Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây cà phê chè (coffea arabica, rubiacea)

cơ thích hợp (chloroform, ete) rửa giải chúng ra khỏi cột, các bƣớc làm sạch tiếp theo thực hiện giống nhƣ trƣờng hợp bazơ-dung môi hữu cơ. 1.3.4. Phân loại các ancaloit quan trọng trong Y dƣợc theo khung cơ bản Theo hiểu biết ngày nay về các hợp chất ancaloit, thì thông thƣờng chúng là các chất quang hoạt. Trong số các đồng phân của chúng thì đồng phân quang học quay trái (L) có hoạt tính sinh học cao hơn rất nhiều so với các đồng phân quay phải (D). Sản phẩm raxemic của chúng thƣờng có hoạt tính nằm ở giữa đồng phân có hoạt tính cao hơn [2], [4], [21], [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 1.3.4.1. Ancaloit khung indol Trong số các ancaloit khung indol đƣợc sử dụng rộng rãi trong Y học là hợp chất physostigmin (tên khác: ezerin) thành phần chính (0,15%) trong hạt thực vật Physostigma venenosum (đậu Kalabar) N N CH3 CH3 CH3 H3CNHOCO 3.1 Physostigmin Physostigmin-salycilat là chất tinh thể rắn, không màu, không mùi vị cay nhẹ, trong không khí và dƣới tác dụng của ánh sáng nó chuyển sang màu đỏ, ít tan trong nƣớc (1:100), tan khá tốt trong cồn và chloroform (1:13,1:9),  25Dα = -89 đến -940. Physostigmin có hoạt tính kích thích phó giao cảm trực tiếp, nó ức chế men acetylcolinesteraza không cho phân hủy acetylcolin, đƣợc sử dụng chủ yếu trong điều trị mắt, làm giảm nhãn áp [4], [21], [26]. N H N HO O O N N O O OH O O H O 3.2 Vinblastin Một ancaloit khác khung indol đã đƣợc sử dụng để điều trị bệnh ung thƣ máu (máu trắng - lymphogranulomatosis) đó là hợp chất vinblastin, nó có hàm lƣợng rất thấp trong cây Dừa cạn (Vinca rosea) khá phổ biến ở Việt Nam [2], [36]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Trong một số loài của chi Ba gạc (Rauwolfia) nhƣ Rauwolfia verticillata và Rauwolfia serpentina cũng có chứa các ancaloit khung indol (reserpin và các dẫn xuất) đƣợc sử dụng trong y học, cả trong Tây y và Đông y. Nó có tác dụng hạ huyết áp, giảm hoạt động của hệ thần kinh trung ƣơng (an thần chữa động kinh và stress) và có tác dụng gây buồn ngủ. Nó có tác dụng làm giảm các catecholamin và serotonin từ các dây thần kinh của hệ thần kinh trung ƣơng. Các chất tinh chế từ rễ Ba gạc đã đƣợc sử dụng khá tích cực trong thời gian gần đây để điều trị cao huyết áp. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên động vật lại cho thấy nó có thể gây ung thƣ [4]. N N O C O OCH3 OR2 OCH3 OCH3 H H C O H3CO H R1 R3 R4 3.3 Tªn R1 R2 R3 R4 Reserpin (Rausedil) MeO Me H H Deserpidin H Me H H Syrosingopin MeO EtO-CO- H H Methoserpidin H Me MeO H Bietaserpin MeO Me H Et2-N-(CH2)2- 1.3.4.2. Ancaloit khung pyridin - (pyperidin) Các ancaloit trong tự nhiên thuộc nhóm này bao gồm các ancaloit quan trọng nhƣ: nicotin, arecolin, coniin, ricinin, lobelin, ... Các ancaloit nicotin, arecolin, coniin là các chất lỏng ở nhiệt độ phòng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Nicotin là một ancaloit tìm thấy trong một số thực vật họ Solanaceae, hàm lƣợng vào khoảng 0,6-3,0% trọng lƣợng thuốc lá khô. Nó đƣợc sinh tổng hợp trong thân rễ sau đó đƣợc tích tụ trong lá. Trƣớc đây, nó đƣợc sử dụng rộng rãi để trừ côn trùng bảo vệ mùa màng, và ngày nay các đồng đẳng của nó, ví dụ nhƣ: imidacloprid vẫn đƣợc sử dụng phổ biến với tác dụng tƣơng tự. Trong Y học nó đƣợc sử dụng để nghiên cứu khoa học là chủ yếu, đặc biệt đối với hệ thần kinh. Do nó đƣợc coi