoa Huệ và thu lấy dịch chiết. Dung môi được thu hồi bằng quay cất dưới áp suất thấp thu cao chiết tổng số có khối lượng 1 kg. 2.5.2.2. Thủy phân cặn chiết etanol của loài Huệ Cao chiết tổng số được thủy phân trong môi trường axit trong bình thủy tinh. Hỗn hợp cao chiết và nước (2 lít) được thêm vào 70ml axit H2SO4 đặc vào đun nóng hồi lưu ở nhiệt độ 60-70˚C trong 6h. Trong lúc đun, cứ sau 1 giờ phải khuấy đều 1 lần để quá trình thủy phân hoàn toàn. Sau khi thủy phân xong axit được trung hòa bằng NaOH. Lọc thu sản phẩm không tan trong nước. Phần cặn được rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ. Nghiền nhỏ cặn và lần lượt chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần clorofom, etylaxetat thu được các dịch chiết. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC thu được các cặn chiết có khối lượng tương ứng là: 50 gam cao chiết clorofom ; 50g cao chiết etylaxetat. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 27 2.5.2.3. Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết và thủy phân dược liệu 2.5.2.4. Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3 Từ 50 gam cao chiết CHCl3, tiến hành phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel. Hòa tan cao chiết trong lượng vừa đủ CHCl3 và nhỏ từ từ vào 50g silica gel để tạo hỗn hợp chạy cột. Cột sắc ký được nhồi với lượng silica gel là 700g. Hệ dung môi rửa giải: n-hexan:axeton với tỉ lệ 25/1 đến 1/1 (v/v) thu được 7 phân đoạn khác nhau. Phân đoạn 1 gộp các ống từ số 1 đến 5. Phân đoạn 2 gộp các ống từ số 6 đến 10. 3 kg mẫu khô loài Huệ Cặn sau khi thủy phân (200g) - Thủy phân với H2SO4 - Trung hòa axit dư với NaOH - Lọc lấy cặn - Nghiền nhỏ - Chiết lần lượt với clorofom, etyl axetat - Chặt nhỏ - Chiết trong etanol (90%) Cặn chiết etanol (1 kg) Phần không tan Cao clorofom (50 g) Cao etyl axetat (50 g) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 28 Phân đoạn 3 gộp các ống từ số 11 đến 15. Phân đoạn 4 gộp các ống từ số 16 đến 18. Phân đoạn 5 gộp các ống từ số 19 đến 22. Phân đoạn 6 gộp các ống từ số 23 đến 25. Phân đoạn 7 gộp các ống từ số 26 đến 28. Từ 2,5 gam cặn chiết từ phân đoạn số 2 được tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel và hệ dung môi rửa giải là n-hexan: etylaxetat với tỉ lệ 15/1 đến 1/1 (v/v) thu được 6 phân đoạn, ký hiệu A đến F. Trong các phân đoạn A đến F, phân đoạn B gồm 3 ống đem thử với bản mỏng có 2 vết chất, tiết hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CCl4/CHCl3 có tỉ lệ từ 3/1 đến 1:1 (v/v) tách được 2 chất tinh khiết không màu 1 và 2. Từ phân đoạn C có 1 vết chất đậm, tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CCl4/CHCl3 với tỉ lệ 1/1 thu được chất rắn 3, chất này cho màu vàng khi hiện màu với thuốc thử H2SO4 đặc trong etanol và hơ nóng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 29 Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập các chất trong cặn chiết clorofom loài hoa Huệ Phân đoạn1 ống 01-05 Phân đoạn 3 ống 11-15 Phân đoạn 2 ống 06-10 Phân đoạn 4 ống 16-18 Phân đoạn 6 ống 23-25 Phân đoạn 5 ống 19-22 Phân đoạn 7 ống 26-28 - Chạy sắc kí cột( lần 1) - Hệ dung môi n-hexan:axeton = 25/1 đến 1/1 (v/v) - Thông cột bằng axeton. Cao CHCl3 ( 50 g) - Sắc kí cột silica gel - Hệ dung môi n-hexan: etylaxetat = 15/1 đến 1/1 (v/v) Phân đoạn A Phân đoạn C Phân đoạn B Phân đoạn D Phân đoạn F Phân đoạn E - Sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi CCl4:CHCl3 = 3/1 đến 1/1(v/v) Chất 3 ( 11 mg) - Sắc kí cột silica gel - CCl4:CHCl3 với tỉ lệ 1/1 (v/v) Chất rắn 2 (17 mg) Chất rắn 1 (15 mg) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 30 2.5.3. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được 2.5.3.1. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của chất 1 Các giá trị phổ 1H-NMR, 13C-NMR của 1 được đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu phổ cộng hưởng từ của chất 1 được tổng hợp ở bảng 2.1. Bảng 2.1: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của 1 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) 1H NMR (ppm), J (Hz) 1 37.21 1.53-1.78 (m) 2 31.62 1.16-1.78 (m) 3 71.81 3.53 (m) 4 42.29 1.40-1.67 (m) 5 140.73 6 121.73 5.35 (br d, 3,5) 7 31.87 1.40-1.95 (m) 8 31.88 1.78 (m) 9 50.08 1.76 (m) 10 36.48 11 21.08 1.56 (m); 1.67 (m) 12 39.65 1.55 (m); 1.65 (m) 13 42.29 14 56.83 2.03 (m) 15 24.35 16 28.92 17 55.90 18 12.03 0.84 (s) 19 19.38 1.03 (s) 20 40.50 21 21.05 0.91 (d, 6.6) 22 138.33 5.16 (dd, 8.5, 15.4) 23 129.27 5.03 (dd, 8.5, 15.4) 24 51.21 2.01 (m) 25 31.87 1.87 (m); 1.89 (m) 26 21.20 0.84 (t, 8.5) 27 25.40 1.98 (m) 28 18.95 0.81 (d, 6.9) 29 12.25 0.86 (d, 9.6) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 31 2.5.3.2. Dữ liệu phổ của chất 2 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR của 2 được đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu phổ của chất 2 được tổng hợp ở bảng 2.2. Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của 2 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) 1H NMR (ppm), J (Hz) 1 37.26 1.53-1.78 (m) 2 31.64 1.16-1.78 (m) 3 71.80 3.57 (m) 4 42.29 1.40-1.67 (m) 5 140.76 6 121.71 5.35 (br d, 3.5) 7 31.91 1.40-1.95 (m) 8 31.91 1.78 (m) 9 50.15 1.76 (m) 10 36.51 11 21.08 1.56 (m); 1.67 (m) 12 39.79 1.55 (m); 1.65 (m) 13 42.33 14 56.79 2.03 (m) 15 24.31 16 29.17 17 56.07 18 11.98 0.84 (s) 19 19.40 1.03 (s) 20 33.96 21 26.11 0.91 (d, 6.6) 22 45.85 1.16 -1.18 (m) 23 23.08 1.76-1.83 (m) 24 11.98 1.87 (m) 25 29.71 1.87 (m); 1.89 (m) 26 19.82 0.84 (t, 8.5) 27 19.05 1.98 (m) 28 18.79 0.82 (d, 6.9) 29 11.86 0.83 (d, 9.6) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 32 2.5.3.3. Dữ liệu phổ của chất 3 Các giá trị phổ 1H-NMR, 13C-NMR của 3 được đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu phổ của chất 3 được tổng hợp ở bảng 2.3. Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của 3 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) 1H NMR (ppm), J (Hz) 1 29.61 1.53-1.76 (m) 2 27.47 1.16-1.75 (m) 3 66.74 4.05 (1H, m) 4 33.19 1.40-1.65 (m) 5 36.18 2.02 (m) 6 26.22 1.36 (m) 7 26.20 1.40-1.97 (m) 8 34.93 1.75 (m) 9 39.97 1.76 (m) 10 34.93 11 20.56 1.55 (m); 1.65 (m) 12 39.51 1.55 (m); 1.66(m) 13 40.33 14 56.13 2.03 (m) 15 31.40 1.98 (m) 16 80.69 4.32 (1H, q, J = 7.8) 17 61.74 18 16.16 0.78 (3H, s) 19 23.58 0.98 (3H, s) 20 41.78 2.03 (m) 21 14.00 1.06 (3H, d, J = 7.2) 22 109.41 23 27.47 1.76-1.83 (m) 24 25.60 1.88 (m) 25 26.2 1.87 (m); 1.91 (m) 26 64.80 3.89 (1H, dd, J = 11.3, 2.5 ). 3.41 (1H, d, J = 11.3 ) 27 16.16 0.99 (3H, d, J = 7.5) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 33 2.5.4. Thử hoạt tính kháng