Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nhân trần (adenosma cearuleum r. br.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên

loại có 24 đến 34C [14], [15], [19]. (1) C24H50O (2) C26H54O (3) C27H56O (4) C28H58O (5) C29H60O (6) C30H62O (7) C32H66O (8) C34H70O Hình 1.10. Các rượu béo trong policosanol cô lập từ nguyên liệu thô Policosanol có nguồn gốc thiên nhiên đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới khẳng định tính hiệu quả trong việc điều hòa Cholesterol, kiểm soát mỡ máu. Policosanol giúp tăng hoạt hóa Receptor tế bào, giúp tế bào sử dụng Cholesterol một cách hiệu quả, giữ các thành phần mỡ máu ở mức cần thiết và có lợi cho cơ thể. Từ đó giúp điều hòa mỡ máu, hỗ trợ kiểm soát tăng huyết áp và các bệnh tim mạch từ gốc [16], [19], [23], [24]. Policosanol là một hỗn hợp có trọng lượng phân tử cao, rượu béo nguyên sinh, trong đó 1-octacosanol là thành phần chính (khoảng 60%). Policosanol được phân lập từ sáp ong mía hoặc sáp ong, nhưng các nguồn này có thể có tỷ 18 lệ khác nhau của các thành phần policosanol. Octacosanol và các chất liên quan cũng được tìm thấy trong dầu mầm lúa mì, dầu thực vật, cỏ linh lăng và các sản phẩm từ động vật. [16], [25] GDL-5 là tên gọi được cấp phép độc quyền cho nhóm hoạt chất policosanol thiên nhiên được chiết xuất từ phấn mía Nam Mỹ. Với công nghệ chiết xuất hiện đại giữ lại 5 thành phần quan trọng là Octacosanol, triacosanol, Nonacosanol, Heptacosanol, hexacosanol có hiệu quả vượt trội trong việc điều hòa Cholesterol và kiểm soát mỡ máu [20], [23]. Nghiên cứu khoa học cho thấy GDL-5 khi được hấp thu vào cơ thể qua đường uống sẽ tác động đồng thời vào 2 quá trình: - Tác động cơ thể để tự điều chỉnh men HMG-CoA (3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A) - loại men có tác dụng tổng hợp Cholesterol một cách tự nhiên nhằm tự kiểm soát lượng Cholesterol nội sinh phù hợp với nhu cầu của cơ thể. Cơ chế này an toàn vì không ức chế trực tiếp lên men HMG- CoA [8], [24]. Hình 1.11: Công thức cấu tạo của men HMG-CoA (3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A) 19 Sơ đồ 1.1: Cơ chế điều hòa men của policosanol (GDL-5) - Tăng cường khả năng tiếp nhận Cholesterol ở các cơ quan đích. Đó là làm tăng sự hình thành các Receptor thụ thể Cholesterol LDL (Cholesterol xấu - các Cholesterol có thành phần cấu tạo đặc biệt khiến nó không chịu tác động của các quy luật trao đổi chất trong cơ thể do đó không phân giải được và tồn đọng lại trong mạch máu, khi bị tích tụ sẽ gây nên các vấn đề làm tắc nghẽn mạch máu) trên màng tế bào, giúp các Cholesterol LDL được hấp thụ vào tế bào thông qua các Receptor này một cách hiệu quả nhằm sinh năng lượng hình thành các hooc mon và sự chuyển hóa Cholesterol LDL thành Cholesterol HDL (Cholesterol tốt - các khối cholesterol tuân thủ đúng theo GDL - 5 HMG - CoA reductase Acetoacetyl - CoA Acetyl - CoA Hydroxymethylglutaryl - CoA Mevalonate 5-Pyrophosphomevalonate Isopentenyl pyrophosphate Dimethylalyl pyrophosphate Cholesterol 20 các cơ chế chuyển hóa và bài tiết của hệ tuần hoàn và tuyến gan – mật – thận nên có thể được luân chuyển đến gan và xử lý triệt tiêu). Qua đó làm giảm đáng kể số lượng Cholesterol LDL, tăng số lượng Cholesterol HDL trong máu, kiểm soát các thành phần mỡ máu khác luôn nằm trong mức cần thiết và có lợi cho cơ thể. Đây là cơ chế quan trọng giúp điều hòa các thành phần mỡ máu, từ đó giảm thiểu và ngăn ngừa các biến chứng của bệnh cao huyết áp, rối loạn mỡ máu gây ra. [23], [24] Đặc biệt, khác với octocosanol được tổng hợp từ hóa chất, GDL-5 thiên nhiên có tác động hiệu quả cao mà không gây tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài. Kết quả thực nghiệm lâm sàng tại Mỹ được tiến hành trên 30000 bệnh nhân rối loạn mỡ máu theo nguyên tắc ngẫu nhiên mù, đôi, đa trung tâm đối chứng với giả dược tại nhiều bệnh viên uy tín của Mỹ đã cho thấy sử dụng Policosanol (GDL-5) từ 4 - 8 tuần giúp giảm Cholesterol toàn phần từ 13,9%, giảm Cholesterol LDL từ 19,3%, giảm Triglyceride từ 14,1%, đồng thời làm tăng Cholesterol HDL từ 18,4%. Nghiên cứu này cũng theo dõi 4 năm trên 30000 người và cho thấy hầu như không có bất cứ tác dụng phụ nào[23]. 1.4. Hoạt tính sinh học của loài Adenosma cearuleum R. Br. Thành phần hoá học của Nhân trần có các Flavonoid, hợp chất polyphenol, phenollic, saponin, Coumarin, tinh dầu [3]. Tinh dầu chiếm 0,6% lượng chất khô trong cây. Thành phần chính gồm Carvacrol 27%, Carvacrol methyl ethe 28% và β- bisabolen 34,4%. Đáng chú ý là Carvacrol. Hợp chất này là dẫn xuất phenol có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất trong thành phần của các loại tinh dầu thực vật đã biết hiện nay [3]. Theo sách thuốc cổ, nhân trần vị hơi đắng, tính hơi hàn; vào được bốn đường kinh tỳ, vị, can và đờm; có công dụng thanh nhiệt lợi thấp, lợi mật thoái hoàng được dùng để chữa các chứng hoàng đản, tiểu tiện bất lợi, viêm loét da do phong thấp. [1], [3] 21 Theo y học hiện đại thì nhân trần có tác dụng làm tăng tiết và thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật, bảo vệ tế bào gan, ngăn ngừa tình trạng gan nhiễm mỡ, làm hạ huyết áp, thúc đẩy tuần hoàn, giải nhiệt, giảm đau và chống viêm. Nó có khả năng ức chế một số vi khuẩn như tụ cầu vàng, thương hàn, phó thương hàn, mủ xanh, E.coli, lỵ, song cầu khuẩn gây viêm não, viêm phổi và một số loại nấm, cải thiện công năng miễn dịch và ức chế trực tiếp sự tăng sinh của tế bào ung thư. Ngoài ra, nhân trần còn có tác dụng lợi niệu và bình suyễn [1], [2], [3]. Trong y học hiện đại, nhân trần đã được Bộ môn truyền nhiễm Trường đại học Y khoa Hà Nội dùng điều trị thực nghiệm bệnh viêm gan do virus. Kết quả cho thấy men gan của các bệnh nhân trở về mức bình thường, bệnh nhân hết mệt mỏi, hết đau vùng gan, ăn ngon. Nhân trần có thể kết hợp với một số thảo dược bổ gan khác để tăng tác dụng như: diệp hạ châu, cúc hoa[3], [6] Kết quả đã cho thấy men gan của các bệnh nhân đều trở về mức bình thường, bệnh nhân hết mệt mỏi, hết đau vùng gan, ăn ngon [1], [2], [3]. Nhân trần có thể kết hợp với một số thảo dược bổ gan khác để tăng tác dụng như: diệp hạ châu, cúc hoaCác tác dụng trên đã được nghiên cứu và ứng dụng thực tế để chữa bệnh trong y học cổ truyền từ rất lâu. [3], [6] 1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Adenosma ở Việt Nam 1.5.1. Tác dụng dược lý của loài Adenosma cearuleum R. Br. Tên đông y là Nhân trần hoặc Nhân trần nam. Loại cây này được biết đến không chỉ là một loại thức nước uống giải khát; mà còn là một vị thuốc được dùng để chữa nhiều loại bệnh đem lại hiệu quả cao. Theo Đông y, nhân trần vị hơi đắng, tính hơi hàn; vào được bốn đường kinh tỳ, vị, can và đởm. Có công dụng thanh