là tác nhân gây ra một số loại ung thƣ (ung thƣ phổi) nên phong trào từ bỏ thuốc lá đã đƣợc Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các Chính phủ trên thế giới ủng hộ mạnh mẽ [21]. N N CH3 3.4 Nicotin Arecolin là ancaloit dạng lỏng của quả cau (Areca nut, Areca catechu ) có thể tan trong nƣớc, cồn, ete, chloroform, ... Arecolin đƣợc biết nhƣ là tác nhân kháng acetylcolin trên các thụ thể phó giao cảm M1, M2 và M3 (gây co con ngƣơi mắt, phế nang phổi) và nó còn đƣợc sử dụng để trừ một số loại giun sán. N O OCH3 H3C 3.5 Arecolin Coniin là ancaloit rất độc (với nồng độ 0,2g/kg gây chết ngƣời) đƣợc tìm thấy trong cây Conium maculatum và một số loài họ Ráy nhƣ Arum maculatum, Arisarum vulgare, Amorphophallus rivieri, điểm sôi 166-167 0C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 NH 3.6 Coniin Lobelin là ancaloit dạng bột trắng rắn vô định hình tan trong nƣớc có trong các loài Lobelia inflata, Lobelia nicotianaefolia, Lobelia hassleri, Lobelia stallfeldii và trong một số loài Lobelia spp khác [21]. OH N O CH3 3.7 Lobelin Lobelin đƣợc sử dụng để hỗ trợ cai thuốc lá, cai nghiện ma túy ví dụ nhƣ cai nghiện amphetamin, cocain hay rƣợu. Trong cây Ricinus communis L., họ Thầu dầu, ngƣời ta đã phân lập đƣợc ancaloit ricinin dạng rắn có điểm nóng chảy 201 0C, tan trong nƣớc nóng. Độc đối với gan và có thể gây chết ngƣời [21]. N OCH3 CN CH3 3.8 Ricinin 1.3.4.3. Ancaloit vòng ngưng tụ pyrrolidin-pyperidin (khung tropan) Các ancaloit khung tropan bao gồm các chất chủ yếu nhƣ: atropin, hyoscyamin, homatropin, scopolamin, ... Các ancaloit này đƣợc sử dụng hết sức rộng rãi trong Y học, chúng là các chất ức chế phó giao cảm, làm giảm co thắt cơ trơn (mật, ruột, thận ...), giảm huyết áp, giãn con ngƣơi. Đây là các thuốc giải độc kích thích phó giao cảm [2], [37]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 N CH3 O O CH2OH C6H5 N CH3 O O CH2OH C6H5 O N CH3 O O CH2OH C6H5 3.9 (+/-)-Atropin 3.10 Scopolamin 3.11 (S)-Hyoscyamin 1.3.4.4. Ancaloit khung ruban (quinin, quinidin, cinchonin, cinchonidin) N HHO R N CH R = MeO Quinin R = H Cinchonidin CH2 N H R N CH CH2 H R = MeO Quinidin R = H Cinchonin 3.12 3.13 Các ancaloit tìm thấy trong cây Canh ki na, thuộc nhóm chất khung ruban, đó là các chất quinin, quinidin và một số chất khác, chúng là các chất tinh thể rắn, màu trắng có vị đắng. Các hợp chất này đã đƣợc sử dụng trong Y học từ thế kỷ XVII để điều trị bệnh sốt rét cho đến những năm 1940 sau khi ngƣời ta tìm ra các loại thuốc chống sốt rét khác thay thế. Ngoài ra, chúng còn là thuốc sát khuẩn, (antipyretic, fever-reducing), thuốc giảm đau (painkilling), chống viêm (anti-inflammatory). Quinin còn để điều trị bệnh luput (lupus), viêm khớp (arthritis)... 3.12b 3.12a 3.13a 3.13b Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 1.3.4.5. Ancaloit khung benzyl-isoquinolin Ancaloit nhóm này là một số ancaloit của cây Á phiện (Anh túc) gồm papaverin, laudanosin, noscapin, berberin, tetrahydropalmatin, ... Noscapin (còn gọi là Narcotin, Nectodon, Nospen, và Anarcotin) là benzylisoquinolin ancaloit tìm thấy trong thực vật họ Papaveraceae mà không có hoạt tính giảm đau. Noscapin là hoạt chất đƣợc sử dụng để điều trị ho. Ngoài ra nó còn thể hiện rất tốt những hoạt tính chống ung thƣ. Laudanosin hay N- methyltetrahydropapaverin cũng đƣợc phát hiện có trong thuốc phiện với hàm lƣợng khoảng 0,1%, lần đầu tiên phân lập đƣợc năm 1871. Nó có khả năng