Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ quả măng cụt xanh (garcinia mangostana l.)

,33-36, 43-48]. Năm 1979, Shankaranarayan và các cộng sự đã tạo ra các dẫn xuất tổng hợp từ xanthon (3-O-methyl mangostin, 3,6-di-O-methyl mangostin, mangostin triaxetat, 1-isomangostin, mangostin-3,6-di-O-(tetra axetyl)-glucosid và mangostin-3,6-di-O-glucosid) từ α-mangostin, được sử dụng trong nghiên cứu dược lý, cũng giống như α-mangostin. Khả năng hoạt động trong miệng và bụng (50 mg/kg) của α-mangostin, 1-isomangostin và mangostin triaxetat đã thể hiện hoạt tính chống viêm trên các loài gặm nhấm, được kiểm nghiệm khi dùng chích qua màng phúc mô hay khi cho uống nơi chuột bị gây phù chân bằng carrageenan, hay bằng cách cấy cục bông gòn dưới da. Các chất này không có hiệu ứng ổn định màng tế bào. Trong phần tác dụng lên hệ trung ương, chúng ta thấy mangostin ức chế tổng hợp COX-2, đó cũng là một cơ chế chống viêm. Năm 2002, Nakatani và các cộng sự sử dụng dịch chiết etanol 100 %, 70 %, 40 % và nước, tìm thấy dung dịch etanol 40% ức chế phóng thích histamin qua trung gian IgE. Dung dịch này cũng ức chế tổng hợp prostaglandin E-2 (PGE-2). Phản ứng phản về qua da thụ động bị ức chế đáng kể bởi dịch chiết 40%. Tác dụng chống dị ứng của dung dịch này mạnh hơn dung dịch một loại cây ngấy (Rubus suavissimus) thường dùng ở Nhật. Gần đây, năm 2008, Chen và các cộng sự đã chứng minh rằng α và γ-mangostin ức chế hiệu quả quá trình sản xuất NO. và độc tố tế bào đến các tế bào RAW 264,7. Số lượng sản xuất NO. ở 3 đến 25 μM được xác định liên lục, chỉ số IC50 đối với α và γ-mangostin là 12,4 và 10,1 μM. Hai hợp chất là α và γ-mangostin cũng khử một cách hiệu quả quá trình tổng hợp PGE2 (IC50 11,08 và 4,5 μM). Hiệu quả của những xanthon này được thông qua bằng cách xác định sự cảm ứng của iNOS (nitric oxide synthase) và enzym COX. Cơ quan cảm nhận IgE gây hoạt động truyền tính trạng tín hiệu trong tế bào, dẫn tới sự giải phóng chất trung gian gây bị viêm, ví dụ như histamin. Đây chính là khả năng quan trọng nhất trong vài giả thiết về dị ứng. Dựa trên những thông tin đó, Itoh và các cộng sự (2008) đã giải thích rằng các xanthon được tách ra từ quả măng cụt (α, β và γ- mangostin), ngăn cản quá trình mất hạt nhỏ của bạch cầu trong hoạt động Ag gián tiếp của IgE trên tế bào bạch cầu RBL-2H3 ở chuột. Các tác giả này cũng giải thích rằng cơ chế ức chế của quá trình mất hạt nhỏ nhờ xanthon là do sự ngăn cản của đường chạy SYK/PLCγs/PKC. Tất cả những dữ liệu kể trên chỉ ra rằng các xanthon được tách ra từ quả măng cụt có thể là một mục tiêu mới về các hợp chất chống viêm và chống dị ứng. 1.3.2.4. Hoạt tính chống khuẩn, chống nấm và chống virut [13,18] Năm 1983, Sundaram và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn và chống nấm của α–mangostin và 4 dẫn xuất của nó. Họ nhận thấy rằng vi khuẩn S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella typhimurium và Bacillus subtilis dễ bị tổn thương cao đối với các xanthon này; ngược lại các vi khuẩn Pro-teus sp, Klebsiella sp và Escherichia coli chỉ bị tổn thương ở một mức độ nào đấy. Về nấm, α–mangostin và 4 dẫn xuất của nó có tác dụng ức chế mạnh mẽ với các loại Epidermophyton floccosum, Alternaria solani, Mucor sp., Rhizupus sp. và Cunninghamella echinulata, ngược lại Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Fusarium roseum và Curvularia lunata chỉ bị tổn thương nhẹ. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, nồng độ thấp nhất của hợp chất chống vi khuẩn gây ức chế sự tăng trưởng có thể quan sát được của vi sinh vật sau giai đoạn ủ bệnh) của α–mangostin là giữa 12,5 và 50 μg/mL đối với vi khuẩn, giữa 1 và 5 μg/mL đối với nấm. Sự sắp xếp về khả năng kháng khuẩn và kháng nấm như sau: α–mangostin > isomangostin > 3-O-metyl mangostin > 3,6-di-O-metyl mangostin. Mangostin triaxetat không có hoạt tính. Năm 1986, Mahabusarakam và các cộng sự đã điều tra về hoạt tính chống khuẩn của mangostin, gartanin, γ-mangostin, 1-isomangostin và 3-isomangostin được tách từ trái măng cụt chống lại S. aureus, cả chủng bình thường lẫn chủng kháng penicillin. Chỉ số MIC (μg/mL) của các hợp chất được sắp xếp theo thứ tự sau: đối với các chủng bình thường là methicillin (3,9) > α–mangostin (15,6) > γ-mangostin (31,2) > 1-isomangostin (62,5) > 3-isomangostin (125) > gartanin (250); đối với các chủng kháng penicillin là α–mangostin (1,56-12,5) > methicillin (1,56-12,5) > 1-isomangostin (125) > 3-isomangostin (250), γ-mangostin (250) và gartanin (250). Thêm vào đó, hoạt tính của mangostin, gartanin và γ-mangostin chống lại Candida albicans, Cryptococcus neoformans, T. mentagrophytes và Microsporum gypseum cũng được kiểm nghiệm; kết quả là có hoạt tính trung bình chống lại T. mentagrophytes, Microsporum gypseum nhưng lại không thể hiện hoạt tính chống lại C. albicans, C. neoformans. Năm 1996, Linuma và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả ức chế của vài xanthon, được tách ra từ vỏ quả măng cụt, chống lại sự tăng trưởng của S.aureus đề kháng methicillin (MRSA–methicillin resistant S.aureus). α–mangostin ức chế hiệu quả rõ rệt, với chỉ số MIC từ 1,57-12,5 μg/mL. Năm 2003, Saksamrarn và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống vi trùng lao của các prenyl xanthon lấy từ vỏ quả măng cụt. Trong số chúng, α và β-mangostin và garcinone B thể hiện hiệu quả ức chế thuyết phục nhất chống lại vi trùng lao Mycobacterium tuberculosis, với chỉ số MIC là 6,25 μg/mL, ngược lại, demthylcalabaxanthon và trapezifolixanthon có chỉ số MIC là 12,5 μg/mL, γ-mangostin, garcinone D, mangostanin, mangostenone A và tovophyllin B có chỉ số MIC là 25 μg/mL. Các xanthon có khả năng chống lại vi trùng lao thấp hơn là mangostenol và mangostanol có chỉ số MIC lần lượt là 100 μg/mL và 200 μg/mL. Năm 1994, Phongpaichit và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của α và γ-mangostin và hỗn hợp mangostin trên 49 chủng MRSA, được lấy từ các bệnh nhân ở bệnh viện Songklanagarind; 50 chủng MRSA, 13 chủng Enterococcus spp, được lấy từ các bệnh nhân ở bệnh viện Maha-raj Nakorn Chiang Mai. Hỗn hợp mangostin có hiệu quả thuyết phục nhất chống lại MRSA (MIC 1,48 μg/mL), α và γ-mangostin lần lượt là 3,12 và 2,26 μg/mL. Đối với tất cả các chủng Enterococcus spp, mangostin ức chế sự tăng trưởng của chúng ở 1 μg/mL. Vài sản phẩm tự nhiên được xác định nhờ vào khả năng ức chế những trạng thái khác nhau đối với chu kỳ của virut làm mất khả năng miễn dịch ở người (HIV-1). Năm 1996, Chen và các cộng sự đã chỉ ra rằng cặn chiết etanol của trái măng cụt ức chế rất hiệu quả với HIV-protease. Hai xanthon được tách ra từ cặn này là α và β-mangostin, theo thứ tự thể hiện chỉ số IC50 5,12 ± 0,41 và 4,81 ± 0,32 μM. Tính chất ức chế này không cạnh tranh. Gần đây, năm 2007, Rassameemasmaung và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả của một loại thuốc súc miệng từ dược thảo có chứa thành phần chiết từ vỏ quả măng cụt, thông qua thử nghiệm trên 60 người, được chẩn đoán mắc phải bệnh viêm lợi kinh niên ở mức độ nhẹ nhàng hay vừa phải. Kết quả là có tác dụng chống lại các hợp chất chứa lưu huỳnh dễ bay hơi, bệnh bựa răng và chảy máu răng. Chính vì vậy, phần chiết từ vỏ quả măng