Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bán hạ ba thùy (typhonium trilobatum, araceae)

giá trị này rất có ý nghĩa vì việc phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 thành phần axít petroselinic có trong dầu thực vật là rất khó khăn và việc phân lập metyloleat cũng như metylpetroselinat bằng sắc ký không phải là việc làm dễ dàng hơn nữa phân giải lipit cũng không phải là phương pháp thích hợp cho việc xác định các axít béo có liên kết đôi nằm gần nhóm R-cacboxy (COOR). Bảng 1.5. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) từ phổ 13C-NMR của dầu hạt Cà rốt [26]. Nguyên tử C Độ dịch chuyển hóa học Cường độ Nguyên tử C Độ dịch chuyển hóa học Cường độ C-1 SU 173,16 0,70 Allylic P8 27,29 10,11 P 173,05 3,39 O,L 27,26 4,89 SU 172,76 1,11 27,23 P 172,66 1,01 27,21 P5 26,83 8,57 C-2 SU 34,21 2,12 L11 22,67 1,71 P 34,11 2,18 SU 34,05 1,67 Olefinic P7 130,54 9,31 P 33,95 6,81 L13 130,19 1,59 O10 130,01 1,73 C-3 SU 24,90 3,03 L9 129,97 24,87 129,95 P 24,53 7,23 O9 129,7 1,19 24,51 129,68 P6 128,94 8,50 L10 128,12 1,33 L12 127,92 1,38 Ghi chú: S là hợp chất no; U là hợp chất không no không phải là axit petroselinic; P axit petroselinic; O axít oleic; L axít linoleic. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 1.3.4 Các axit béo polyenoic và este Thông thường các hợp chất axit béo polyenoic tự nhiên có những nhóm metylen (CH2) chia cắt giữa các nối đôi. Người ta đã chia các axít polyenoic này thành các nhóm khác nhau, tuỳ thuộc vào vị trí của nối đôi đầu tiên so với nhóm metyl (CH3) cuối. Các nhóm thường gặp nhất là (n-3) và (n-6) tương ứng với các axít -linoleic và linolenic. Hệ thống polyen càng dài thì càng dễ dàng nhận biết các tín hiệu của các nguyên tử C ở một hoặc cả 2 đầu mạch. Tất cả các axit polyenoic (n-3) và este đều có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -5 (bảng 1.6) và tất cả các hợp chất axít polyenoic (n-6) và este có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -8 (bảng 1.6). Các hợp chất axit polyenoic và este với nối đôi đầu tiên có vị trí C như nhau cũng chỉ ra được một số tính chất chung (xem tín hiệu của các nguyên tử C1x -8 trong axít và este 6 ở bảng 1.6). Điều này cho thấy trong axit polyenoic và este có sự ngăn cách của nhóm methylen (CH2) giữa những nối đôi dạng cis và ta có thể xác định được vị trí của nối đôi ngoài cùng so với nhóm cuối. Trong các phổ 13C-NMR của dầu thực vật tín hiệu của các nguyên tử C 1-3 cho ta biết thông tin về sự có mặt, thành phần % của các este (n-9), no (thường là không tách được), (n-6), (n-3) và (n-7) thông qua độ dịch chuyển hoá học và cường độ píc của các nguyên tử C đó phần lớn là những este của axít -linoleic và linolenic (bảng 1.7). Bảng 1.6. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong phổ 13C-NMR của polyenoat este n -3, n-6 và 6 [26]. n-3 n-6 6 8 - 25,7 C-1 174,1 7 - 127,6 C-2 34,0 6 - 130,4 C-3 24,6 5 25,6 27,3 C-4 29,1 4 127,1 29,4 C-5 26,9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 3 132,0 31,6 C-6 129,6 2 20,6 22,6 C-7 128,3 1 14,3 14,1 C-8 25,6 Những hợp chất có các nối đôi nằm gần nhóm R-carboxy (COOR) hơn phần nhiều là có ở lipit động vật và dầu cá, tuy vậy cũng có một vài loại dầu thực vật như dầu hoa Ngọc Trâm, Borage,... có chứa axit -linoleic và một vài axit polyenoic với nối đôi 5 [25], [26]. Bảng 1.7. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C 1-3 của một vài axít và este [25]. C no n-9 n-7 n-6 n-3 8:0 10:0 1 - 14,13 - 14,09 14,29 14,09 14,12 2 - 22,60 - 22,71 20,57 22,63 22,69 3 31,95 - 31,83 31,55 - 31,69 31,90 Bảng 1.8. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) và cường độ tín hiệu từ phổ 13 C-NMR của dầu thực vật Borage [48] C Axit (ppm) Cường độ C- Allylic (ppm) Cường độ C-1 SU 173,19 4,39 Đơn 27,49 0,25 G 173,02 0,85 27,22 23,21 SU 172,78 2,30 G5 26,86 4,68 G 172,62 1,62 Kép 25,92 0,24 25,65 17,67 C-2 SU 34,19 4,52 25,25 0,30 G 34,04 10,57 25,07 0,26 SU G 33,91 2,06 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 C-3 SU 24,87 11,67 G 24,50 3,68 Olefinic G13 130,42 4,27 G10 128,44 3,89 L13 130,18 7,91 G7 128,34 4,39 O10 129,97 7,43 L10 128,08 7,70 L9 129,89 2,21 G9 128,01 3,80 129,82 1,48 L12 127,90 7,08 O9 129,69 3,51 G12 127,58 3,77 G6 129,46 4,23 Ghi chú: S no; U không no trừ axit -linoleic; G axit -linoleic; O axit oleic; L axit linoleic; Đơn C-allylic cho 1 nối đôi; Kép C-allylic cho 2 nối đôi. Kết quả phân tích dầu thực vật Borage được liệt kê ở bảng 1.8. Axit - linoleic có thể nhận biết được từ tín hiệu của các nguyên tử C1-3, của C-5-allylic và 6 tín hiệu của các nguyên tử C olefin của 3 axit G9, G10 và G12 (G: axit -linoleic) được xuất hiện như những vạch kép đối với chuỗi và . Những kết quả này cũng được sử dụng bằng phương pháp tương tự để nghiên cứu thành phần axit petroselinic, và thành phần % của axit -linoleic là 27% (Từ cường độ tín hiệu píc C-1) và 24% (từ C-3). Hàm lượng của axit này đạt tới 16% trong chuỗi và 41% của chuỗi . Wollenberg cũng chỉ ra rằng nếu từ phổ 13C-NMR người ta thu thập các số liệu ở những thời gian phục hồi thích hợp trong khoảng 5-10 giờ thì những mạch acyl 9 ( oleat, linoleat, -linoleat) có thể xác định từ cả các tín hiệu của C-1 và các tín hiệu của nguyên tử C olefin thích hợp, ví dụ như trên cơ sở của tín hiệu nguyên tử C-1 thì trong dầu lúa mạch thành phần axít oleic chiếm 27% còn thành phần axít linoleic chiếm 57% [59]. Những giá trị này hoàn toàn phù hợp với kết quả thu được bằng phương pháp phân tích GC (27, 4 và 57,7%). Từ những số liệu của phổ 13 C-NMR Wollenberg đã tính được tỷ lệ phân bổ của những axít này giữa mạch và của oleat este là 66/34 và của linoleat este là 59/41. Những kết quả tương tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 cũng đã được rút ra từ tín hiệu olefin của dầu lạc (các kết quả chỉ đúng cho các axít béo không no) [60]. 1.3.5 Các axit béo không no và este khác Chúng ta ít gặp những axít béo có chứa nhiều nối đôi liên hợp trong tự nhiên hơn so với những axít cùng loại nhưng nhưng các nối đôi của chúng bị xen kẽ bởi các nhóm metylen (CH2). Tuy nhiên người ta cũng đã biết một số axít béo có nhiều nối đôi liên hợp như các axít octadecatrienoic với các nối đôi 9,11,13 và 8,10,12 và có cấu hình cis, trans khác nhau. Trong những trường hợp này người ta dễ dàng xác định được cấu hình của nối đôi ngoài cùng là cis hoặc trans dựa vào độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C allylic. Hai mạch trien khác nhau cũng có thể nhận biết được thông qua độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C 1-4 của chúng. Những kết quả nghiên cứu trên cũng có thể áp dụng để xác định các axít acetylenic và allenic. Độ dịch chuyển hoá học cho acetylenic là 80, 2 ppm và nguyên tử C propargylic là 18, 8 ppm có sự khác biệt rất lớn so với độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C olefin và C allylic trong cả 2 cấu hình cis và trans. Đối với nguyên tử C allenic có độ dịch chuyển hoá học vào khoảng 91, 204 ppm và 91 ppm, nhưng cả khối 3 nguyên tử C này ít ảnh hưởng đến nguyên tử C của nhóm metylen (CH2) liền kề (29,1 ppm) còn độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C của nhóm CH2 bên cạnh cis-olefin là 27, 2 ppm và trans-olefin là 32,6 ppm , nguyên tử C của nhóm CH2 liền kề với liên kết 3 là 18,8 ppm [13], [14], [26], [28], [29], [36], [37]. 