nhiệt lợi thấp, lợi mật thoái hoàng, được dùng để chữa các chứng hoàng đản, tiểu tiện bất lợi, viêm loét da do phong thấp [3]. Theo y học hiện đại, loài Adenosma cearuleum R. Br. có tác dụng làm tăng tiết và thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật. Thí nghiệm được tiến hành trên chuột lang, thuốc được cho thẳng vào dạ dày rồi so sánh lượng dịch mật 22 và cặn khô của mật tiết ra trước và sau khi dùng thuốc. Kết quả thí nghiệm cho thấy loài Adenosma cearuleum R. Br. với liều 10g/kg cân nặng có tác dụng làm tăng tiết mật, lượng mật tiết ra sau khi chỉ dùng thuốc tăng 24,4%[3],[6]. Bên cạnh đó, loài Adenosma cearuleum R. Br. cũng làm tăng chức năng thải trừ của gan. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách dùng nghiệm pháp BSP (Bromo sufophtalein) trên chuột lang. Cho chuột uống mẫu thử 30 phút trước khi tiêm BSP. Sau khi tiêm BSP 15 phút, xác định lượng thuốc còn lại trong cơ thể, từ đó suy ra lượng BSP đã thải trừ. Kết quả cho thấy loài Adenosma cearuleum R. Br. với liều 10g/kg cân nặng làm tăng chức năng thải trừ của gan đến 187,5% so với lô đối chứng [3], [6]. Tuy nhiên khi so sánh tác dụng lên gan, mật của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và loài Adenosma caeruleum R. Br. thì tác dụng của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. mạnh hơn.[3] Loài Adenosma caeruleum R. Br. cũng có tác dụng chống viêm. Trên mô hình giai đoạn cấp tính của phản ứng viêm, gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng caolin, loài Adenosma caeruleum R. Br. có liều tác dụng ức chế phù 50% là ED50 = 6,3g/kg. Trên mô hình viêm mạn gây u hạt bằng cách cấy dưới da chuột cống trắng viên amian thì loài Adenosma caeruleum R. Br. có liều ức chế 50% trọng lượng u hạt là ED50 = 25,5g/kg. Như vậy, loài Adenosma caeruleum R. Br. có tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính, mạnh hơn giai đoạn mãn tính. Ngoài ra, trên mô hình gây thu teo tuyến ức của chuột cống trắng còn non, loài Adenosma caeruleum R. Br. với liều dùng 15g/kg có tác dụng gây thu teo tuyến ức đạt 31,4%. Đem so sánh với loài Adenosma indiana (Lour.) Merr., loài Adenosma caeruleum R. Br. có tác dụng chống viêm tương đương ở mô hình phù caolin và teo tuyến ức nhưng đối với mô hình u hạt thì loài Adenosma caeruleum R. Br. chưa bằng 1/2 của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. Trên phù caolin với liều 15g/kg thể trọng thì ức chế phù của loài Adenosma caeruleum R. Br. lại giảm [3]. 23 Bằng phương pháp khuếch tán thuốc trong môi trường nuôi cấy, dịch loài Adenosma caeruleum R. Br. có nồng độ 1:1, tác dụng ức chế vi khuẩn được biểu thị bằng đường kính vòng vô khuẩn do thuốc gây nên. Theo kết quả sau: Shigella dysenteriae - 16,27mm; Shigella shigae - 15,00mm; Shigella sonnei - 11,92mm; Streptococcus hemolyticus - 24,08mm; Staphylococcus aureus - 17,58mm; Diplococcus pneumoniace - 15,75mm; Enterococus - 11,55mm; Bacillus subtilis - 11,00mm còn đối với Shigella Ilexneri không có tác dụng ức chế. Từ kết quả trên cho thấy, tác dụng kháng khuẩn của loài Adenosma caeruleum R. Br. kém hơn so với loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. nhất là với trực khuẩn lỵ. Nhưng loài Adenosma caeruleum R. Br. ức chế mạnh hơn với Staphyllococcus và Steptococcus [3]. Loài Adenosma caeruleum R. Br. tác dụng không rõ rệt lên tiết