Luận văn Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (canscora lucidissima) họ long đởm (gentianaceae) ở Cao Bằng

hất xanthon (1-hyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (11); 1-hyđroxy-3,7,8- trimethoxy xanthon (17) và 1,8 - đihyđroxy - 3,5- đimethoxy xanthon (49) tách từ loài thực vật Canscora lucidissima có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc rối loạn nhịp tâm thất và thời gian phát bệnh, bảo vệ bệnh thiếu máu cơ tim cục bộ gây ra bởi rối loạn nhịp tim, làm giảm tổn thương cơ tim (thí nghiệm nghiên cứu được thử nghiệm trên cơ thể chuột cống) [23], [24]. 1.6. Những nghiên cứu và ứng dụng cây xuyên tâm thảo trong nƣớc Ở Việt Nam hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo, ngoại trừ một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây như: Cây có tác dụng kháng viêm rất tốt được dùng để điều trị viêm gan, vàng da, đau dạ dày, đòn ngã ứ máu, giảm đau, rắn cắn, chữa bệnh tim [40], [43]. Ở nước ta theo kinh nghiệm dân gian, đã từ lâu cây được sử dụng làm thuốc chữa bệnh và một số bài thuốc cụ thể từ cây xuyên tâm thảo là: 1. Chữa đinh nhọt, rắn cắn: Cây tươi một nắm, rửa sạch, giã nát đáp vào nơi sưng đau, vết cắn và thay mới 2 lần/ngày. 2. Đau do va đập (đòn ngã ứ máu): Cây tươi một nắm, giã nát, sao nóng đắp vào chỗ đau và vắt lấy nước cốt hoà với nước sôi để nguội uống 1cốc/ lần, 3 lần/ ngày hoặc ngâm rượi uống 1 ly nhỏ/ 1lần, 3 lần/ ngày, uống sau bữa ăn. 3. Đau bụng kinh, rối loạn kinh nguyệt, máu cam: Cây khô 10-15 gam/ ngày sắc nước uống, nếu cây tươi dùng lượng gấp đôi. 4. Chữa bệnh tim: Cây khô 10-15 gam / ngày đun nước uống hàng ngày mỗi đợt điều trị uống từ 1-2 tháng. Ngoài ra nhân dân còn dùng cây để sắc nước uống hàng ngày có tác dụng thanh nhiệt, giải độc và khi cơ thể mệt mỏi, ăn uống kém. Liều dùng 10- 15 gam cây khô/ ngày. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 CHƢƠNG 2 PHẦN THỰC NGHIỆM Cây xuyên tâm thảo là cây thuốc được sử dụng trong y học dân gian Việt Nam để chữa trị một số bệnh như ho do phế nhiệt, thanh nhiệt, giải độc, đinh nhọt, rắn cắn, đau ngực, đòn ngã ứ máu, chữa bệnh tim [38]. Ở nước ta chỉ có một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây, còn những hiểu biết về thành phần hoá học của cây này hầu như chưa được nghiên cứu, thậm chí cây xuyên tâm thảo còn chưa có tên trong các sách cây thuốc ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi chọn cây xuyên tâm thảo làm đối tượng nghiên cứu. Nhiệm vụ của luận văn là phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số chất trong cây xuyên tâm thảo thu hoạch ở Cao Bằng bằng các phương pháp vật lý, hoá học hiện đại. 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu. Nguyên liệu để nghiên cứu là toàn bộ cây phần trên mặt đất của thực vật xuyên tâm thảo. Mẫu cây tươi được thu hái vào tháng 10/2009 tại huyện Quảng Uyên tỉnh Cao Bằng. Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đã được TS. Lê Ngọc Công (khoa Sinh trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) giám định có tên khoa học là Canscora lucidissima Hand – Mazz. Ngoài ra còn có tên gọi theo địa phương là xuyên rim, xuyên tim. Bộ phận mẫu được hong khô ở nơi thoáng mát, sau đó sấy ở nhiệt độ 50 0 C- 60 0C tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, dịch chiết được thu gom lại và cất cô bằng máy cất quay với áp suất giảm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, xác định khối lượng cặn chiết thu được. Sau đó thêm nước vào cặn rồi lần lượt chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: n-hexan, etyl axetat, n-butanol. Phần còn lại là cặn tiếp tục được cô cạn rồi hòa tan vào metanol. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất thấp, thu được các cặn thô. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp hoặc tách trên sắc ký cột lặp lại nhiều lần v.v... để được chất tinh khiết. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết cây xuyên tâm thảo Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây xuyên tâm thảo chúng tôi phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm: - Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột thường. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các tính chất vật lý đặc trưng như: Màu sắc, dạng thù hình, R f, điểm nóng chảy v.v... khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR), các kỹ thuật phổ một chiều (1D-NMR) và phổ hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng hay dùng trong phân tích đều phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí cột được tiến hành trên cột với chất hấp phụ silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 – 0,063 mm) Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM: STT Hệ dung môi Tỷ lệ thể tích Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (9:1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (1 : 1) hệ C 4 Clorofom - MeOH (9 : 1) hệ D 5 Clorofom - MeOH (5 :1) hệ E Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng = 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 5% trong dung dịch etanol, sấy ở trên 100oC hoặc thử bằng hơi iođ, amoniac, sau đó quan sát màu để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai theo biểu thức: Chiều dài di chuyển chất thử Rf = Chiều dài di chuyển của dung môi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam). - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (khoa Hoá trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO. - Phổ ESI-MS (Phổ khối với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD (Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) 2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50-600C dưới áp suất thấp. Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, n-butanol, metanol. Các dịch chiết phân đoạn, được làm khô bằng Na2SO4 khan, sau đó cất đến hết hoàn toàn dung môi ở áp suất giảm, thu được các cặn chiết tương ứng. Việc thu nhận các dịch chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo được tiến hành theo sơ đồ 2.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo ( Canscora lucidissima Hand - Mazz ) Mẫu khô nghiền nhỏ Cặn n- hexan (C.H) Cặn tổng metanol CH.1 Etylaxetat 1. MeOH 2. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm + H2O Lắc chiết phân đoạn n-hexan Sắc kí cột Sắc kí cột n-butanol Cặn Etylaxetat (C.E) Cặn n- butanol (C.B) CH.2 CH.3 CH.4 E1 E2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Như vậy từ cây xuyên tâm thảo sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là: C. H C. E C. B C.H: Cặn chiết n- hexan C.E: Cặn chiết etylaxetat C.B: Cặn chiết n -butanol của cây xuyên tâm thảo. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ các phân đoạn cây xuyên tâm thảo Mẫu thu vào tháng 10/2009 Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cặn chiết thu được (g) C. H C. E C. B Toàn bộ phần trên mặt đất của cây 850 15,0 18,0 10 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các steroit và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhyđric acetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 (đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch thuốc thử Wagner, nếu có nhiều kết tủa là phản ứng dương tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính. 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glycozit tim Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1. Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glycosit tim. 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính. 2.3.2.7. Định tính các đường khử . Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, hoà tan trong cồn, dung dịch thu được đem trộn với dung dịch thuốc thử Felinh theo tỉ lệ 1-1, đun sôi 2-3 phút. Nếu có kết tủa da cam của Cu2O thì chứng tỏ có mặt của đường. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.2 . Kết quả định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Toàn cây 1 Steroit Lieberman-Bourchard Màu xanh vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam - 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + 4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6])1% Xanh thẫm + 5 Cumarin Axit và kiềm Có kết tủa + 6 Glycozit tim FeCl3 trong CH3COOH + H2SO4đ Vàng nâu rõ + 7 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH _ 8 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Chú giải : + : Phản ứng dương tính. - : Phản ứng âm tính. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:  Vi khuẩn: Gr (-) Escherichia coli (thực khuẩn đường ruột).  Vi khuẩn: Gr (+) Staphylococcus auresu (tụ cầu vàng).  Vi khuẩn: Salmonella spp (thương hàn).  Vi khuẩn: Shigella spp (lỵ trực khuẩn). Vi khuẩn: Streptococcus pyogenes (liên cầu). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng pháp khuyếch tán trên giếng thạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây xuyên tâm thảo Dịch chiết Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch Escherichia coli. Staphylococcus auresu Salmonella spp Shigella spp Strepto coccus pyogenes ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính Cặn Tổng 18 + 22 + 17 + 20 + 19 + Ghi chú: ĐK : Đường kính Dấu (+): là phản ứng có hoạt tính Dấu (-) : là phản ứng không có hoạt tính 2.4. Phân lập và tinh chế các chất Các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng. Phân lập và tinh chế các chất từ cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n-hexan của cây xuyên tâm thảo chúng tôi đã thu được 4 hợp chất sạch dùng để xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 cấu trúc hoá học bao gồm: 1ancol no mạch dài, 1steroit và 2 xanthon. Từ dịch chiết etylaxetat phân lập được 2 xanthon sạch. 