1.3.6 Axit cyclopropen và este Những axit này có trong dầu hạt gòn (gạo), hàm lượng vào khoảng 12% còn trong dầu hạt bông chỉ có vào khoảng 1%. Dầu hạt gòn có một số tín hiệu được xác định là của 2 axit sterculic và malvanic. 38. 38.a. n = 7 Axit sterculic 38.b n = 6 Axit malvanic OH O ( )n Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý được liệt kê trong bảng 1.9. Từ những cường độ píc đó ta có thể xác định được tỷ lệ % của 2 axít trên trong dầu hạt gòn [26]. Bảng 1.9. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C từ phổ 13C-NMR của sterculic và malvanic este [26]. C (S) (M) C Tỷ lệ (S/M) C-7 27,37 27,43 C-6 28/77 C-8 26,01 25,96 C-7 38/62 C-9 109,20 109,11 C-8 26/74 CH2 7,42 CH2 C-10 109,47 109,56 C-9 26/74 C-11 26,07 C-10 C-12 27,37 27,43 C-11 28/77 1.3.7 Các axit béo bị oxi hoá và este Các phổ 13C-NMR của hydroxy, oxo, epoxy và furanoit axit và este cũng đã được nghiên cứu. Dưới đây là những kết quả nghiên cứu về dầu Hải ly và dầu hạt Vernonia galamenis. Trong dầu Hải ly axit ricinoleic (12-hydroxyoleic) có hàm lượng rất cao (98%). Những tín hiệu đặc trưng cho glyceroleste của axit này dễ dàng được xác định tương ứng với 7 nguyên tử C giữa C -8 và C -14: C-8 (27,38 ppm), C-9 (125,39 ppm), C-10 (133 ppm), C-11 (35,7 ppm), C-12 (71,44 ppm), C- 13 (36,85 ppm) và C -14 (25,73 ppm). Những tín hiệu nhỏ đi kèm gần với giá trị của nguyên tử C -12 là 71, 68 ppm và 71, 18 ppm cho biết sự có mặt của hydroxyaxit khác có hàm lượng nhỏ hơn chiếm vào khoảng 1,25% tổng tín hiệu của C -12 [31]. Tín hiệu của nguyên tử C 2 (22,63 ppm) đi kèm với các tín hiệu 22, 85 và 22, 40 ppm chiếm khoảng 1,25% tổng tín hiệu của nguyên tử C 2 [31]. Dầu hạt Vernonia galamenis có chứa axit vernolic (axit 12,13-epoxyoleic). Các độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C từ C8 -18 cũng rất đặc trưng, tuy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 nhiên có một vài tín hiệu không chắc chắn: C-8 và C -14 (27, 79 và 27,40 ppm), C- 9 (124,05 ppm), C-10 (132,4 ppm), C-11 và C -15 (26, 33 và 26,28 ppm), C-12 (57,05 ppm), C-13 (56,4 ppm), C-16/ 3 (31,77 ppm), C-17/ 2 (22, 61 ppm trùng với pic 2 của linoleate) và C -18/ 1 (14,01 ppm). So sánh cường độ píc của C - 16/ 3 với tổng cường độ píc 3 ta thấy hàm lượng của axít vernolic là 75% còn tính theo pic C -18/ 1 thì hàm lượng của nó là 70%. Đi kèm với 2 tín hiệu của 2 nguyên tử C epoxy (57, 05 và 56,40 ppm) là các tín hiệu 56,80; 56, 70 và 56, 10 ppm với tỷ lệ píc lần lượt là 0,7; 0, 6 và 0,5% cho thấy các epoxyaxit khác có hàm lượng nhỏ đi kèm. Sự có mặt của các axít béo no, oleate, linoleate cũng được xác định bằng các tín hiệu của các nguyên tử C 1-3 và C olefin cũng như C allylic. 1.3.8 Những nguyên tử C1 3 trong các gốc acyl và ankyl Độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C1 3 phụ thuộc vào những nhóm liên kết trực tiếp với nhóm acyl hoặc ankyl của mạch và các gi á trị của chúng được liệt kê trong bảng 1.10 và bảng 1.11. Những hợp chất acyl bao gồm các axít, methyleste, este mạch dài, glyceroleste, amit, nitril. Phần ankyl gồm các lớp chất sau: ancol, axêtat, este mạch dài v.v... Hai nhóm này cho độ dịch chuyển hoá học rất khác nhau. Trong một nhóm chất tuy rằng mức chênh lệch của độ dịch chuyển hoá học là nhỏ nhưng đó là sự