cụt có thể được sử dụng như một tác nhân bổ sung trong việc điều trị hơi thở hôi thối. 1.3.2.5. Hoạt tính chống sốt rét [13] Một vài xanthon được tách ra từ măng cụt đã chỉ ra hoạt tính chống sốt rét chống lại plasmodium falciparum trong phòng thí nghiệm. β-mangostin và α-mangostin thể hiện giá trị IC50 theo thứ tự lần lượt là 7 và 5,1 μM, trong khi đó mangiferina - một xanthon glucosid, lại thể hiện chỉ số IC50 cao hơn 50 μM (2005). Mặt khác Mahabusarakam và các cộng sự ( 2006) lại nhận ra rằng α – mangostin lại thể hiện chỉ số IC50 là 17 μM chống lại P.falciparum. CHƯƠNG 2. NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 1- Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ vỏ quả măng cụt xanh. 2- Nghiên cứu quy trình phân tích và phân tách các phần chiết nhận được từ vỏ quả măng cụt xanh. 3- Phân lập các hợp chất trong các phần chiết nhận được 4- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập. 5- Thử hoạt tính kháng sinh và chống oxi hóa của một số hợp chất phân lập được 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật Ngâm chiết mẫu thực vật đã phơi khô bằng EtOH. Để tăng hiệu suất chiết tiến hành ngâm chiết nhiều lần, mỗi lần ngâm trong 3 ngày. Phần chiết EtOH này sau đó được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần. Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100x10-6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực hiện. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để xác định và kiểm soát điều kiện phân tách. Đối với sắc kí bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho Rf tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp thì chọn dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt. b a Hình 2.1 Sắc ký lớp mỏng 2.2.2.2. Sắc ký cột Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện để tinh chế lượng nhỏ các mẫu chất. Hình 2.2 Sắc ký cột 2.2.2.3 Phương pháp kết tinh lại Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn. 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ) Các phương pháp phổ hiện nay là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm: - Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS); - Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS); - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT; CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1 Thiết bị và hóa chất. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên silica gel Merck (Darm-Stadt, CHLB Đức) cỡ hạt 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm. Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi trên thiết bị LC-MS-Orbitrap-XL (Thermo Scientific). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) HMBC được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu diễn theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero 3.2 Nguyên liệu thực vật Mẫu nghiên cứu là vỏ quả măng cụt có nguồn gốc từ miền Nam, được thu gom vào tháng 7 năm 2010. Sau khi bỏ cuống, tách bỏ phần thịt quả, vỏ quả măng cụt được rửa sạch, đem phơi khô ở nhiệt độ thường, trong bóng râm. Sau đó, mẫu khô được đem nghiền thành dạng bột nhỏ, thu được 2,0 kg bột. 3.3 Điều chế các phần chiết từ vỏ quả măng cụt xanh Phần tổng quan về thành phần hóa học của cây măng cụt nói chung cho thấy trong vỏ quả măng cụt chủ yếu có chứa các xanthon, là các hợp chất đều có độ phân cực khá, do đó việc chiết chủ yếu được thực hiện ở các dung môi có độ phân cực trung bình trở lên như điclometan,n-butanol, etyl axetat, axeton. 2,0 kg vỏ quả măng cụt được ngâm trong etanol 96 % ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại được ngâm tiếp với etanol. Quá trình này được tiến hành tương tự như vậy 4 lần. Dịch chiết sau 4 lần được gom lại, đem cất loại dung môi dưới áp suất thấp ở nhiệt độ khoảng 40 – 500C đến khi thu được khối sệt. Pha khối sệt ở trên với nước cất theo tỉ lệ 1:1 ( khoảng 0,3 l nước cất), nhằm giải phóng các chất kém phân cực ra khỏi dịch chiết rồi chiết chúng bằng các dung môi theo độ phân cực tăng dần, trước hết là điclometan , sau đó đến n- butanol. Dịch chiết điclometan và n- butanol tiếp theo được xử lí như sau: làm khô với Na2SO4, sau đó đều đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40-55 0C, thu được các cặc chiết ở dạng sệt, kí hiệu lần lượt là GMD và GMB. Sơ đồ chiết và hiệu suất các phần chiết được trình bày ở chương 4: Kết quả và thảo luận. 3.4 Phân tích cặn GMD 3.4.1 Phân tích cặn GMD bằng TLC Hòa tan một lượng nhỏ cặn diclometan trong etyl axetat. Sau đó, dùng capilla để hút chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) sao cho vết chất cách mép dưới của bản 1,0 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm. Sau khi sử dụng qua nhiều hệ dung môi và các tỉ lệ khác nhau (điclometan/n-hexan (9:1; 7:1; 5:1, v/v); etyl axetat/n-hexan; điclometan/etyl axetat; chlorofom/n-hexan;...), nhận thấy hệ dung môi điclometan : axeton (22:1, v/v) và n- hexan/ acetone cho sự tách tốt nhất đối với cặn điclometan. Phát hiện các vết chất dưới ánh sáng thường , sau đó soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại UV (λ = 254 nm), cuối cùng phun bản mỏng với dung dịch vanilin/H2SO4, FeCl3 và hơ bản mỏng trên bếp điện để nhận biết vệt chất. Kết quả khảo sát bản mỏng cặn chiết chiết GMD xem ở chương 4: Kết quả và thảo luận. 3.4.2 Phân tách cặn GMD bằng CC Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đường kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra. Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn điclometan trong etyl axetat, sau đó tẩm với 11.5 gam silicagel (cỡ hạt 40- 63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi etyl axetat bay hơi hết thu được bột mịn tơi màu vàng thẫm. Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt. Silicagel được khuấy đều và ngâm trong dung môi n- Hexan cho trương nở trong. Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi n- Hexan lên cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dưới cho dung môi chảy ra. Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho n- Hexan chảy qua nhiều lần để cột được nén đều. Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã được nén đều khoảng 4cm thì đưa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngược của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % n- Hexan, tiếp theo là hỗn hợp n- Hexan : axeton theo tỉ lệ tăng dần axeton, và cuối cùng dội cột với axeton. Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút. Dung dịch rửa giải được thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự. Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau được gom lại, thu được 7 phân đoạn, kí hiệu là GMD I→ VII. Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu được chất tinh khiết ở phân đoạn GMD I, kí hiệu là D1. Tiếp tục chạy sắc kí cột (với cột nhỏ hơn) phân đoạn GMD III với hệ dung môi n- hexan/acetone, và tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại chúng tôi đã thu được 2 chất tinh khiết kí hiệu là D2 và D3. Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chương 4: Kết quả và thảo luận. 3.4.