Luận văn Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây hàn the (desmodium heterophyllum) họ cánh bướm (papilionaceac)

m arundo donax, Mimosa hostilis [11] đã phân lập được chất N,N-Dimethyltryptamine, công thức phân tử C12H16N2, có điểm chảy rất thấp 48- 49 0 C, được xác định là chất có khả năng gây ảo giác, dễ bị lạm dụng như lạm dụng ma tuý, có độc tính cao. Bằng các phương pháp quang phổ tác giả đã xác định được cấu trúc hoá học của nó là: 4. N,N-Dimethyltryptamine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Từ các loài Desmodium pulchellum và Desmodium caudatum, tác giả Roseghini.M và các cộng sự đã phân lập được chất Bufotenine N-oxide, công thức phân tử là C12H16N2O2 , dạng tinh thể có nhiệt độ nóng chảy cao 214- 215 0 C. Bufotenine N-oxide còn được tìm thấy trong nọc của con cóc, trong nấm amanita và một số loài thực vật khác [12]. Cấu trúc được xác định là: 5. Bufotenine N-oxide Theo Cahill.W.M và các cộng sự [13], từ hạt cây Desmodium tiliaefolium đã phân lập được chất N-metyltryptophan, công thức phân tử C12H14N2O2 có khả năng tan trong H2O, C2H5OH nhưng không tan trong ete (C2H5)2O. Tác giả đã xác định được cấu trúc là: 6. N-metyltryptophan Một chất được xác định là có khả năng ức chế tăng trưởng ở thực vật, tên là N,N-Dimethyltryptophan, công thức phân tử C13H16N2O2, được tác giả Mandava.N đã phân lập từ loài Desmodium triflorum [14]. Dạng tinh thể tan trong C2H5OH, có điểm chảy cao: 243-245 0 C, cấu trúc hoá học là: 7. N,N-Dimethyltryptophan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.3.1.2. Các ancaloit không chứa dị vòng hay còn gọi là các bazơ amin Theo tác giả Yamaguchi và các cộng sự, phân lập từ cây Desmodium gangeticum được chất (N,N-Dimethylamino)acetophenone, công thức phân tử C10H13NO, có nhiệt độ sôi ở 130-132 0 C [15], có công thức cấu tạo được xác định là: 8. (N,N-Dimethylamino)acetophenone Từ loài Desmodium styracifolium, Yang J.et al,Yaoxue Xuebao đã phân lập được một amit mà cấu trúc của nó được xác định là 3-Acetamidodihydro- 4,5-dimethyl-2(3H)-furanone. Còn được gọi là Desmodilactone, công thức phân tử C8H13NO3, là chất có nhiệt độ nóng chảy tương đối thấp, 84-85 0 C [16] 9. 3-Acetamidodihydro-4,5-dimethyl-2(3H)-furanone Từ loài Desmodium triflorum, Konno.C cùng với các cộng sự đã phân lập được chất coryneine, công thức phân tử C11H18NO2 + , là chất được xác định có khả năng là một tác nhân kích thích giao cảm [17] 10. Coryneine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Theo Ranieri.R cùng với các cộng tác viên [18] đã phân lập được từ loài Desmodium tiliaefolium, được chất 3,4-Dimethoxy phenethylamine. Tinh thể kết tinh trong C6H6 hoặc ete petrol, công thức phân tử C10H15NO2. Có nhiệt độ nóng chảy ở 1240C, là chất có hoạt tính sinh học cao. Công thức cấu tạo được nhận dạng là một amin bậc nhất. 11. 3,4-Dimethoxy phenethylamine Theo các tác giả Ghosal.S. Bruhn, J.G và Ranieri.R.N, từ nguồn Desmodium tiliaefolium đã phân lập được chất Normacromerine, cấu trúc được xác định là N-Methyl-3,4-dimethoxy-hydroxy phenethylamine, công thức phân tử C11H17NO3 [19]. Normacromerine còn được phân lập từ các loài Coryphantha macromeris, Coryphantha calipensis và Dolichothele longimamma. 