dịch vị: không giảm loét dạ dày, không giảm tiết vị, có làm giảm axit tự do và axit toàn phần tuy nhiên hai tác dụng này lại giảm khi dùng liều cao; không độc [3]. Ngoài ra, loài Adenosma caeruleum R. Br. còn có tác dụng diệt giun. Thí nghiệm trên giun đũa của lợn (Ascaris summ) sơ bộ thấy loài Adenosma caeruleum R. Br. có tác dụng tốt [3]. Loài Adenosma caeruleum R. Br. không độc, khi sử dụng với liều lượng cao không gây độc. Khi thí nghiệm thử độc tính cấp trên chuột nhắt, uống với liều cao gấp 20 lần liều thường dùng, chuột vẫn sống bình thường. Khi thử độc tính bán mãn, thí nghiệm trên thỏ với liều dùng 10g/kg/ngày trong 4 tuần liên tiếp, qua theo dõi kiểm tra các chỉ tiêu hồng bạch cầu, huyết sắc tố, ure huyết, GOT (Glutamic Oxaloacetic Transaminase), GPT (Glutamic Pyruvic Transaminase) và các xét nghiệm vi thể các cơ quan gan, thận, thượng thận không phát hiện các hiện tượng nhiễm độc do thuốc [3]. 1.5.2. Tác dụng dược lý của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. Tên đông y còn gọi là Nhân trần đực, hay Nhân trần Bồ bồ. Năm 1939, Guichard và Clemensat nghiên cứu tác dụng của nước cất loài Adenosma 24 indiana (Lour.) Merr. (ngâm tinh dầu với nước trong vài giờ) trên giun Lombricus thì thấy ngay từ đầu con giun quằn quại trong vòng 10-15 phút. Nước bão hòa tinh dầu có tác dụng mạnh hơn nước cất của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. Đối với giun đũa (Ascaris) cũng có hiện tượng như trên nhưng yếu hơn và con giun chỉ chết sau 2 đến 3 giờ. Đối với giun móc câu con giun chết ngay sau 10 đến 15 phút. Thí nghiệm độ độc trên thỏ, với liều cao hơn tinh dầu giun thường dùng cho người cũng không thấy hiện tượng ngộ độc nào. Hai tác giả đã đi tới kết luận: Có thể dùng tinh dầu của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. làm thuốc tẩy giun [3]. Về tác dụng thông mật của hai loài Adenosma caeruleum R. Br. và Adenosma indiana (Lour.) Merr. Việt Nam theo như kinh nghiệm dùng trong dân gian. Năm 1957, Lê Tùng Châu (Viện dược liệu Hà Nội) và Nguyễn Viết Tựu (PV dược liệu TP. Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu tác dụng dược lý của loài Adenosma caeruleum R. Br. và loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và loài Adenosma bracteosa Bonati đã có kết quả: loài Adenosma indiana (Lour.) Merr làm tăng tiết mật rõ rệt ở cả 3 lô thí nghiệm (cao etanol 400, cao nước và tinh dầu). Tác dụng mạnh nhất ở cao etanol, tác dụng tăng thải độc của gan chỉ có ở cao etanol và tinh dầu [3]. Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn mạnh nhất là trên 2 chủng trực khuẩn lỵ (Sh. Dyénteriae 111 và Sh. Shigae 39) và 2 chủng cầu khuẩn (Staphylococcus aureus 109P và Streptococcus hemolyticus S84). Tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất ở cao etanol và cao nước, yếu ở tinh dầu. Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có tác dụng rõ rệt làm giảm tiết dịch vị, giảm độ axit tự do và axit toàn phần của dịch vị, làm giảm loét dạ dày của thực nghiệm. Độc tính của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. không đáng kể, với liều có tác dụng dược lý, dùng liên tục trong thời gian dài không thấy biểu 25 hiện nhiễm độc thuốc. Với liều cao hơn liều tác dụng 20 lần không làm súc vật chết [3]. 