khác nhau đáng chú ý. Trong những dẫn xuất của axít oleic và axít linoleic thì độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C olefin có độ chênh lệch không lớn [26], [27], [29], [30]. Đối với hỗn hợp của ancol và axetat ta sẽ nhận được 2 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3, còn hỗn hợp của axít, este và glyceroleste sẽ có 4 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3. O’connor và các cộng sự đã sử dụng sự khác nhau giữa các độ dịch chuyển hoá học này để nghiên cứu quá trình phản ứng với xúc tác enzym giữa axít và ancol. Tiến trình phản ứng được theo dõi thông qua sự giảm tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 61,1 ppm (tín hiệu của C -1 ancol) và sự tăng tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 64,3 ppm (tín hiệu của C -1 este) [45]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 1.10. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 trong phổ 13C-NMR của một số lớp chất mạch dài [26]. Hợp chất (C-1) (C-2) (C-3) Axit cacboxylic 180,62 34,25 24,8 Metyleste 174,05 34,17 25,12 Este mạch dài Acyl 173,94 34,48 25,06 Ankyl 64,39 28,70 25,98 Glyceroleste 173,27 34,07 24,90 172,86 34,24 24,94 Amit 176,37 36,02 25,57 Nitril 119,82 25,43 17,14 Ancol 63,01 32,81 25,78 Axetat* 64,64 28,67 25,97 * Độ dịch chuyển hoá học cho 2 nguyên tử C của nhóm CH3BCO là: 171, 14 và 20,97 ppm. Bảng 1.11. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 từ phổ 13C-NMR của hỗn hợp axít palmitic, metyloleat và glycerol tri -oleat [26]. C Axit Metyleste Glyceroleste C-1 179,69 174,28 173,23 172,82 C-2 34,12 34,10 34,07 34,23 C-3 24,77 25,01 24,91 24,93 1.3.9 Glycerol este Glyceroleste có 5 loại sau đây: 1- và 2-monoaxyl; 1,2-diaxyl; 1,3-diaxyl và triacyleste. Những nguyên tử C của glycerol trong mỗi loại este cho những tín hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 đặc biệt trong phổ 13C-NMR của nó và người ta có thể sử dụng để xác định, định lượng các thành phần trong hỗn hợp [25], [38]. Bảng 1.12. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C -glycerol trong phổ 13C-NMR của các axylglycerol [26]. O CDCl3 P CDCl3 S CDCl3 O và P CDCl3/CD3OD (2:1) 2-mono 72,12 74,97 74,70 75,36 1,2-di 72,83 72,25 72,06 72,40 1-mono 69,90 70,27 - 70,24 Tri 68,84 68,93 68,85 69,41 1,3-di 67,55 68,23 68,15 67,71 1-mono 64,64 65,04 - 65,58 1,3-di 64,73 65,04 64,96 65,36 1-mono 63,12 63,47 - 63,46 1,2-di 62,22 62,20 62,10 62,92 Tri 62,03 62,12 62,06 62,50 2-mono 61,02 62,05 60,90 61,06 1,2-di 60,74 61,58 61,37 60,82 Ghi chú: O = axit oleic; P = axit palmitic; S = Các axit no; Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử C của glycerin là: C- 63,66; C- 72,78 ppm. Trong trường hợp của các glyceroleste “đối xứng” (2-monoacyl; 1,3-diacyl và triacyleste) nó cho chúng ta 2 tín hiệu với tỷ lệ píc 2:1, còn trong trường hợp glyceroleste “không đối xứng” (1-monoacyl và 1,2-diacyleste) nó cho ta 3 tín hiệu píc với tỷ lệ 1:1: 1. Trong dung dịch chloroform một vài tín hiệu này rất gần nhau và có khi trùng lên nhau, đặc biệt là trong trường hợp một tín hiệu có cường độ lớn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 và một tín hiệu có cường độ nhỏ. Trong hỗn hợp dung dịch cloroform /metanol (2:1) chúng sẽ có độ phân giải tốt hơn [25], [26], (bảng 1.12). Rất nhiều dầu thực vật có chứa diacylglycerol và trong phổ 13 C-NMR của nó ta nhận thấy có 2 tín hiệu lớn của triacylglycerol và 2 tín hiệu nhỏ đi kèm của 1,3- diacylglycerol còn những tín hiệu của những isomer 1,2-diacylglycerol không thể nhận biết được trong phổ. Những diacylglycerol bền vững có thể là sản phẩm của sự isomer hoá, ví dụ: trong phổ 13C-NMR của dầu cọ có những tín hiệu ở 68,93 (cường độ píc 2,96), 68,35 (0,27), 65,05 (0,45) và 62,10 ppm (5,53) tương ứng vào khoảng 8,4% (mol) 1,3-diacylglycerol có trong dầu [26], [38], [60]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) còn có tên gọi là củ chóc, Lá ba chìa, Cây chóc chuột [4], là thực vật thân thảo, bụi (là một loại cỏ không có thân), có củ hình cầu, đường kính có thể to tới 2cm. Lá hình tim hay hình mác, hoặc chia ba thùy dài 4 đến 15cm, rộng 3,5 đến 9cm. Bông mo với phần hoa đực dài từ 5 đến 9mm, phần trần dài 17 đến 27mm. Quả mọng, hình trứng dài 6mm. Hình 2.1: Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Chúng mọc hoang ở những nơi đất ẩm hoặc được trồng làm cảnh, phân bố rộng khắp ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản … Bán hạ ba thùy còn là một vị thuốc [5] dùng theo kinh nghiệm dân gian để chữa: Chống nôn (phụ nữ có thai hoặc trong trường hợp viêm dạ dày mãn tính), trị ho, tiêu đờm, chữa nhức đầu, đau dạ dày mãn tính v.v... nhưng ít có những nghiên cứu về dược lý cũng như thành phần hoá học của nó kể cả ở trong và ngoài nước. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Nhiệm vụ của bản luận án này là phân lập các thành phần hoá học có trong cây Bán hạ và sử dụng các phương pháp phân tích vật lý, hoá học hiện đại để xác định cấu trúc hoá học của các chất sạch đã thu được. Hình 2.2: Hoa , thân , củ và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là thân, lá, rễ và củ khô của cây Bán hạ ba thùy, thu hái tại huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh tháng 7 năm 2007, được TS. Ninh Khắc Bản - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học – Viện KH&CN Việt Nam giám định tên khoa học là Typhonium trilobatum. Mẫu cây tươi thu hái về (củ được thái thành lát mỏng), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 110 0 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-60 0 C cho tới khi độ ẩm ≤ 10%. Mẫu khô thân được vò nhỏ, rễ và củ được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 96% ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ ≤ 50 0 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết. Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của cây Bán hạ đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v.... Sau đó sẽ tiến hành ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC, phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để khẳng định cấu trúc hóa học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 cũng đã được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ A 2. n-Hexan-etylaxetat (4:1) Hệ B 3. Chloroform-metanol (9:1) Hệ C 4. Chloroform-metanol (5:1) Hệ D 5. Chloroform-metanol (2:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun thuốc thử vanilin 1% trong metanol/H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C, để xác định các cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B,C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 - 0,063mm hoặc 0,1 - 0,16mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boëtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực [ ]D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - Viện KH&CN Việt Nam) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên thiết bị ESI-MS HP-1100 LS/MS Trap spectrometer. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 - Phổ GC/MS ghi trên máy HP-GC/MS Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CDCl3/MeOD, pyridin-D5. 2.3. Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.3.1 Các dịch chiết Thân, lá, rễ và củ cây Bán hạ ba thùy đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm nhiệt độ < 50 0C đến dạng cao đặc khô, xác định khối lượng cặn thô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxêtat, sau đó đuổi hết nước và chiết bằng metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ củ, rễ và thân lá cây Bán hạ ba thùy đã thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các cặn tương ứng được tóm tắt trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Mẫu chiết Dịch chiết Rễ, củ (RTt) 1700 gam Thân, lá (LTt) 450 gam n-hexan (H) RTtH: 19,7g LTtH: 8,6g Etyl axetat (E) RTtE: 15,4g LTtE: 8,8g Metanol (M) RTtM: 100g LTtM: 100g Quy trình ngâm chiết mẫu được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu 2.4. Phân lập và tinh chế các chất từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.4.1. Dịch chiết n-hexan Từ 19,7 g cặn dịch n-hexan của củ, rễ cây Bán hạ ba thùy (Kí hiệu RTtH), được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n–hexan/ etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi etylaxetat (EtOAc) từ 0-100%, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được hỗn hợp các axit béo được xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 trên máy GC/MS (được so sánh với phổ chuẩn với độ trùng lặp ≥ 98% cao). 2.4.1.1. Các axit béo Các axit béo trong dịch hexan của Typhonium trilobatum được tiến hành phân tích trên máy GC/MS với ngân hàng dữ liệu phổ của các axit béo đã biết được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2 Các axit béo trong dịch n-hexan của cây Bán hạ ba thùy Stt Tên axit Ký hiệu Độ trùng lặp (%) 1 Axit hexadecanoic (axit palmitic) RTtH1 99 2 Axit 11,14-octadecadienoic RTtH2 99 3 Axit 9,12-octadecadienoic RTtH3 99 4 Axit cis-linoleic RTtH4 99 5 Axit docosanoic RTtH5 98 2.4.1.2. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol (RTtH6) Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi metanol thu dược 19mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi. RfA 100 = 64, nóng chảy ở 155-157 0 C, [ ] 25 D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr), νmax(cm -1 ): 3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS m/z, (%): 412[M + ](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5,14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3,49 (1H, m, H-3). Phổ 13 C -NMR (125MHz, CDCl3), (ppm): 36,5 (t, C-1); 29,67 (t, C-2); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 71,8 (d, C-3); 42,25 (t, C-4); 140,71 (s, C-5); 121,67 (d, C-6); 37,21 (t, C-7); 31,84 (d, C-8); 51,2 (d, C-9); 36,11 (s, C-10); 24,32 (t, C-11); 42,17 (t, C-12); 31,6 (s, C- 13); 56,83 (d, C-14); 25,38 (t, C-15); 31,6 (t, C-16); 55,9 (d, C-17); 12,01 (q, C-18); 18,95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21,03 (q, C-21); 138,3 (d, C-22); 129,3 (d, C-23); 50,01 (d, C-24); 33,9 (t, C-25); 21,19 (q, C-26); 19,79 (d, C-27); 28,89 (q, C-28); 12,22 (q, C-29). 2.4.1.2. -Sitosterol (RTtH7) Tiếp tục rửa cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxêtat (5:1), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra SKLM trong hệ B, kết tinh lại trong metanol thu được 17 mg chất rắn, tinh thể hình kim, không màu, hiệu suất 5,5.10 -3 %, RfB 100 = 43, nóng chảy ở 138-140 0C. Phổ FT-IR (KBr), νmax(cm -1 ): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H- 6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29