12. Normacromerine. N-Methyl-3,4-dimethoxy-hydroxy phenethylamine Được phân lập từ các nguồn Desmodium several, trichocereus candicans, trichocereus spachianus, tác giả Gven.K.C [20] đã tách được hợp chất N-Me, còn có tên là candicine, công thức phân tử C11H18NO + , được xác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 định là chất có khả năng ức chế hạch thần kinh, làm co mạch, ảnh hưởng đến hoạt động thần kinh, độc tính giống như nicotin, có cấu trúc được xác định là: 13. N-Me Theo tác giả Rondest.J và các cộng sự, hợp chất có tên 4-Hydroxy phenethylamine, công thức phân tử C8H11NO là chất được xác định là có khả năng giúp co mạch máu, là chất phổ biến ở sinh vật, được tìm thấy ở nhiều loại cây như: Desmodium và Magnolia, Pisum sativum, ở mô động vật đang phân huỷ, còn được tìm thấy trong nước tiểu của bệnh nhân bệnh parkison và trong nhiều loài cây khác [21]. Cấu trúc được xác định là: 14. 4-Hydroxy phenethylamine 1.3.1.3. Các ancaloit có bộ khung pirol Đại diện cho ancaloit khung pirol là chất Desmodimine, công thức phân tử C12H15NO4, được tác giả Yang.J.S và các cộng sự phân lập từ loài Desmodium styracifolium [22]. Bằng các phương pháp quang phổ đã nhận dạng được cấu trúc hoá học của nó là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 15. Desmodimine 1.3.2. Một số đại diện hợp chất flavonoit Từ thân và rễ loài Desmodium canum, tác giả Botta.B [23], đã phân lập được các hợp chất Desmodianone D và Desmodianone E, đều có cùng công thức phân tử: C26H28O6, cả 2 đều tồn tại dạng chất rắn vô định hình, chúng có phổ UV rất giống nhau nhưng có nhiệt độ nóng chảy khác nhau. Người ta đã phân lập và nhận dạng được chúng đều là các iso flavanon có vòng A giống nhau nhưng ở vòng B có các nhóm thế ở vị trí 4 , khác nhau. Botta. B đã đặt tên cho cho chúng là Desmodianone D và E với công thức cấu tạo tương ứng là: , 16. Desmodianone D 17.Desmodianone E Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Theo tác giả Ahluwalia.V, từ loài preferred genus name Desmodium, phân lập trong dịch chiết etylaxetat được chất 2',4',5-Trihydroxy-7-methoxy- 6-methylisoflavanone, công thức phân tử C17H16O6, tồn tại dạng tinh thể hình kim vàng nhạt [24] 18. 2',4',5-Trihydroxy-7-methoxy-6-methylisoflavanone Ngoài hợp chất trên, theo tài liệu [25] cũng từ loài preferred genus name Desmodium, các tác giả Bohlmann.F và Kalidhar.S.B đã tách được một iso flavanonol khác có công thức phân tử C20H20O6, dạng tinh thể hình phiến khi kết tinh trong C6H6, cấu trúc được nhận dạng là: 19. 3,4 , ,5.7-Tetrahydroxy-8-preylflavanone Năm 2003, từ loài Desmodium canum, tác giả Botta.B, đã phân lập được hợp chất 6-Methyltetrapterol A, có công thức phân tử C26H24O6 , là chất dạng bột vô định hình [26], bằng các phương pháp phổ hiện đại tác giả đã xác định được cấu trúc như sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 20. 6-Methyltetrapterol A Cũng năm 2003, tác giả Tasanuo.M.K và các cộng tác viên đã tách được từ loài Desmodium uncinatum [27] hợp chất được xác định là 6-(2,4- Dihydroxyphenyl)-2,3,6,7-tetrahydro-4-hydroxy-2-(1-methylethenyl)-5H-furo[3,2- g][1]benzopyran-5-one), (tên khác: Uncinanone B), công thức phân tử C20H18O6 và chất 2'-Me ether (Uncinanone C) công thức phân tử C21H20O6. Cấu tạo của Uncinanone Bvà C là: 21. Uncinanone B 22. Uncinanone C Theo các tác giả Mizuno.M và Lin.Y-L, từ thành phần của lá loài Desmodium oxyphyllum, đã phân lập được 4 chất dạng bột, cụ thể là Desmoxyphyllin B, có công thức phân tử C16H10O6; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 7-O-D-Glucopyrano side, có công thức phân tử C22H20O11 ; 5- hidroxy, có công thức phân tử C16H10O7, dạng bột màu vàng và 5-hidrroxy,7-0-D- glucopyranoside, công thức phân tử C22H20O12 cũng ở dạng bột màu vàng. [28]. Cấu trúc phân tử được xác định lần lượt là : 23. Desmoxyphyllin B 24. 5-hidroxy 25. 