1.5.3. Tác dụng dược lý của loài Adenosma bracteosum Bonati. Tên đông y là Nhân trần tía. Dịch chiết etanol 900 có độc tính cao hơn dịch nước sắc loài Adenosma bracteosum Bonati. Khi thử độc tính cấp, loài Adenosma bracteosum Bonati được chặt nhỏ, phơi khô, chiết với cồn 400 rồi cô cách thủy đến dịch đậm đặc, cho chuột uống với liều lượng 300g/kg thể trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết. Làm tăng lượng tiết mật trên chuột lang. Lượng mật tăng gần 25% so với lô đối chứng [3]. Bệnh viện Chợ Quán - Thành phố Hồ Chí Minh đã dùng loài Adenosma bracteosum Bonati để chữa viêm gan virus trên lâm sàng. Kết quả là số bệnh nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46,6% [3]. So sánh đối chiếu thành phần hóa học với nhóm dược liệu chữa bệnh gan như Artichoke, Sylybum marianum (cây kế)... có thể dự đoán thành phần hóa học giúp chữa bệnh gan chủ yếu của loài Adenosma bracteosum Bonati là nhóm flavonoid, axit nhân thơm. Các nhóm hydroxy phenolic trong những hợp chất này làm tăng cường khả năng chống oxy hóa của tế bào gan. Mặt khác các saponin có vai trò chính trong việc kích thích ăn uống, hỗ trợ tiêu hóa [6]. 26 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa, thu thập thông tin, thu hái tiêu bản bao gồm cả phần rễ, lá, thân, hoa của loài Adenosma cearuleum R. Br. tại địa bàn các xã Tiên Hội, Ký Phú thuộc huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên vào thời điểm cây phát triển trong năm là tháng 4 và 5 năm 2016. Mẫu tiêu bản được ghi vùng, thời điểm, định danh và khẳng định loài bởi Tiến sĩ Thực vật học Nguyễn Thế Anh - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1.1. Hóa chất dùng để phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. Sử dụng các dung môi n–hexan, etyl axetat để ngâm chiết mẫu. Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197–400 mesh (0,040 – 0,063 mm). Sắc ký cột nhanh: sử dụng silicagel cỡ hạt 70–200 mesh. Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài (254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin–H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 ml; CH3COOH 25 ml; H2SO4 11 ml), hơ nóng trên bếp điện cho đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất. 2.2.1.2. Hóa chất dùng để thử hoạt tính chống oxi hóa từ phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng từ 23-26g Hoá chất: DPPH (Sigma) ; 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate) hay ABTS (Sigma) ; Trolox (Sigma Aldrich), Axit Ascorbic (Sigma Aldrich) ; Postassium persulphate (Scharlau), acetate buffer 27 (Scharlau) ; Dimetylsulfoside (DMSO) (Fisher Scientific) ; Đệm phosphat hoặc Kali clorid 1,15% (KCl), Methanol, Axit tricloaxetic (TCA, Fisher), Axit thiobarbituric (TBA) (Sigma Aldrich) ; FeSO4.7H2O, H2O2 ; DMSO (Fisher) và các dung môi thông thường khác. 2.2.1.3. Hóa chất dùng để xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. Vật liệu và hóa chất: FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) ; Chất tham khảo Elippticine và các hóa chất thông thường khác. Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. 2.2.2. Thiết bị Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS. Đĩa 96 giếng, pipet, eppendorf và các thiết bị phụ trợ khác. Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader. Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELSA 96 giếng (Bio-rad). 