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết điclometan ( GMD) 3.4.3.1 Chất D1 Tinh thể hình que, màu vàng tươi; nhiệt độ nóng chảy là 167-169 0C (kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan/axeton); Rf = 0,78 (TLC, silicagel, điclometan/axeton (20:1), v/v); dưới ánh sáng thường có màu vàng nhạt, phun với vanilin/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng tươi. Phổ 1H-NMR (500 MHz, Me2CO-d6, d, ppm): 12.33(1H; s; OH-1); 11.30(1H; s; OH-8); 7.31(1H; d; J= 8.8 Hz; H-6); 6.62(1H; d; J= 8,8 Hz; H-7); 5.28 và 5.24(2H; m; H-12 và H-17); 3.66(2H;d; J= 7,0 Hz; H-16); 3.45(2H; d; J= 7,0 Hz; H-11); 1.85(3H; s; H-20); 1.80(3H; s; H-14); 1.67(3H; s; H-19); 1.66(3H; s; H-15). 3.4.3.2 Chất D2 Tinh thể hình kim màu vàng, Đnc. 1660- 1670C (kết tinh trong n-hexan-axeton); Rf 0,66 (hệ dung môi: n-hexan- etyl axetat, 7:3, v/v); phát quang màu tím dưới ánh sáng tử ngoại; cho màu vàng đậm hơn với thuốc thử vanilin/H2SO4+ T0. Phổ 1H- NMR (500MHz, MeOD, δ, ppm): 12.32(1H; s; OH-1); 7.37(1H; d,d; J= 1.5Hz, 8.0 Hz; H-6); 7.25(1H; t; J= 8.0 Hz; H-8); 5.3(1H; m, H- 12);5.24(1H; m; H- 17); 3.79(2H; d; J= 7.0 Hz; H- 16); 3.57(2H; d;J= 7.0 Hz; H- 11); 1.79(3H; s; H- 15); 1.65(3H; s; H- 14); 1.86(3H; s; H- 20); 1.65(3H; s; H-19). 3.4.3.3. Chất D3 Tinh thể hình kim, màu vàng óng, nhiệt độ nóng chảy là 180-181 0C (kết tinh lại trong hệ dung môi metanol/nước); Rf = 0,67 (TLC, silicagel, n-hexan/etyl axetat (1:1), v/v); dưới ánh sáng thường có màu vàng, phun với vanili/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng đậm hơn. Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, d, ppm): 6,74(1H; s; H-5); 6,28 (1H; s; H-4); 5,25(2H; m; H-12 và H-17); 4,12(1H; br. S; H-16); 4,11(1H; br. S; H-11); 3,78(3H; s; OCH3- 7); 1,85(3H; s; H-20); 1,80(3H; s; H-15); 1,70(3H;s; H-14); 1,68 (3H; s; H-19). Phổ MS, m/z, %: 411 (M+, 40), 352 (100), 219 (15), 149 (50), 114 (40). 3.5 Phân tích cặn GMB 3.5.1 Phân tích cặn GMB bằng TLC Dùng capilla để hút chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) sao cho vết chất cách mép dưới của bản 1,0 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm. Sau khi sử dụng qua nhiều hệ dung môi và các tỉ lệ khác nhau (điclometan/axetone (9:1; 7:1; 5:1, v/v); diclometan/etylaxetat; điclometan/Metanol...), nhận thấy hệ dung môi điclometan : MeOH (9:1, v/v) cho sự tách tốt nhất đối với cặn . 3.5.2 Phân tách cặn GMB bằng CC Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đường kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra. Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn n- BuOH trong MeOH, sau đó tẩm silicagel (cỡ hạt 40-63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi MeOH bay hơi hết thu được bột mịn tơi màu vàng thẫm. Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt. 100 gam silicagel được khuấy đều và ngâm trong dung môi điclometan cho trương nở trong 15 phút. Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi điclometan lên cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dưới cho dung môi chảy ra. Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho điclometan chảy qua nhiều lần để cột được nén đều. Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã được nén đều khoảng 4cm thì đưa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngược của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % điclometan, tiếp theo là hỗn hợp điclometan : MeOH theo tỉ lệ tăng dần MeOH, và cuối cùng dội cột với MeOH. Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút. Dung dịch rửa giải được thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự. Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau được gom lại, thu được 4 phân đoạn, kí hiệu là GMB I-IV. Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu được chất tinh khiết ở phân đoạn GMB II, kí hiệu là D4. Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chương 4: Kết quả và thảo luận 3.5.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết n-BuOH Chất D4: Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; hiện màu vàng nhạt với thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, hiện màu nâu đen với FeCl3 ở ngay nhiệt độ phòng Phổ 1H- NMR(500MHz, CDCl3, δ, ppm): 13.68(1H; s; OH-1); 6.83(1H; d; j= 3.6 Hz; H-4); 6.24(1H; s; H-5); 6.72(1H; d; J= 10 Hz; H-16); 5.56(1H; d; J= 10 Hz; H-17); 5.26(1H; m; J= 6 Hz, 3.6 Hz; H-12); 4.08(2H; d; J= 6 Hz; H-11); 3.80(3H; s; H-22); 1.83(3H; s; H-15); 1.69(3H; s; H-14); 1.46(6H; s; H-20, H-21). Phổ 13C- NMR(500 MHz, CDCl3, ppm): 182(C-9); 159.91(C- 3); 157.96(C-1); 156.31(C-4a); 155.77(C-10a); 154.56(C-6,7); 142.71(C-13); 137.04(C-8); 132.13(C-2); 127.13(C-17); 123.16(C-12); 115.74(C-16); 112.25(C-8a); 104.52(C- 9a); 77.94(C-18); 101.69(C-5); 94.16(C-4); 62.05(C-22); 28.33(C-20,21); 26.56(C-11); 25.79(C-15) và 18.21(C-14). 3.6. Thử hoạt tính sinh học. 3.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng l = 517 nm. Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1 mg/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%). EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học: Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH được trình bày trong chương 4: Kết quả và thảo luận. 3.6.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh 3.6.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (Inhibitor concentration 50% - nồng độ ức chế 50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ diệt khuẩn tối thiểu). 3.6.2.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: - Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh. - Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật. - Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. - Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. - Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật. - Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa. 3.6.2.3. Môi trường nuôi cấy MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm. 3.6.2.4. Cách tiến hành - Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256mg/ml và với chất sạch là 128mg/ml. Thử hoạt tính Lấy 10ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200ml dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 37oC/24h. - Xử lý kết quả + Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. + Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. + Giá trị MBC được xác định bằng đĩa thạch, trong đó có số khuẩn lạc tương đương với điều khiển (-). - Chất tham khảo + Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+); chủng E.c và S.e với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2mg/ml. + Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4-5mg/ml. + Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 mg/ml. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày trong chương 4: kết quả và thảo luận CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Điều chế các phần chiết Các chất trong măng cụt đươc chiết theo nguyên tắc tăng dần độ phân cực. Đầu tiên, vỏ măng cụt được ngâm chiết với etanol. Tiếp theo, dịch chiết etanol và nước được phân bố lần lượt với điclometan và n- Butanol. Qui trình chiết các lớp chất trong vỏ quả măng cụt được tóm tắt trong sơ đồ 4.1. Hiệu suất điều chế các phần chiết điclometan và n- Butanol từ vỏ măng cụt được nêu ra trong bảng 4.1 Bảng 4.1 Hiệu suất các phần chiết từ v