7-O-D-Glucopyrano side Từ loài Desmodium canum, tác giả Monache.G.D và các cộng sự [29]đã phân lập được 2 hợp chất là Desmodianone A, có công thức phân tử C26H28O6 và Desmodianone C, có công thức phân tử C26H30O6, cả 2 chất đều có tác dụng như một tác nhân kháng khuẩn. Nhờ các phương pháp phổ hiện đại, tác giả đã đưa ra công thức cấu tạo của 2 chất là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 26. Desmodianone A 27. Desmodianone C Theo tác giả Ueno.A từ loài Desmodium caudatum đã phân lập được chất Desmodol, chất dạng bột màu vàng có công thức phân tử C21H18O6 , có điểm chảy tương đối cao 281-2820C và từ loài Desmodium sequax,tác giả Khan.H đã phân lập được chất: Lanceolatin B. Công thức phân tử : C17H10O3, tinh thể kết tinh trong hỗn hợp C6H6/C6H12, có điểm chảy thấp hơn: 138-140 0 C.[30] 28. Desmodol 29. Lanceolatin B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Từ năm1973, trên tạp chí Soedin, tác giả Chernobrovaya.N.V thông báo đã phân lập từ loài Desmodium canadense, tách được 2 chất công thức được chỉ ra là 2''-O--D-Xylopyranosyl (tên khác:Homoadonivernite), công thức phân tử: C26H28O15 và 2''-O--D-Xylopyranosyl( tên khác: Desmodin), công thức phân tử: C26H28O14, cả 2 chất có điểm chảy tương đương 198-203 0 C [7]. Cấu trúc được xác định là: 30. Homoadonivernite 31. Desmodin 1.3.3. Một số đại diện nhóm dẫn xuất polyphenol Theo các tác giả Purushothaman.K.K, Brin.A.J và Kitagawa.I, từ loài Desmodium gangeticum, phân lập được 4 chất cụ thể là: Gangetin, công thức phân tử C26H28O5, tồn tại dạng tinh thể kết tinh trong hỗn hợp dietylete/hexan, chất có tên Gangetinin, công thức C26H26O5 , Desmodin có công thức phân tử C22H22O6 và 3-Me ether (Desmocarpin), công thức C16H14O5, dạng tinh thể không tan trong H2O và hexan, tan trong CH3OH, CH3COOC2H5 [31] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 32. Gangetin 33. Gangetinin 34. Desmodin 35. Desmocarpin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 CHƢƠNG II THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau: 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, clorofom, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol : nước. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật là cây hàn the (Desmodium heterophyllum - Papilionaceac) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1). 2.2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất ( thân, lá) của cây hàn the, thu hái vào tháng 11, 12 năm 2008 tại các bãi cỏ trong khuôn viên Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Thành phố Thái Nguyên. Cây hàn the (còn gọi là Sơn lục đậu) được các nhà khoa học ở khoa Sinh trường ĐHSP Thái Nguyên xác định có tên khoa học là: Desmodium heterophyllum, thuộc họ Cánh bướm- Papilionaceac. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm cả thân, lá được rửa sạch, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-500C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được cắt nhỏ và ngâm chiết trong etanol 90o ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 15 ngày, 1 ngày chiết dịch 1 lần. Sau khi cất loại dung môi bằng máy cất quay, áp suất thấp, nhiệt độ 50 0 C cặn được cô đến đặc dưới dạng xirô. Tiếp theo, cặn được lắc, chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom etylaxetat và n-butanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột nhồi silicagel với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch . 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây hàn the chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Cụ thể các phương pháp gồm: - Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột silicagel, dùng silicagel Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR, phổ 13C- NMR và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hoá chất loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển SKLM: 1. n-hexan – etylaxetat 85: 15 Hệ A 2. n-hexan – etylaxetat 20:80 Hệ B 3. clorofom – metanol 90:10 Hệ C 4. clorofom – metanol 30:10 Hệ D 5.n-butanol- axit axetic -nước 4:1:5 Hệ E 6. dung dịch HCl 2N Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 100 0 C . Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức: 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA–9200. chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Rf = Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6. 2.3. Các dịch chiết từ cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac) 2.3.1. Các dịch chiết Toàn bộ phần trên mặt đất của cây hàn the đã phơi khô ở nơi thoáng ít nắng to, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, clorofom, etylaxetat và n-butanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the đã thu nhận được 4 phân đoạn (4 loại cặn) là n- hexan, clorofom, etylaxetat và n-butanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (PH), cặn trong clorofom (PC), cặn trong etylaxetat (PE) và cặn trong n-butanol (PB). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac) Khối lƣợng nguyên liệu khô (g) Khối lƣợng cặn etanol tổng số (g) Khối lƣợng cặn chiết (g) n-Hexan Clorofom Etylaxetat n-Butanol 1150 220,4 40,07 24,45 20,28 49,28 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Xác định đƣờng khử. - Lấy 4-5 ml dịch chiết trong etanol ( cặn tổng) với 4-5 ml thuốc thử Felinh, đun sôi 2-3 phút, nếu có kết tủa da cam của Cu2O chứng tỏ có mặt đường. 2.3.2.2. Xác định định tính ankaloit. - Xác định bằng thuốc thử Dragendooc. Thuốc thử Dragendooc được chuẩn bị từ hai dung dịch sau: Mẫu khô cắt nhỏ Cặn n-hexan PH Cặn CHCl3 PC Cặn EtOAc PE Cặn n-BuOH PB PH1 PH2 PC1 PE1 1. Etanol 2. Cặn trong nƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hoà tan trong 40ml nước cất và 10ml axit axetic băng Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hoà tan trong 20ml nước cất. Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20ml axit axetic sau đó thêm nước đến 100ml là được thuốc thử Dragendooc. Nếu có mặt ancaloit thì thấy xuất hiện màu da cam sáng khi cho dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendooc. 2.3.2.3. Xác định định tính steroit - Phản ứng màu Libecman-Bơcsa. Thực hiện theo 2 cách: Cách 1: Thực hiện theo Ston: Cho vài ml dịch chiết tổng vào ống nghiệm, thêm vài giọt CH3COOH đặc và vài ml hỗn hợp (CH3CO)2O : H2SO4 (50:1). Màu thay đổi từ hồng sang xanh lá cây. Cách 2: Thực hiện theo Brietcoc: cho vài mg dịch chiết trong CHCl3, thêm vào 2 ml thuốc thử (CH3CO)2O : H2SO4 (20:1). Màu sẽ chuyển từ đỏ- hồng- xanh lá cây- chàm tuỳ thuộc vào các loai steroit. 2.3.2.4. Xác định định tính flavonoit - Phản ứng Xianidin: lấy 1 ml dịch chiết etylaxetat cho và ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đặc + 1 mảnh Mg, đun nhẹ, dung dịch chuyển sang màu hồng. - Phản ứng với NH3: chấm cặn dịch chiết etylaxetat vào mảnh giấy lọc rồi hơ trên lọ đựng NH3 đặc, màu vàng chỗ chấm đậm hơn chứng tỏ có flavonoit. 2.3.2.5. Xác định định tính poliphenol. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%: Lấy khoảng 1 ml dịch chiết etylaxetat phản ứng với FeCl3 1% , nếu phản ứng tạo ra màu xanh lục tức là dịch chiết có chất có gốc phenol. 2.3.2.6. Xác định định tính cumarin. - Cho vào 2 ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong etanol, ống 1 thêm 0,5 ml Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 NaOH 10%. Sau đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thuỷ đến sôi rồi làm lạnh. Thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất. Quan sát thấy chất lỏng ống 1 trong suốt hơn so với ống 2 và khi axit hoá bằng vài giọt HCl đặc nếu có kết tủa bông thì kết luận có cumarin. 2.3.2.7. Xác định định tính glycozit tim. - Phản ứng Kelle-Kiliani: Thuốc thử Kelle-Kiliani gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100 ml CH3COOH loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đặc + 1ml FeCl3 5% Lấy vài mg cặn dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch 1, lắc đều cho tan, thêm từ từ 1-2 ml dung dịch 2 theo thàmh ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu giữa 2 lớp chất lỏng. Không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với glycozit tim. 2.3.2.8. Xác định định tính saponin. - Sự tạo bọt: Cho vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N. Ống 2 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,1N. Cho vào mỗi ống 3-5 giọt dịch chiết tổng, lắc đều, để yên, quan sát. Nếu độ bền của cội bọt ống 1 bền hơn ở ống 2 chứng tỏ mẫu nghiên cứu có saponin tritecpen, ngược lại có saponin steroit. - Phản ứng màu Liberman: Dung dịch chiết + 2 ml (CH3CO)2O, lắc đều rồi cho từ từ H2SO4 đặc từ đáy lên, xuất hiện màu đỏ tím nếu có saponin. 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac) 2.4.1. Dịch chiết n-hexan Từ 25g cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the, kí hiệu (PH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n-hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat ( Cụ thể: hệ dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 môi n-hexan:etylaxetat lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90-10, 85-15…đến 0-100) Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được chất sạch. 2.4.1.1. Chất PH1 (Stigmasterol) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (95:5). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A,(n-hexan: etylaxetat 85:15), phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được chất rắn ở dạng tinh thể hình kim, không màu, khối lượng 25 mg. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 156-1580C, Rf = 0,8 trong hệ dung môi A. Tiến hành đo phổ chất PH1 và so sánh các thông tin phổ đo được chúng tôi thấy các thông số tương đương phổ của stigmasterol. 2.4.1.2. Chất PH2: Glycozit của stigmasterol Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (30:70). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B (n-hexan: etylaxetat 20:80), phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được 15 mg tinh thể dạng vô định hình màu trắng. Đo nhiệt độ nóng chảy được 288-2900C, Rf = 0,65 trong hệ dung môi B. So sánh các thông tin trên phổ 1H-NMR với phổ gốc, phân tích các dung dịch thuỷ phân và phần gennin với các chất mẫu ở phòng thí nghiệm chúng tôi kết luận chất PH2 là Stigmasterol.3--D- glucopyranozyl. 2.4.2. Dịch chiết Clorofom (PC1) - Từ 17,5 g cặn dịch Clorofom của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the, kí hiệu (PC1) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là etylaxetat : metanol với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat (Cụ thể là hệ dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 môi etylaxetat : metanol lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90-10, 85-15…đến 0-100). Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), thuốc thử phát hiện là vanilin 1% trong dung dịch metanol- H2SO4 5%. Kết quả: ở hệ dung môi rửa giải etylaxetat: metanol (70-30) Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi D (cloroform – metanol -30:10) và hệ E (4:1:5), thu được 10 mg tinh thể dạng bột màu vàng nâu. Rf = 0,65 trong hệ dung môi D, Rf = 0,45 trong hệ dung môi E. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 275-2780C. Tiến hành đo phổ 1H-NMR, kết quả cho thấy chất đo chưa được tinh khiết, chúng tôi thuỷ trong axit chất thu được, phân tích dịch thuỷ phân cho thấy có đường glucozơ, phần gennin cho phổ phù hợp với phổ 1H-NMR tương tự phổ của -sitosterol, từ kết quả đó chúng tôi dự đoán chất (PC1) là glycozit của -sitosterol. 2.4.3. Dịch chiết Etylaxetat (PE1) - Làm tương tự như các phần 2.4.1 và 2.4.2, từ 20,4 g cặn dịch chiết EtOAc đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat: metanol tăng dần theo độ phân cực (0-100% metanol), kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng ( 5-10ml/phân đoạn).Thuốc thử phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được khoảng 35 mg chất bột màu vàng. Lượng chất bột này được tinh chế lại trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat: metanol từ 97-3, 95-5, 90-10, 85-15. Kiểm tra cặn thu được bằng hệ dung môi C (cloroform : metanol – 90:10) và kiểm tra bằng hơi NH3 đặc, thu được 12 mg chất bột màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 271-274 0 C, Rf = 0,55 trong hệ dung môi C. - Tiến hành đo phổ chất bột vàng này thu được các thông tin phổ như sau: Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-1H). δ(ppm): 13,15 (1H, S, OH); 8,01 (2H, d, J= 8, H-2 ’ và H-6 ’ ); 6,90 (2H, d, J =10, H-3 ’ , H-5 ’ ); 6,26 (1H, S, H-6); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 6,76 (1H, S, H-3); 4,96 (1H, d, J= 11, H-1 ” ); 4,6 ( 1H, t, H-2 ” ); 3,82 (1H, m, H-6 ” ); 3,70 (1H, t, H-3 ’ ); 3,52 (1H, m, H-4 ” ); 3,45 (1H, m, H-5 ” ) Phổ 13C-NMR (DMSO-C13CPD): 163,78 (C-2); 103,8 (C-3); 181,88 (C-4); 160,31(C-5); 98,04 (C-6); 160,97 (C-7); 104,48 (C-8); 154,82 (C-9), 102,34 (C-10); 121,51 (C-1 ’ ); 128,69 (C-2 ’ ); 115,71 (C-3 ’ ); 160,98 (C-4 ’ ); 115,71 (C-5 ’ ); 160,98 (C-6 ’ ); 73,38 (C-1 ” ); 70,84 (C-2 ” ); 78,59 (C-3 ” ); 70,53 (C-4 ” ); 81,62 (C-5 ” ); 61,14 (C-6 ” ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 CHƢƠNG III THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên trong cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac) Trước khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của các chất hợp chất hữu cơ thiên nhiên có trong thực vật, việc đầu tiên là phải thử định tính để nhận dạng các nhóm chất. Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học có trong thực vật, thuốc thử thường dùng là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng đối với mỗi nhóm chất, cụ thể đã được mô tả ở phần 2.3.2. Kết quả thử định tính các nhóm chất trong cây hàn the (Desmodium heterophyllum) như sau: Bảng 3.1: Phát hiện các nhóm chất trong cây hàn the STT Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tƣợng Kết quả 1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ 2 Ankaloit Dragendooc Màu vàng da cam + 3 Steroit Libecman-Bơcsa Từ hồng đến xanh lá cây ++ 4 Flavonoit Xianidin Từ vàng da cam, đến hồng, đến đỏ ++ NH3 đặc Màu vàng đậm hơn ++ 5 Poliphenol FeCl3 1% Màu xanh lục ++ 6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì - 8 Saponin Liberman Màu đỏ tím ++ Tạo bọt Bọt bền trong kiềm ++ Ghi chú: D