tƣơng tác với các thụ thể phó giao cảm. Papaverin cũng là một ancaloit của thuốc phiện nó có tác dụng điều trị làm dãn cơ trơn (dạ dày, ruột, mật, đƣờng tiết niệu, dãn mạch giảm đau tuần hoàn ngoại vi và tuần hoàn não. C2H5O C2H5O N OC2H5 OC2H5 N OCH3 OCH3 O CH3 N OCH3 O CH3 O O OCH3 3.14 Noscapin 3.15 Laudanosin 3.16 Papaverin Trong củ bình vôi (Stephania rotunda) thuộc chi Stephania, ngƣời ta đã phân lập đƣợc một ancaloit tetrahydropalmatin (THP) là thành phần chính. THP đƣợc sử dụng làm thuốc an thần (thuốc ngủ), ngoài ra nó còn đƣợc dùng để điều trị cai nghiện ma túy (nghiện cocain, thuốc phiện), ở Việt Nam nó có trong thành phần thuốc cai nghiện HEANTOS. Trong cây Hoàng đằng (Fibraurea tinctoria), họ Tiết dê (Menispermaceae), một ancaloit khung benzyl-isoquinolin cũng đã đƣợc phát hiện đó là hợp chất berberin. Hoạt chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 này có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, kháng kí sinh trùng. Gần đây, ngƣời ta còn thử hoạt tính của nó đối với các bệnh đái tháo đƣờng, giảm lƣợng cholesteron trong máu, chống ung thƣ, ... [4], [21]. O N O O O ON+ O O O HSO4 3.17 Tetrahydropalmatin 3.18 Berberin-sunphat 1.3.4.6. Ancaloit khung morphinan Morphin và các dẫn xuất của nó (codein, tebain, ...) là các ancaloit chính của cây Anh túc có thể coi chúng là các dẫn xuất của phenantren hoặc isoquinolin. Chúng đều là các hoạt chất giảm đau, morphin cho đến nay vẫn là một thuốc giảm đau tốt nhất, đặc biệt đƣợc sử dụng cho các bệnh nhân ung thƣ giai đoạn cuối, mặc dù nó là chất ma túy bị kiểm soát. Codein tuy không có hoạt tính giảm đau mạnh nhƣ morphin, nhƣng nó lại là một trong các thuốc giảm ho tốt nhất và vẫn đang đƣợc sử dụng điều trị [2], [4]. O OHHO N CH3 O OHH3CO N CH3 O OCH3H3CO N CH3 3.19 Morphin 3.20 Codein 3.21 Tebain 1.3.4.7. Ergot ancaloit (dẫn xuất axit lysergic) Các ancaloit dẫn xuất axit lysergic đƣợc phát hiện trong Nấm cựa gà [4], [21], [37] có thể gặp trên các vùng cao có trồng lúa mạch của nƣớc ta. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Ngƣời ta thu hái khi nấm bắt đầu chín và phơi khô ở 30-45 0C. Thành phần hoá học của nó gồm ergotasin, ergotamin, ergocornin là những hoạt chất rất mạnh mà với liều lƣợng thƣờng dùng làm co mạch các cơ trơn và cơ tử cung. Với liều cao, Nấm cựa gà rất độc, có thể gây nên hoại thƣ ở đầu ngón tay chân, cơ cứng mạch, mê sảng. N N O O OH R2 HN R1 O N NH CH3 C R1 = Me, R2 = Benzyl Ergotamin R1 = Me, R2 = -CH2-i.Pr Ergosin R1 = i.Pr, R2 = Benzyl Ergocristin R1 = i.Pr, R2 = -CH2-i.Pr Ergocryptin R1 = i.Pr, R2 = -i.Pr Ergocornin O 3.22 1.3.4.8. Ancaloit khung imidazol O C2H5 O N N CH3 3.23 Pilocarpin Trong nhóm ancaloit này, pilocarpin là ancaloit chính tìm thấy trong cây Pilocarpus jaborandi và Pilocarpus microphyllus ở Trung và Nam Mỹ quan trọng hơn cả. Nó đƣợc sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực điều trị nhãn khoa, đặc biệt là bệnh glôcôm (glaucoma) nó có tác dụng làm giảm nhãn áp [2], [4], [37]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 1.3.4.9. Ancaloit strychnin Strychnin là ancaloit trong hạt Mã tiền (Strychnos nux vomica), ở dạng tinh thể không màu, nó đƣợc biết đến là một trong những chất đắng nhất (có thể nhận biết độ đắng của nó ở nồng độ ≤ 1 ppm), độc tính cao (LD50 = 10 mg). N O N O H H H H 3.24 Strychnin Ngƣời ta sử dụng nó để trừ các động vật có hại mùa màng (chim, bộ gặm nhấm). Strychnin có tác dụng kích thích thần kinh trung ƣơng, co cơ mạnh (cường cơ strychnin). Nó là một trong những thuốc hồi sức tốt nhất thông qua tác dụng kích thích lên hệ thần kinh trung ƣơng tại trung tâm hô hấp và trung tâm vận mạch làm cho khả năng hô hấp và lƣu thông máu đƣợc tăng cƣờng [2], [4], [37]. 