Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học cây lược vàng (calllisia fragrans)

cặp đồng phân đối quang. Ví dụ như các cặp catechin và epicatechin, trong đó chỉ có (+)-catechin và (−)-epicatechin là xuất hiện trong thiên nhiên. 28 OH OH HO O OH OH (+)-catechin OH OH HO O OH OH (−)-epicatechin OH OH HO O OH OH (−)-catechin OH OH HO O OH OH (+)-epicatechin 2.9. Leucoanthocyanidin Leucoanthocyanidin là những flavan-3,4-diol. Chúng là những hợp chất màu nhưng khi gặp axit biến thành hồng hoặc đỏ, được phân bố rộng rãi trong các loài thực vật. Trong đó melacacidin và leucopelargonidin là hai hợp chất đặc trưng và được chú ý nhiều nhất. OH HO O HHO OH H OH OH Melacacidin HO O HHO OH H OH OH Leucopelargonidin 2.10. Rotenoit Nhóm hợp chất này có cấu trúc cơ bản của hệ thống couman-croman 4 vòng là dẫn xuất của isoflavanon. Chất quan trọng nhất là rotenon. 29 O O O C OMe OMe O CH3 H2C Rotenon 2.11. Neoflavonoit Là nhóm hợp chất có khung cơ bản là 4-aryl croman, chất tiêu biểu là calophylolit. O 1 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' Khung 4-ary chroman O O O O MeO Calaphylolit 3. Tác dụng sinh học của flavonoit Flavonoit là nhóm chất phổ biến trong thực vật, thường có trong các loại rau quả dùng hàng ngày. Flavonoit là một lớp chất lớn trong dược liệu, phần lớn chúng có màu vàng, ngoài ra còn có các chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu. Flavonoit có mặt trong hầu hết các bộ phận của loài thực vật bậc cao, đặc biệt là hoa, tạo cho hoa màu sắc quyến rũ để thu hút các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoit giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn axit ascorbic trong tế bào và ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, vi rut, côn trùng), một số còn có tác dụng điều hoà sinh trưởng của cây. 30 Flavonoit là nhóm chất có nhiều tác dụng sinh học, những flavonoit có hoạt tính sinh học được gọi là các bioflavonoit. Chúng có các vai trò như là chất chống oxy hoá, có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn cản xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ, flavonoit làm bền thành mạch, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavon, flavonol, flavanol có tác dụng lợi tiểu. Dân ta đã có kinh nghiệm sử dụng những dược liệu giàu flavonoit để giữ gìn sức khoẻ hàng ngày bằng cách dùng đơn giản là trà thuốc: thuốc sắc như nước chè, trà actisovừa rẻ tiền lại hiệu quả. Những dược liệu có hàm lượng flavonoit cao đã được khai thác và chiết xuất lấy flavonoit để phục vụ cho nền công nghiệp dược: hoa hoè, vỏ cam, núc nác, hoàng cầm, lá xoàivà một số flavonoit đã được nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc nướcrất thuận tiện cho sử dụng [5, 17, 30, 45]. 4. Hệ thống các chất chống oxy hóa Những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các dạng oxy hoạt động đều được gọi là chất chống oxy hóa. 4.1. Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzym Các chất chống oxy hóa chủ yếu trong tế bào của cơ thể người gồm những enzym SOD-superoxit dismutaza, catalaza và GSHPO-glutathion pero- xidaza [31, 39]. Enzym SOD có mặt trong tất cả các tế bào có chuyển hoá oxy. Chức năng của enzym này là xúc tác quá trình phân huỷ superoxit [11]. 22222 OOHH2OO +→++ +−•−• Catalase là một chất chống oxy hoá vì nó xúc tác phản ứng phân huỷ H2O2. Tuy nhiên catalaza không phân huỷ được các peroxit hữu cơ và cả H2O2 khi ở nồng độ thấp [24, 26]. 2H2O2 2H2O + O2 SOD 31 Glutathione peroxidaza (GSHPO) là enzym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các H2O2 hữu cơ và vô cơ. H2O2 khi mới tạo ra với nồng độ thấp, xảy ra phản ứng của glutathion (GSH) với H2O2 nhờ enzym GSHPO xúc tác: 2GSH + LOOH GSSG + LOH + H2O Enzym GSHPO có ở ti thể, nạp thể và bào tương, nó chứa selen trong trung tâm hoạt động. Vì vậy hàm lượng selen trong cơ thể liên quan chặt chẽ với hoạt độ của enzym này. Enzym không chỉ phân hủy H2O2 mà cả các peroxit hữu cơ khác. Như vậy khả năng loại bỏ các peroxit phụ thuộc vào hoạt độ của enzym GSHPO và nồng độ của glutathion [8, 41]. 