2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu thân cây Nhân trần được thu hái tại các xã Tiên Hội và Ký Phú thuộc huyện Đại từ, tỉnh Thái Nguyên (tháng 4 - 5 năm 2016). Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, sau khi hong gió 3-4 giờ, xử lý diệt men mẫu bằng cách 28 hấp nguyên liệu bởi hơi etanol 700 trong 3-4 phút. Nguyên liệu sau diệt men tiếp tục xử lý để có mẫu tươi. Khi chiết mẫu tươi, phần thân mẫu sau khi diệt men sẽ chiết nước ngay. 2.3.2. Chiết tách các chất Mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. được rửa sạch, hong khô tự nhiên, sấy khô bằng thiết bị sấy thực vật ở nhiệt độ 40oC, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol (4x24 giờ) ở nhiệt độ phòng. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết metanol. Thêm 50 ml nước, khuấy đều và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat. Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng loại dung môi với nhau, quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng. Phân lập cặn chiết n-hexan và etyl axetat thu được bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp. 2.3.3. Xác định cấu trúc các chất Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT). 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa từ dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô 2.4.1. Xác định khả năng ức chế peroxidation lipid (thử nghiệm MDA) Được thực hiện theo phương pháp của Ngô Quốc Hận, Nguyễn Thị Thu Hương (2011), Jelili A Badmus và đồng tác giả (2011) có sự thay đổi cho phù hợp với các điều kiện của phòng thí nghiệm. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm. 2.4.2. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH Được tiến hành theo phương pháp của P. Yuvaraj và cộng sự. 29 2.4.3. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS Được tiến hành theo phương pháp của Saeed N et al. 2.5. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. 2.6. Thực nghiệm 2.6.1. Quá trình phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. 2.6.1.1. Chiết, tách mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. Quy trình chiết mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. (2,4 kg) được nêu trong sơ đồ 2.1. Mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. đã sấy khô, nghiền nhỏ (2,4 kg) được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (4 lần). Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, cặn thu được được thêm 50 ml nước. Sau đó, được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat (4 lần đối với mỗi loại dung môi). Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC thu được các cặn chiết có khối lượng tương ứng là: 17,6 g cặn chiết n–hexan và 26 g cặn chiết etyl axetat. 30 2.6.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng chúng tôi thấy dịch chiết etyl axetat khả thi nên tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học trên dịch chiết etyl axetat. Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. được trình bày theo sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết, tách các chất từ phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. Dịch chiết etyl axetat được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi CH2Cl2/MeOH và trộn với 20 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký. 1. Phơi khô, nghiền nhỏ 2. Ngâm chiết với MeOH 3. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm trong máy cất quay chân không, loại metanol Cặn EtOAc (26g) Cặn MeOH (50.0g) SKC silicagel: n-hexan: EtOAc, lượng EtOAc 0-100% Phân đoạn 2 Phân đoạn 7 Phân đoạn 13 Chất AC2 (45 mg) Chất AC5 (18mg) Chất AC6 (8.5 mg) Kết tinh với CCl4 lạnh SKC silicagel: n- hexan: EtOAc (9: 1.5) Mẫu phần thân loài Adenosma cearuleum R. Br. (2,4 kg) 31 Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 5cm x 27cm theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là n-hexan 100%. Sau khi cột đã ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc có độ phân cực tăng dần (lượng EtOAc tăng dần từ 0→100%) thu được 35 phân đoạn khác nhau. Phân đoạn thứ 2 của cột này (khi giải hấp với hệ dung môi n-hexane : EtOAc = 10 : 0.5) thu được 45 mg chất AC2. Chất rắn xuất hiện ở phân đoạn 7 được rửa lại trong CCl4 lạnh thu được 18 mg chất AC5. Sắc kí lại phân đoạn 13 trên cột silica gel (dung môi rửa giải: n-hexane : EtOAc (9 : 1.5) thu được 8,5 mg chất AC6. 2.6.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được 2.6.2.1. Chất AC2: α, β-dilinoleostearin - Là dạng dầu, màu vàng, khối lượng 45 mg. - ESI-MS m/z: 263.3 [C17H31CO] +, 266.7 [C17H35CO] +. - 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.39-5.31 (8H, m, α, β-H9, H10, H12, H13), 5.26 (1H, dt, J=5.5, 4.5 Hz, β-CH-O), 4.29 (2H, dd, J=12.0, 4.5 Hz, α- CH2O), 4.14 (2H, dd, J=12.0, 5.5 Hz, α’-CH2O), 2.77 (4H, t, J=7.5 Hz, α, β- H11), 2.32 và 2.31 (6H, 2хt, J=7.5 Hz, α, β, α’-H2), 0.88 và 0.92 (9H, 2хt, J=7.0 Hz, α, β, α’-H18). - 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 173.28 (α’-C1), 173.24 (α-C1), 172.83 (β-C1), 130.23 (α, β-C13), 130.02 (α-C9), 129.99 (β-C9), 128.10 (β-C10), 128.09 (α-C10), 127.92 (α-C12), 127.91 (β-C12), 68.92 (β-CH-O), 62.12 (α,α’-CH2O), 34.21 (β-C2), 34.07 (α’-C2), 34.04 (α-C2), 31.93 (α’-C16), 31.54 (α, β-C16), 29.78, 29.71, 29.67, 29.63, 29.53, 29.49, 29.35, 29.28, 29.20, 29.18, 29.13, 29.10, 29.06, 27.21, 25.65 (α, β-C11), 24.89, 24.85, 22.69 (α’-C17), 22.57 (α, β-C17), 14.10 (α’-C18), 14.06 (α, β-C18). 32 2.6.2.2. Chất AC5: 1-heptacosanol - Là chất rắn, màu trắng, khối lượng 18 mg. - ESI-MS m/z: 397.2 [M+H]+. - 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 3.64 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-1), 1.59-1.54 (4H, m, H-2 và H-3), 1.25 (s, H-4-26), 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-27). - 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 63.1 (C-1), 32.8 (C-2), 31.9 (C-3), 29.7-22.7 (C-4-26), 14.1 (C-27). 2.6.2.3. Chất AC6:Axit triacontanoic - Là chất rắn, khối lượng 8,5 mg. - ESI-MS m/z: 453.4 [M+H]+. - 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 2.28 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 1.59 – 1.53 (2H, m, H-3), 1.18 (52H, s, H-4 - H-29), 0.81 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-30). 2.6.3. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA) Được thực hiện trên não chuột với chất đối chứng tham khảo là Trolox (Sigma Aldrich), đồng phân của vitamin E. Cụ thể như sau: - Mẫu thử được pha ở các nồng độ: 10000 µg/ml, 2000 µg/ml, 400 µg/ml, 80 µg/ml, 16 µg/ml, 3.2 µg/ml (mẫu pha trong nước khử ion). - Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (pH=7.4) theo tỷ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-4oC. - Lấy 1ml dịch đồng thể