1.3.4.10. Ancaloit kháng sinh Ngoài các nhóm ancaloit dƣợc phẩm quan trọng kể trên không thể không nhắc đến các loại kháng sinh ancaloit mà do một số chủng nấm tạo ra trong quá trình phát triển sinh học của chúng. Kỷ nguyên kháng sinh bắt đầu từ năm 1929, khi Fleming phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của penicillin do chủng nấm Penicillin notanum tạo ra trong quá trình trao đổi chất và đến năm 1949, ngƣời ta đã phân lập đƣợc penicillin tinh sạch [4], [21], [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26  Kháng sinh β-lactam (penicillin và cephalosporin) Penicillin và cephalosporin không có hoạt tính kháng động vật nguyên sinh đơn bào (protozoa) và nấm, bởi vì thành tế bào của chúng đƣợc tạo ra khác với của vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram(+) và khuẩn xoắn rất nhạy cảm với các kháng sinh β-lactam. Các vi khuẩn Gram(-) phần lớn kháng thuốc đối với các penicillin cổ điển. Tuy nhiên, các penicillin bán tổng hợp (ampicillin, carbenicyllin) và cephalosporin đều có tác dụng đối với vi khuẩn Gram(-). N S CH3 CH3 COOH HH O N H C O R 3.25 Một số kháng sinh penicillin quan trọng R Tên Ph-CH2- Penicillin G CH3-CH2-CH=CH-CH2- Penicillin F CH2=CH-CH2-S-CH2- Penicillin O Ph-O-CH2- Penicillin V HOOC CH CH2 NH2 CH2 CH2 Penicillin N N S R2 COOH R3 O HNC O R1 3.26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Một số cephalosporin quan trọng R1 R2 R3 Tên Cách dùng HOOC CH NH2 CH2 5 AcOCH2- H Cephalosporin C Thuốc uống S CH2CO- AcOCH2- H Cephalotin Thuốc dùng ngoài ruột CH NH2 D CH3- H Cephalexin Thuốc uống N N N N CH2 CO N S N S3 CH2 H Cephazolin Thuốc dùng ngoài ruột S CH2CO -CH2-O-CONH2 CH3O Cefoxitin Thuốc dùng ngoài ruột  Kháng sinh aminoglycozit (nhóm streptomycin) Một số chế phẩm kháng sinh streptomycin quan trọng. Hoạt chất Tên Phổ tác dụng Điều trị OH HO H N HO C NH NH2 N H C NH NH2 O O O O CHOHO H3CHOH2C OH HO NH CH3 3.27 Streptomycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim O CH2NH2 OH OH OH O NH2 NH2 OH O O H2C OH NH2 OH HO 3.28 Kanamycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim Nhiễm khuẩn ruột NH CH3 H3C O H2N HO NH2 O O CH3 OH HN CH3 3.29 Gentamycin Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Pseudomonas Nhiễm khuẩn đường liệu đạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Các kháng sinh streptomycin, sản phẩm sinh ra trong quá trình sống của nấm Streptomyces griseus, đƣợc Waksman và cộng sự phân lập vào năm 1944. Về mặt cấu tạo, chúng là các aminoglycosit, gồm 2 phần, phần genin (aglicon) là các dẫn xuất của streptamin, phần đƣờng là các monosacarit nhƣ L-xilozơ, L-streptozơ, 5-hydroxistreptozơ, N-metyl-L-glucozamin, D- mannozơ. Steptomycin có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-). Các kháng sinh streptomycin có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-), không có tác dụng với phần lớn khuẩn Samonella và Pseudomonas. Hoạt tính quan trọng nhất là kháng vi trùng lao (TBC). Tuy nhiên chúng dễ bị kháng thuốc khi dùng điều trị đơn lẻ. Các kháng sinh streptomycin không bền đối với kiềm, chỉ dùng dƣới dạng muối.  