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo (C. H) Lấy 5g cặn chiết n-hexan đem tách trên cột silicagel pha thường có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi clorofom: n-hexan theo tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 -100% clorofom. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng = 254 nm -365 nm, phun thuốc thử vanilin 1 % - H2SO4 10% trong dung dịch etanol, sấy 5 phút trên 100oC hoặc thử bằng hơi iod, hơi amoniac, sau đó quan sát màu. Các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi thu được 4 chất sạch bao gồm 1ancol no mạch dài (CH.1), 1 steroit (CH.2) và 2 xanthon (CH.3, CH.4). 2.4.1.1. Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan : clorofom theo tỉ lệ (8:2) thu được tinh thể rắn, không màu, có khối lượng 7 mg, Rf A= 0,8, nhiệt độ nóng chảy 84÷850C. Phổ FT-IR (KBr), νmax (cm -1): 3288,77 (rộng); 2914,58; 2849,00 và 1467,97. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD),  (ppm): 3,57 (2H, t); 1,54 (2H, t); 0,88 (3H, t); 1,26 đến 1,3 ( 52H, m). 2.4.1.2.  - Sitosterol (CH.2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan:clorofom theo tỉ lệ (7: 3) thu được tinh thể hình kim, không màu, có khối lượng 10 mg, Rf B = 0,55 và nhiệt độ nóng chảy 138 ÷ 1400C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet H tại 0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 và Me-27); 0,83 (3H, t, 7.32 Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,6 (1H, m, H-3); 5,4 (1H, d, J= 5Hz, H-6). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 71,84 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,10 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d, C-24); 42,35 (s, C-13); 42,32 (t, C-4); 39,81 (t, C-12); 37,28 (t, C-1); 36,52 (s, C-10); 36,16 (d, C-20); 31,68 (d, C-8); 31,93 (t, C-7); 33,91 (t, C-2); 29,2 (d, C-25); 28,26 (t, C-16); 26,14 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 21,11 (t, C-11); 18,8 (q, C-26); 19,41 (q, C-19); 19,05 (q, C-27); 18,80 (q, C-21); 11,88 (q, C-29); 11,99 (q, C-18); 23.1 (t, C-28). 2.4.1.3. 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được khối rắn những tinh thể màu vàng nhạt. Khối chất rắn này tiếp tục được tinh chế lại trên cột silicagel cỡ hạt nhỏ 0,040 – 0,063mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, có khối lượng 25 mg, RfC = 0,84, nóng chảy ở 148÷149 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1): 3084,61 yếu; 2951,53; 2841,58; 1661,15; 1601,35; 1489,48. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3.86 (3H, s); 3,91 (3H, s); 3,99 (3H, s); 6,28 (1H, d, J=1,28); 6,30 (1H, d, J=1,69); 7,13 (1H, d, J =9,19); 7,32 (1H, t) và 13,23 (1- OH). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3); (δ ppm): 163,79 (C-1); 96,84 (C-2, CH); 166,37 (C-3); 91,97(C-4); 148,86 (C-5); 112,7 (C-6); 149,24 (C-7); 148,86 (C-8); 181,12 (C-9); 104,40(C-10); 157,09 (C-11); 150,96 (C-12); 115,70 (C-13); 55,14 (3- OCH3); 57,13 (7-OCH3) và 61,72 (8-OCH3). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.4.1.4. 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (CH.4) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (5:5) thu được tinh thể màu vàng. Tinh thể này, tách lặp lại trên cột silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (1:1), thu được những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, có khối lượng 35 mg, Rf C = 0,82, nóng chảy ở 173 ÷ 174 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1): 3084,61; 2976,60 yếu; 1661,15; 1576,28; 1497,20 mạnh. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3,83 (3H, d); 3,94 (3H, s); 6,25(1H, d, J =1,25); 6,40 (1H, d, J = 2,13) ; 7,11 (1H, d, J = 7,91); 7,19(1H, t); 7,67(1H, m) và 12,73 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3); (δ ppm): 163,07 (C-1); 97,35 (C-2); 166,50 (C-3); 92,48(C-4); 148,06 (C-5); 115,39 (C-6); 116,38 (C-7); 123,33 (C-8); 180,46 (C-9); 103,67 (C-10); 157,33 (C-11); 145,99 (C-12); 121,22 (C-13); 55, 68 (3- OCH3) và 56,18 (5-OCH3). 2.4.2. Cặn chiết etylaxetat (CE) Lấy 8 g cặn thô EtOAc tách trên cột silicagel pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm. Rửa giải cột bằng hệ dung môi metanol-clorofom với tỉ lệ tăng dần theo độ phân cực (0-100% metanol), dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng  = 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 10% trong dung dịch etanol, hơ nóng 5 phút trên 100oC hoặc hơ bằng hơi iod, hơi amoniac, sau đó quan sát màu. Các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi, thu được 2 xanthon kí hiệu E1 và E2. 2.4.2.1. 1,7-Đihyđroxy-3-methoxy xanthon (E1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi metanol - clorofom theo tỷ lệ 2:98 thu được chất rắn, màu vàng, có khối lượng 50mg. Lượng chất rắn này tiếp tục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 được tinh chế lại trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan : EtOAc theo tỷ lệ (1:1) thu được chất rắn vô định hình, màu vàng, khối lượng 10 mg, RfC= 0,72 và có nhiệt độ nóng chảy ở 273 0 C ÷ 275 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3363,95 vân tù; 3102,47; 1667,83; 1573,19 và 1502,83. PHổ 1H- NMR (500MHz, DMSO); (ppm): 3,89 (3H, s); 6,38 (dd, j=3,3; 2,3); 6,63 (dd, j=3,3; 2,3); 7,26 (t, j=6,40; 7,7); 7,32 (dd, j=1,57; 1,57); 7,56 (dd, j=1,57; 1,66) và 12,85 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO); (δ ppm): 162,49 (C-1); 97,02 ; (C- 2); 166,45 (C-3); 92,65 (C-4); 124,2 (C-5); 120,7 (C-6); 144,9 (C-7); 114,5 (C8); 180,41 (C-9); 102,96 (C-10); 157,08 (C-11); 146,21(C-12); 120,86 (C- 13) và 56,10 (3- OCH3 ). 2.4.2.2. 1,7-Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột metanol - clorfom theo tỷ lệ 5:95 thu được khối chất rắn, vô định hình. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silicagel, hệ dung môi rửa giải cột là metanol-clorofom theo tỷ lệ 2-98 thu được 13 mg chất rắn màu, màu vàng nâu, nóng chảy ở 237÷2400C, có Rf C = 0,66. Phổ FT-IR (KBr); νmax(cm -1 ): 3307,33; 3244,36; 1663,18; 1604,40 và 1566,07. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3,87 (3H, s); 3,94 (3H, s); 6,37 (1H, d, J=2,2); 6,55 (1H, d, J=2,2);7,13 (1H, s) và 7,39 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO); (δppm): 162,34 (C-1); 96,62 (C-2); 165,67 (C-3); 92,34 (C-4); 100,04 (C-5); 155,26 (C-6); 144,4 (C-7); 107,44 (C-8); 179,13 (C-9); 102,53 (C-10); 157,17 (C-11); 150,92 (C-12); 112,57 (C-13); 55,96 (3- OCH3) và 56,32 (6- OCH3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 CHƢƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một loại thực vật nào phải không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó. Vì thế trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được diệt men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo hai cách phổ biến sau. Cách 1: Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: Ete dầu hỏa hoặc n-hexan, clorofom, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv... Như vậy sẽ thu được các cặn chiết chứa các chất có độ phân cực tương tự nhau. Cách 2: Chiết cặn tổng bằng các ancol hay hệ dung môi ancol : nước, sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật xuyên tâm thảo được thực hiện theo cách 2 (sơ đồ 2.1) 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất trong các dịch chiết khác nhau Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3]. Kết quả xác định thành phần định tính một số nhóm chất cơ bản trong cây xuyên tâm thảo đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng này có thể nhận thấy trong cây xuyên tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 thảo có các chất cho phản ứng dương tính với các nhóm chất steroit, glicozit tim, đường khử, cumarin, polyphenol và flavonoit. 3.3. Phân lập và nhận dạng các chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây xuyên tâm thảo Các dịch chiết thu được từ cây xuyên tâm thảo là hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ. Việc tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp được thực hiện trên cột silicagel pha thường với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại một vài lần để thu được chúng ở dạng tinh khiết, đáp ứng yêu cầu xác định cấu trúc hóa học. Việc phân lập các chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1, dựa v. Các chất sạch có thể dùng để xác định cấu trúc hoá học bao gồm: Ancol no mạch dài, steroit và các xanthon. 3.3.1. Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) Tiến hành rửa giải cột sắc kí đối với cặn thô n-hexan thu được 7 mg chất rắn vô định hình, màu trắng, khối lượng 7 mg, RfA= 0,8, nóng chảy 84÷85 0C, tan tốt trong n-hexan. Phổ IR cho biết chất CH.1 có vân đặc trưng cho nhóm OH ở 3288,77cm -1; vân đặc trưng cho liên kết C-H no ở 2914,85 và 2849,00 cm-1 mạnh. Chứng tỏ trong phân tử CH.1 có chứa nhóm OH, CH no. Trong phổ 1