4.2. Hệ thống các chất chống oxy hoá có bản chất không phải enzym Có rất nhiều chất hoá học có khả năng chống oxy hoá thể hiện qua phản ứng thu dọn các gốc peroxit, oxy đơn bội, các gốc tự do khác, hoặc gián tiếp ngăn chặn quá trình oxy hoá sinh học. Chúng có thể có sẵn trong cơ thể hoặc được bổ sung từ bên ngoài. Những nhóm chính là nhóm các chất polyphenol, các thiol, nhóm các phối tử của Fe (hay Cu), muối selen và phức của Se4+, nhóm các chất chứa nhiều nối đôi liên hợp [15, 16, 22]. - Nhóm các polyphenol Thuộc nhóm này có vitamin A, vitamin E, coenzym Q10, vitamin C, bioflavonoit. + Dạng khử của chúng có thể phản ứng với các gốc tự do, tạo dạng oxy hoá (quinon). OH OH + 2R. O O + 2RH + Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và có khả năng phản ứng với hai gốc tự do khác. Tuy nhiên sự chuyển dạng theo khuynh hướng này tương đối yếu. GSHPO 32 +2R. O O O. O. OR OR Đặc biệt là dạng oxy hoá và dạng khử có thể phản ứng thuận nghịch tạo gốc semiquinon. OH OH +2R. O O O. OH OR OR 2 2+ Nhìn chung các gốc semiquinon rất bền, có thể tồn tại lâu dài. Một số có tính gây độc bằng cách gắn đồng hoá trị vào các cao phân tử sinh học. Nhưng riêng với các vitamin C, E, coenzym Q10, bioflavonoit (và một số polyphenol khác) thì semiquinon của chúng lại không độc nên chúng là những chất trung hoà các gốc tự do rất tốt. + Các polyphenol (dạng ortho) có khả năng tạo phức (chelat hoá) với ion sắt (hoặc đồng) và như vậy có thể làm mất khả năng xúc tác của những ion này để tạo phản ứng Fenton. Các vitamin E, A có chức phenol ở vị trí para nên không thể hiện khả năng tạo phức chelat này. Tuy cùng có tác dụng chống oxy hoá, song các polyphenol có những tính chất vật lý và hoá học khác nhau nên tính chất sinh học của chúng cũng rất khác nhau. - Vitamin E: là chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit và phân bố khắp nơi trong tế bào, nó được coi như là chất bảo vệ của các màng sinh học do khả năng ngăn cản quá trình peroxy hoá các axit béo chưa bão hoà của màng. Vì tính chất ưa lipit nên vitamin E có thể liên kết mật thiết với phần hydrocacbon của các axit béo chưa bão hoà nối đôi, do đó có thể tiếp cận gần vị trí của quá trình peroxy hoá và dập tắt chuỗi phản ứng. 33 Một điều đáng chú ý là vitamin E chỉ phát huy tác dụng khi cơ thể đủ selen. Selen có tác dụng hoạt hoá vitamin E. Hoạt tính chống oxy hoá của vitamin E có liên quan mật thiết với những chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit ở huyết tương và hồng cầu người trưởng thành [19]. - Vitamin C: Một trong những tác nhân chống oxy hoá của vitamin C là đưa vitamin E từ dạng oxy hoá về dạng khử: Vit E (ox) + Vit C (kh) → Vit E (kh) + Vit C (ox) Hằng số tốc độ phản ứng khá lớn K=1,55.106 M-1giây -1. Cơ chế này giải thích cho sự ít thiếu hụt vitamin E ở người. Vitamin C còn có những tính chất chống oxy hoá khác ở môi trường nước như loại hydro peroxit. Nhưng tính chất này chỉ thể hiện nếu không có mặt của ion sắt. Nếu có mặt ion sắt (như uống thuốc sắt liều cao, vỡ hồng cầu gây tổn thương cơ) thì vitamin C sẽ có tính oxy hoá mạnh. Do đó, trong thực nghiệm người ta dùng hỗn hợp ion sắt và vitamin C làm nguồn sinh gốc tự do [35, 37, 40]. - Các flavonoit: flavonoit là một chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất là polyphenol. Những flavonoit có hoạt tính sinh học được gọi là bioflavonoit. Khi đưa flavonoit vào cơ thể, chúng sẽ triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự do mới bền vững hơn, không tham gia vào phản ứng dây truyền gốc và được coi là những "cái bẫy" để loại trừ các gốc tự do độc hại [17]. 34 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Đối tượng nghiên cứu II.1.1. Mẫu thực vật Mẫu cây Lược vàng được thu hái ở Thanh Hóa vào tháng 10/2008 và được TS Ninh Khắc Bản xác định tên khoa học là (Callisia fragrans), thuộc họ Thài lài (Commelinaceae). Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST. II.1.2. Phương pháp xử lý mẫu thực vật Mẫu cây Lược vàng được phơi khô trong không khí, rồi đem sấy ở khoảng 400 C, sau đó được xay nhỏ kích thước bằng hạt đậu tương. Mẫu cây được chiết trong dung môi metanol và nước. Chiết mẫu bằng phương pháp chiết siêu âm: cho mẫu lược vàng vào bình thủy tinh khoảng 2/3 bình rồi sau đó cho dung môi đến ngập mẫu, đưa bình thủy tinh vào trong máy siêu âm bên trong có chứa nước sao cho lượng nước trong máy siêu âm phải ngập mẫu trong bình. Chiết siêu âm trong khoảng 30- 45 phút sau đó cho dịch chiết ra bình nón. Làm như vậy khoảng 5-7 lần, ta sẽ thu được phần dịch chiết MeOH và nước. II.2. Phương pháp nghiên cứu II.2.1. Giới thiệu chung về phương pháp chiết II.2.1.1. Đặc điểm chung của quá trình chiết Chiết là quá trình tách và phân ly các hợp chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với nó. 35 II.2.1.2. Cơ sở của quá trình chiết pha lỏng Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai pha lỏng không hoà lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng. Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA = CA/ CB KA là hằng số phân bố. CA, CB là nồng độ các chất hoà tan trong chất lỏng A, chất lỏng B không tan lẫn vào nhau. II.2.1.3. Quá trình chiết thực vật a) Chọn dung môi chiết Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các đặc điểm là cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcytrat, tributylphosphat- ... do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật. Cloroform, etanol và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất 36 này sẽ bị hoà tan đồng thời. Thường thì dung môi cồn trong nước dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 450C, với các hợp chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. b) Phương pháp chiết suất: Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết. Phương pháp cổ điển chiết xuất một dược liệu để nghiên cứu thăm dò là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu. Cách chiết thông dụng là chiết nóng bằng máy chiết liên tục (Soxhlet) hoặc chiết hồi lưu. Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi, cần làm khô dược liệu rồi mới tiếp tục chiết với loại dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán được sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết. - Trong phân đoạn chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các hydrocacbon béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như chất béo, caroten, các sterol, các chất màu thực vật, clorophyl. - Trong dịch chiết cloroform sẽ có mặt secquitecpen, ditecpen, cumarin, quinon, các aglycon do glycozit thủy phân tạo ra, một số ancaloit bazơ yếu... - Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ancaloit, flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin. - Trong dịch chiết nước sẽ có mặt các glucozit, tanin, các đường, các hợp chất hydratcacbon phân tử vừa như pectin, nhầy, gôm, các protein thực vật và các muối vô cơ. - Khi chiết lấy toàn bộ thành phần dược liệu thì dung môi thích hợp nhất là cồn (metanol hoặc etanol) 80%. Metanol được xem là dung môi đa năng, 37 nó hòa tan được các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo cầu nối hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch cồn đem bốc hơi dung môi sẽ được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng một dãy dung môi không hòa tan lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: ete dầu hỏa, ete, cloroform, etylaxetat, butanol. Hòa tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết, lần lượt chiết bắt đầu là ete dầu hỏa đến ete, cloroform, etylaxetat và cuối cùng là butanol. Dịch chiết mỗi phân đoạn đem cất thu hồi dung môi và phân tích riêng. Cách chiết: Có hai cách chiết xuất: chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng. Mỗi cách chiết có dung môi và thiết bị riêng. - Hai cách chiết thông thường ở nhiệt độ thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn. Phương pháp ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết được nhiều hoạt chất và ít tốn dung môi. - Chiết nóng: Nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu. Nếu dung môi là nước thì sắc hoặc hãm phân đoạn. Dụng cụ chiết liên tục là bình Soxhlet. Nếu chiết nóng hồi lưu thì nên chiết phân đoạn ít nhất là 2 lần để chiết hết hoạt chất. II.2.2. Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất II.2.2.1. Các phương pháp sắc ký để phân lập các chất từ dịch chiết * Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký: Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tùy vào tính chất của 38 chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, độ phân cực...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến các lớp pha tĩnh khác sẽ xảy ra việc lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả các hợp chất có ái lực lớn hơn đối với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có ái lực yếu hơn đối với pha tĩnh này. Nhờ đặc điểm này mà ta có thể tách các chất ra khỏi nhau qua quá trình sắc ký. * Cơ sở của phương pháp sắc ký: Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir: n = nα bC/(1 + bC) Trong đó: n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng. nα - Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. b - Hằng số. C - Nồng độ của chất bị hấp phụ. * Phân loại các phương pháp sắc ký: Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn. Theo trạng thái tập hợp của pha động chia sắc ký thành hai nhóm lớn là: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký lại được chia thành nhiều cách khác nhau. 39 a) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 105715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ, dần đến khi hiện màu. b) Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 368nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. c) Sắc ký cột Là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, trong đó chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các hạt silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30- 50µm, Fujisilisa Chemical Ltd.). Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại). Độ mịn của chất hấp phụ là rất quan trọng vì nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ, độ mịn của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp lực trọng trường không đủ lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc cột, dung môi không chảy được, khi đó người ta phải sử dụng áp suất như phương pháp MPC (áp suất trung bình), HPLC (áp suất cao áp). 40 Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô-Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột, dùng dung môi chạy cột và chạy đến khi cột trong suốt. - Cách 2: Nhồi cột ướt-Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó, đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải chú ý không để có bọt khí bên trong (nếu có bọt khí sẽ gây ra hiện tượng chạy rối trong cột và làm giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gãy, rò. Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa đường kính (D) và chiều dài cột (L) thể hiện khả năng tách của cột, L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào từng hỗn hợp cụ thể. Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất thì giá trị này thường khác nhau, dựa vào đặc điểm này để tách các chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp khoảng 1/5-1/10, còn nếu tách tinh thì cao hơn và phụ thuộc vào hệ số tách (tức là Rf) mà hệ số này trong khoảng 1/30-1/20. Việc đưa chất lên cột được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel, làm khô hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách tinh có thể đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan trong lượng tối thiểu dung môi chạy cột rồi đưa lên cột. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách, nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách, nếu quá chậm sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tốc độ công việc. 41 II.2.2.2. Các phương pháp hoá lý để xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh... a) Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên. b) Độ quay cực [α]D Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. c) Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng, phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây: - Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV. - Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ. 42 Phổ ESI-MS được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ FAB-MS (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) phổ bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được các pic ion phân tử. - Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. - Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với phổ khối lượng khác như: GC-MS (sắc kí khí-khối phổ), LC- MS (sắc kí lỏng-khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). d) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectro- scopy, NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lí chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học(chemical shift, δ). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). - Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-12ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất. 43 - Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-240ppm. - Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. - Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: - Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quanturm Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. - Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần tử được nối ghép lại với nhau. - Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác trong không gian phần tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. - Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử. 44 Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác. e) Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hyroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700-1750cm-1. 45 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM III.1. Dụng cụ, thiết bị và hoá ch