Kháng sinh tetracyclin Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra chlotetracyclin là kháng sinh đƣợc tạo ra bởi nấm Streptomyces aureofaciens. Năm 1949, ngƣời ta phân lập đƣợc oxitetracyclin từ loài Streptomyces rimosus. Tetracyclin là các kháng sinh có phổ tác dụng rất rộng, nó có hoạt tính đối với tất cả các loại khuẩn, các loại khuẩn Proteus, Pseudomonas và khuẩn xoắn. Chlotetracyclin có hoạt tính yếu hơn, còn doxicyclin và minocyclin có thể điều trị hiệu quả đối với các bệnh lậu và viêm màng não. O OH O OH CO-NH-R1 R2R3R4R5 OH OH NMe2 3.30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Tên R1 R2 R3 R4 R5 Độ bền Chlotetracyclin (Aureomycin) H H OH CH3 Cl Không bền Oxitetracyclin (Terramycin) H OH OH CH3 H Không bền Metacyclin H OH =CH H Bền Doxicyclin (Vibramycin) H OH H CH3 H Bền Minocyclin (Klinomycin) H H H H Me2N- Bền  Kháng sinh chlorocid (chloramphenicol) Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra một chủng Streptomyces mới có thể tạo ra chlorocid trong quá trình sống. Ngày nay, chlorocid đã đƣợc điều chế bằng con đƣờng tổng hợp toàn phần [2], [36]. Kháng sinh chlorocid có phổ tác dụng rộng nhất bên cạnh tetracyclin. Nó có tác dụng lên mọi vi khuẩn trừ khuẩn Pseudomonas. Tuy nhiên, nó lại có hoạt tính cả với khuẩn Salmonella, khuẩn Proteus, Trùng rận, khuẩn Chlamydia. Lĩnh vực sử dụng điều trị hiện nay chủ yếu là chữa viêm màng tim, bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn Gram(-) gây ra. R CH CH OH CH2-OH NH-CO-CHCl2 3.31a R = NO2 Chlorocid 3.31b R = MeSO2 Thimaphenicol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 CHƢƠNG 2 PHẦN THỰC NGHIỆM Cây cà phê chè (Coffea arabica) là loại cây công nghiệp đƣợc du nhập sớm vào Việt Nam. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hạt cà phê chè nhƣng những hiểu biết về thành phần hoá học và tác dụng dƣợc lí của lá cây cà phê chè vẫn còn rất sơ sài. Ở Malaysia và Indonesia, ngƣời ta sử dụng lá cây cà phê chè sắc nƣớc để làm thuốc lợi tiểu. Cà phê chè còn đƣợc dùng nhƣ bài thuốc cổ truyền điều trị các bệnh hen xuyễn, nhiễm độc atropin, cúm, đau đầu,... Từ bài thuốc cổ truyền khá độc đáo của dân tộc Dao, sử dụng lá cây Cà phê chè để bài sỏi thận với kích cỡ nhỏ hơn 10 mm trong thời gian khoảng 20 - 30 ngày. Vì thế, lá cây cà phê chè đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu hoá thực vật. Nhiệm vụ của luận văn là tìm hiểu một số thành phần hoá học có trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc trồng tại xã Hoàng Quế, huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh. 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Cà phê chè, lá cây tƣơi đƣợc thu hái 12/2008 tại Lâm Xá - Tràng Bạch - Hoàng Quế - Đông Triều - Quảng Ninh. Mẫu lá cà phê chè để nghiên cứu hoá thực vật đã đƣợc TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là Coffea arabica (chi: Coffea, họ: Rubiacea, bộ: Gentianales, lớp: Magloniopsida, ngành: Magloniophta, giới: Platae). 10,5 kg mẫu cây tƣơi đem sấy ở nhiệt độ 110 0C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 0C - 60 0C tới khi độ ẩm dƣới 10% đƣợc 1,2 kg mẫu khô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.1.2. Phƣơng pháp ngâm chiết 1,2 kg mẫu khô đã nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với từng loại dung môi: n-Hexan, etylaxetat, metanol trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ 50 0 C, thời gian ngâm mỗi lần 1 giờ. Mẫu nghiên cứu đƣợc ngâm với từng loại dung môi trên mỗi loại 5x 5lit. Dồn chung mỗi loại dịch chiết riêng biệt và làm khan bằng Na2SO4. Sau đó các dịch chiết riêng biệt đƣợc lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dƣới áp xuất giảm. Thu đƣợc thu đƣợc 3 cặn tƣơng ứng n -Hexan, etylaxetat và metanol. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm 2.1.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với 3 loại cặn thô thu đƣợc ở trên tại Phòng thử hoạt tính sinh học -Viện Hoá học -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.4. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng nhƣ phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phƣơng pháp sắc ký nhƣ: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột thƣờng dùng Silica gel Merck 63-200 nm, cột pha đảo bằng các dung môi và hệ dung môi thích hợp. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại . 2.1.5. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập đƣợc ở dạng tinh khiết là đối tƣợng để khảo sát các đặc trƣng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy (Mp), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. khi thu đƣợc các chất sạch, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch đƣợc dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thƣớc khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM: STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (8: 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4: 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2: 1) hệ C 4 Cloroform - metanol (9: 1) hệ D 5 Cloroform - metanol (5: 1) hệ E 6 Cloroform - metanol (3: 1) hệ F Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thƣờng sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dƣới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lƣợng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Khoa học và Công nghệ Việt nam) ion hóa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD. - Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6. 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đó, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc các cặn tƣơng ứng. Đem cân để xác định khối lƣợng các cặn. Việc thu nhận các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) xem sơ đồ 2.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) MÉu kh« nghiÒn nhá 1,2 kg CÆn n-Hexan Cof H: 80g B· 1 CÆn EtOAc Cof E: 42,3 g B· 2 B· 3 (Bá) n-Hexan(5x5l) C« kh« EtOAc 5x5l C« kh« MeOH5x5l C« kh« CÆn MeOH Cof M: 92,7g Cặn đƣợc làm khô đến khối lƣợng không đổi và cân xác định trọng lƣợng. Từ lá cây Cà phê chè đã thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là: Cof H, Cof E, Cof M Ở đó: Cof H : Cặn chiết n-Hexan Cof E : Cặn chiết EtOAc Cof M : Cặn chiết MeOH Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hoàng Quế, Đông Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Bảng 2.2: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) Mẫu thu vào tháng 12/2008 Khối lƣợng mẫu khô (g) (% so với trọng lƣợng khô) Khối lƣợng cặn chiết khô (g) n-Hexan (% so với trọng lƣợng khô) EtOAc (% so với trọng lƣợng khô) MeOH (% so với trọng lƣợng khô) Lá 1200 (11,43%) 80,0 (6,67%) ( Cof H) 42,3 (3,53%) ( Cof E) 92,7 (7,73%) (Cof M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dƣơng tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit. Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với các flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện