Luận văn Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn emodin từ đại hoàng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

u HQ vàng Vàng Vết chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát cắn 2-Hệ I Bảng 3.3. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 3 - H ệ I TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254nm UV 366nm Hiện vết bằng NH3 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 3 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng Vết chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát cắn 3-Hệ I Nhận xét: Qua quá trình khảo sát các cắn 1, 2, 3 thu được sau mỗi giai đoạn chiết xuất ta nhận thấy: Cả 3 cắn khi phát hiện màu bằng các cách nêu trên, trong số các vết thu được trên sắc ký đồ luôn có 1 vết có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Cắn 2 và cắn 1 có sắc ký đồ không khác nhau về số vết nhưng phần chưa tách khỏi điểm chấm của cắn 2 ít hơn của cắn 1. Cắn 3 cho số vết ít nhất và các vết tách khỏi nhau rõ nhất. Như vậy đến cắn 3 đã loại bớt được khá nhiều tạp chất. 3.1.2. Tinh chế Emodin 3.1.2.1. Lựa chọn dung môi rửa giải Từ cắn 3 thu được sau quá trình chiết xuất chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tìm qui trình tinh chế để thu được Emodin tinh khiết. Chúng tôi tiến hành phương pháp sắc ký cột để tinh chế Emodin từ cắn 3. Qua khảo sát một số hệ dung môi rửa giải chúng tôi nhận thấy: Nếu chỉ rửa giải bằng n-hexan thì không tách được riêng Emodin. Nếu rửa giải bằng hỗn hợp cloroform – methanol hoặc hỗn hợp ether dầu hoả - ether ethylic với các tỷ lệ thay đổi đều không tách riêng được Emodin. Dùng hỗn hợp n-hexan: ethylacetat với các tỷ lệ thay đổi thì nhận thấy nếu tỷ lệ ethylacetat nhiều thì Emodin bị dính vết khác. Qua khảo sát, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp n-hexan - ethylacetat với các tỷ lệ thay đổi như sau làm dung môi rửa giải: n-hexan - ethylacetat (98 : 2), (95:5), (93:7), (90:10). 3.1.2.2. Chuẩn bị cột sắc ký Chuẩn bị cột sắc ký làm bằng thuỷ tinh trung tính có đường kính 2,5 cm, chiều dài 30 cm được lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi. Khoá van, cho một ít n-hexan vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột, ngay trên van để silica gel sau khi được nhồi vào cột không gây tắc chuôi cột. Cân 25 g silica gel dùng cho sắc ký cột đem sấy ở 1000C trong 3 giờ để hoạt hoá silicagel. Để nguội silicagel trong bình hút ẩm rồi trộn với 150 ml n-hexan cho phân tán đều và chuyển hỗn hợp (silica gel : n-hexan) vào cột. Chú ý chuyển từ từ để tránh tạo bọt khí trong cột, mở khoá cho dung môi chảy bớt đi chỉ để dung môi luôn ở phía trên bề mặt silicagel khoảng 1 cm. Tiếp tục cho 100 ml n-hexan chảy qua với tốc độ 25 giọt/phút để rửa hệ thống. Sau đó khoá van và để ổn định cột trong 6 giờ. 3.1.2.3. Đưa mẫu lên cột Cân khoảng 0,1 g cắn 3 (tương đương với khoảng 50 g dược liệu Đại hoàng) thêm 30 ml n-hexan, lắc siêu âm 10 phút, thêm 1,5 g silica gel đã hoạt hoá vào hỗn hợp, khuấy nhẹ cho phân tán đều. Chuyển hỗn hợp này lên trên cột. Dùng n-hexan tráng rửa và chuyển hết hỗn hợp vào cột. Đặt một miếng bông nhỏ đã tẩm ướt bằng n-hexan lên trên cùng để tránh xáo trộn khi rót dung môi rửa giải lên trên cột. 3.1.2.4. Tiến hành rửa giải Cho hỗn hợp n-hexan : ethylacetat với các tỷ lệ đã khảo sát qua cột với tốc độ khoảng 25 giọt/phút, theo thứ tự sau: 200 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (98:2) 200 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (95:5) 500 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (93:7) 500 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (90:10) Hình 3.5. Hệ thống sắc ký cột tự tạo để tinh chế Emodin Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml. Kiểm tra từng ống nghiệm bằng SKLM với hệ dung môi I: cloroform - methanol (90:10). Chấm riêng biệt lên trên bản mỏng 100 ml dung dịch rửa giải trong từng ống nghiệm và 5 ml dung dịch chuẩn Emodin nồng độ 2 mg/ml. Sau khi triển khai sắc ký sẽ phát hiện vết bằng 4 cách: quan sát dưới ánh sáng thường, quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm, UV 366 nm và hiện màu bằng hơi NH3 bão hoà. Các ống có thành phần tương tự được gộp lại thành một phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân đoạn: Phân đoạn 1 cho 1 vết màu tím nhạt khi quan sát dưới đèn UV 254 nm, và có giá trị Rf khác vết chuẩn Emodin. Phân đoạn 2 cho 1 vết có màu thay đổi theo cách phát hiện vết, có giá trị Rf khác vết chuẩn Emodin. Phân đoạn 3 cho 1 vết khi quan sát dưới ánh sáng thường, 2 vết khi quan sát dưới cả 2 đèn tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm. Phân đoạn 4 cho 1 vết khi quan sát dưới ánh sáng thường và dưới đèn tử ngoại UV 366 nm, 2 vết khi quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm. Phân đoạn 5 khi phát hiện vết bằng các cách khác nhau đều cho 1 vết có màu sắc và giá trị Rf tương tự vết Emodin chuẩn . Kết quả khảo sát các phân đoạn được thể hiện ở bảng 3.4 và các hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10. Bảng 3.4. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của các phân đoạn khi khảo sát với hệ dung môi I Phân đoạn TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 1 1 0,74 - Tím nhạt - - 2 1 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng 3 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 3 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng 4 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 5 1 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Vết chuẩn 1 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 1- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 2 - Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 3- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.9. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 4- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ I Nhận xét: Qua khảo sát các phân đoạn với hệ dung môi I thì thấy phân đoạn 5 khi phát hiện vết bằng 4 cách đã nêu đều cho 1 vết duy nhất có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Để khẳng định phân đoạn 5 chỉ có một vết duy nhất tương tự vết chuẩn Emodin chúng tôi tiếp tục triển khai SKLM phân đoạn 5 song song với dung dịch chuẩn Emodin trên 2 hệ dung môi II và III. Hệ II gồm: n-hexan - ethylacetat (2: 1) và hệ III gồm: ether dầu hoả - ethyl acetat - acid formic (75:25:1), cách tiến hành sắc ký như mục 3.1.2.4. Kết quả cũng cho thấy phân đoạn 5 luôn cho 1 vết duy nhất có vị trí (giá trị Rf) và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Kết quả khảo sát phân đoạn 5 trên hệ dung môi II và III được thể hiện ở bảng 3.5 và các hình 3.11, 3.12. Bảng 3.5. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của phân đoạn 5 khi khảo sát với hệ dung môi II và III Hệ dung môi Vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254nm UV 366nm Hiện vết bằng NH3 II Chuẩn 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam III Chuẩn 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ vàng cam Đỏ cam Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ vàng cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ II Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ III Nhận xét: Từ kết quả khảo sát phân đoạn 5 trên 3 hệ dung môi và 4 cách phát hiện vết khác nhau đều cho thấy phân đoạn 5 có một vết tương tự vết chuẩn Emodin, chúng tôi bay hơi dung môi của phân đoạn 5 thu được cắn 4. Loại chất tan trong nước trong cắn 4 bằng cách thêm nước vào cắn 4 theo tỷ lệ 250 ml nước cho 100 mg cắn 4, lắc siêu âm 15 phút, lọc lấy cắn , đem sấy cắn này ở 600C trong 48 giờ, và làm khô thêm trong bình hút ẩm chứa silica gel trong 48 giờ thu được sản phẩm tinh chế cuối cùng là dạng bột có màu vàng cam gọi là cắn Emodin hay Emodin tinh chế được (Hình 3.13). Hình 3.13. Ảnh chụp cắn Emodin 3.2. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 3.2.1. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM Tiến hành: Hệ dung môi triển khai sắc ký: + Hệ I gồm: Cloroform - methanol (90:10) + Hệ II gồm: n-hexan - ethylacetat (2: 1) + Hệ III gồm: ether dầu hoả - ethyl acetat - acid formic (75:25:1) Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) đã được hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. Dung dịch chuẩn: Dung dịch Emodin chuẩn trong methanol có nồng độ 2 mg/ml. Dung dịch thử : Hoà tan 2 mg cắn Emodin trong 1 ml methanol Phát hiện vết bằng 4 cách: + Quan sát dưới ánh sáng thường + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 366 nm + Hiện vết bằng hơi amoniac bão hoà Chấm riêng biệt lên trên bản mỏng 5 ml các dung dịch thử và dung dịch chuẩn, đồng thời chấm chồng 5 ml dung dịch chuẩn và 5 ml dung dịch thử. Sau khi triển khai sắc ký lấy bản mỏng ra để bay hơi hết dung môi và phát hiện vết bằng các cách trên. Kết quả khảo sát cắn Emodin được thể hiện ở bảng 3.6 và các hình 3.14, 3.15, 3.16. Bảng 3.6. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn Emodin khi khảo sát với hệ dung môi I, II và III Hệ dung môi Vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 I Chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam II Chuẩn 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam III Chuẩn 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.14. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.15. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ II Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ III Nhận xét: Qua khảo sát Emodin tinh chế được bằng SKLM trên cả 3 hệ dung môi khai triển với 4 cách phát hiện vết nói trên cho thấy, trên sắc ký đồ thu được khi chấm riêng biệt dung dịch thử (dung dịch Emodin tinh chế được) và khi chấm chồng dung dịch chuẩn và dung dịch thử đều cho 1 vết duy nhất có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Điều này cũng chứng tỏ Emodin tinh chế được khá tinh khiết. 3.2.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy của Emodin tinh chế được Đưa một lượng cắn Emodin đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ tinh đường kính 1 mm, chiều dài 10 cm để tạo ra khối bột chiều cao khoảng 5 mm và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy BUCHI 535. Kết quả đo điểm chảy được thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cắn Emodin Nhiệt độ Lần đo Bắt đầu chảy (0C) Chảy hoàn toàn (0C) 1 256,6 257,1 2 256,4 257,2 3 256,3 257,2 4 256,2 257,3 5 256,4 257,1 6 256,5 257,2 TB 256,4 257,2 RSD (%) 0,055 0,029 Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy trung bình của cắn Emodin từ 256,30C đến 257,20C là phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của Emodin theo lý thuyết (từ 256 0C đến 2570C) [42]. Điều này chứng tỏ sản phẩm Emodin tinh chế được khá tinh khiết. Giá trị RSD thấp (0,055 % và 0,029 %) cho thấy kết quả đo điểm chảy khá chính xác. 3.2.3. Đo phổ hồng ngoại của Emodin tinh chế được Cân 50 mg Kali bromid và 2 mg cắn Emodin, trộn lẫn bằng cối mã não. Lấy một lượng nhỏ hỗn hợp trên (khoảng 13 mg) làm thành viên nén bằng kìm nén nhanh tạo thành viên nén mỏng và trong. Đặt viên nén vào buồng chứa mẫu. Tiến hành thao tác trên phần mềm của máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR để đo phổ IR của viên nén vừa tạo thành. Song song tiến hành với mẫu chuẩn Emodin. So sánh phổ IR của mẫu thử với phổ IR của mẫu chuẩn ta thấy vị trí và số lượng các đỉnh là tương tự nhau. Vậy cắn Emodin thu được đúng là hợp chất Emodin. (Phụ lục 1) 3.3. Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 3.3.1. Phân tích khối phổ Phổ MS của cắn Emodin được ghi trên thiết bị 5989B.HP-MS bằng phương pháp đưa mẫu trực tiếp, bắn phá dòng electron có năng lượng 70eV. Trên phổ thấy rõ pic phân tử đồng thời là pic cơ bản có giá trị M+m/z = 270 amu tương ứng đúng với phân tử lượng của Emodin. Tra thư viện phổ Winley 275L cho thấy phổ của mẫu đo trùng với phổ Emodin lưu trữ trong thư viện tới 95 % và cấu trúc được ghi nhận theo danh pháp chuẩn là 1,3,8-tri hydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedion. (Phụ lục 2) 3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Các dạng phổ NMR đã được ghi với cắn Emodin là 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135, 1H-NMR, HSQC và HMBC. 3.3.2.1.Bộ phổ 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135 Bộ phổ 1D-13C-NMR chỉ rõ cấu trúc của mẫu gồm 15 cacbon với một nhóm –CH3, 4 nhóm –CH– và 10 nhóm C bậc 4 (–C–). Đây là một cấu trúc đơn giản nên các pic đều mang tính đặc trưng. Hai pic ở 189,690 ppm và 181, 368 ppm rất đặc trưng cho hai nhóm –C=O. Bốn pic –CH= đều có độ dịch chuyển hoá học đặc trưng cho –CH= nhân thơm (107,910 ppm; 108,747 ppm; 120,453 ppm và 124,109 ppm). Pic –CH3 có độ dịch chuyển 21,490 ppm chính là –CH3 gắn vào nhân thơm. Ba nhóm –C– có độ dịch chuyển 161,393 ppm; 164,425 ppm và 165,543 ppm chính là cacbon bậc 4 của nhân thơm liên kết với –OH. Như vậy phổ 1D-13C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của Emodin. 3.3.2.2. Bộ phổ 1H-NMR, HSQC Phổ 1H-NMR của mẫu bao gồm 5 pic: 4 pic của –CH= nhân thơm đều là vạch rộng hoặc tách vạch với giá trị J rất nhỏ (» 2HZ ) chứng tỏ các nhóm –CH= đều cách nhau 1 cacbon bậc 4. Phổ HSQC cho phép nhận dạng 2 pic –OH ở 12,072 ppm và 12,000 ppm. Đây là 2 nhóm –OH có khả năng lập cấu trúc hydro với oxy của ceton. Nhóm OH còn lại bị trải rộng chỉ nhận ra được qua gờ nổi trên đường nền ở khoảng 11,4 ppm. Nhóm –CH3 là 1 vạch đơn có độ dịch chuyển 2,406 ppm. 3.3.2.3. Phổ HMBC Phổ HMBC có vai trò đặc biệt quan trọng cho phép phân biệt 1–OH (d =12,072 ppm ) và 8–OH (d = 12,000 ppm). Nhờ phổ HMBC sự phân định vị trí C=O (9) và C=O (10) trở nên rõ ràng vì C=O (10) có tương quan với –CH= (5) và –CH=(4). Mặt khác vị trí thế của 3 nhóm –OH và nhóm –CH3 cũng được kiểm tra Kết quả: Qua bộ phổ NMR mẫu nghiên cứu đã được khẳng định là Emodin. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cắn Emodin được thể hiện ở bảng 3.8 và phụ lục 3. 3.3.2.4. Bộ phổ mô phỏng ACD-NMR Để tăng độ tin cậy của các kết quả trên, phổ mô phỏng của Emodin được xây dựng bằng phần mềm ACD/NMR DB. So sánh các số liệu của phổ mô phỏng và các số liệu phân tích thực nghiệm với mục đích để kiểm tra kết quả thực nghiệm cho thấy kết quả thực nghiệm hoàn toàn phù hợp. Bảng 3.8. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cắn Emodin (Thiết bị Bruker Avance 500, dung môi DMSO – D6) TT Nhóm C 13C-NMR (d : ppm) 1H-NMR (d : ppm; J: Hz) HMBC 1 C 164,425 C1-H1; C1-H2 2 CH 107,910 6,586 (dd) J2-4 = 2,5; J2-OH =1,5 H2-C3; H2-C1, H2-C4; C2-H1; C2-H4 3 C 165,543 C3-H2; C3-H4 4 CH 108,747 7,108 (dd) J4-OH = 2, J4-2 = 2,5 H4-C3; H4-C2; H4-C10 5 CH 120,453 7,478 (pic rộng) H5-C10; H5-C7; H5-C8a; C5-H7; C5-H6’ 6 C 148,233 C6-H6’ 7 CH 124,109 7,154 (pic rộng) H7-C8; H7-C8a; C7-H8; C7-H6; C7-H5 8 C 161,393 C8-H8’; C8-H7 9 C=O 189,690 10 C=O 181,363 C10-H4, C10-H5 4a C 135,093 4b C 132,798 8a C 113,352 C8a-H8; C8a-H5; C8a-H7 9a C 108,939 C9a-H1; C9a-H4 6’ CH3 21,490 2,406 (s ) C6’-H5 ; C6’-H7 ; H6’-C5; H6’-C7; H6’-C6 1’ OH 12,072 (s ) H1’-C2 ; H1’-C9a ; H1’-C1 3’ OH 11,350 (pic rộng) 8’ OH 12,000(s) H8’-C8a ; H8’-C7; H8’-C8 Trong đó: d: là độ dịch chuyển hoá học, J: là hằng số tương tác 3.4. Định tính, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng HPLC 3.4.1. Xây dựng qui trình kỹ thuật để định tính, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng phương pháp HPLC với detector UV 3.4.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký Qua tham khảo một số tài liệu [31], [32], [38], [41], [43], [44], [45], [48], [49], chúng tôi chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến định lượng Emodin tinh khiết chủ yếu là định lượng Emodin trong dược liệu, trong chế phẩm thuốc hay trong huyết tương chuột. Cách định lượng Emodin trong các tài liệu nêu trên đều bằng phương pháp HPLC với detector UV, có sử dụng cột C18 với chương trình gradient dung môi pha động và có sự điều nhiệt cột sắc ký. Cách tiến hành như thế khá phức tạp đòi hỏi hệ thống sắc ký phải có bộ phận điều nhiệt và máy HPLC phải chạy được chế độ gradient dung môi. Vì thế dựa trên một số tài liệu tham khảo [29], [33] và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để định tính và lượng Emodin tinh chế được như sau: Cột sắc ký Apollo C18 ( 250´ 4,6 mm; 5 mm) Detector UV: l=254 nm Pha động: Methanol - dung dịch acid phosphoric 0,1 % (85 : 15) Tốc độ dòng 2,0 ml/phút Nồng độ dung dịch tiêm sắc ký khoảng 50 mcg/ml Thể tích tiêm 20 ml Dung môi pha mẫu : methanol P.A Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm 3.4.1.2. Thử tính thích hợp của hệ thống Trước khi tiến hành sắc ký, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn C1 được chuẩn bị ở mục 3.4.3 vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả về thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối của pic, số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng Emodin tinh chế được TT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.min) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết 1 4,379 1376187 1,044 4314 2 4,375 1371476 1,040 4325 3 4,312 1381143 1,033 4293 4 4,342 1381467 1,040 4325 5 4,319 1378230 1,031 4283 6 4,301 1381730 1,034 4282 TB 4,338 1378372 4304 RSD (%) 0,76 0,29 Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,76 % và 0,29 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 1,031 đến 1,044) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 4304 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng Emodin tinh chế được. 3.4.1.3. Xây dựng phương pháp định lượng Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5,00 mg Emodin chuẩn cho vào bình định mức dung tích 50 ml. Hoà tan và pha loãng bằng methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức dung tích 20 ml và pha loãng với methanol tới đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 mm được dung dịch chuẩn để tiêm sắc ký. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5,00 mg Emodin tinh chế được cho vào bình định mức dung tích 50 ml. Hoà tan và pha loãng bằng methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức dung tích 20 ml và pha loãng với methanol tới đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 mm được dung dịch thử để tiêm sắc ký. Điều kiện sắc ký: Như mục 3.4.1.1 Tính kết quả: Ghi lại diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng Emodin có trong mẫu thử dựa trên mẫu chuẩn Emodin đã biết hàm lượng theo công thức sau: (3.1) Trong đó: ST, SC : là diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.min) mT, mC : là lượng cân tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg) CC : là hàm lượng của Emodin chuẩn (%) 3.4.2. Định tính Emodin tinh chế được Chuẩn bị các điều kiện sắc ký và pha các dung dịch chuẩn và thử như mục 3.4.1.3. Cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong 30 phút. Tiêm lần lượt 20 ml dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu của pic ở dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Kết quả dung dịch thử cho pic có thời gian lưu (tR = 4,306 phút) tương tự thời gian lưu của pic Emodin ở dung dịch chuẩn (tR = 4,379 phút). (Hình 3.17 và 3.18) Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin tinh chế được Hình 3.18. Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin tinh chế được Sử dụng phần mềm LCsolution để xác định phổ UV-VIS của mẫu thử và mẫu chuẩn. Tiến hành chồng phổ pic Emodin của mẫu thử và mẫu chuẩn. Ta thấy phổ UV-VIS của mẫu chuẩn và mẫu thử chồng khít lên nhau. Các dung dịch chuẩn và thử đều cho 4 cực đại hấp thụ trong vùng UV-VIS gần giống như lý thuyết là: 222 nm, 254 nm, 288 nm, 440 nm. Kết quả chồng phổ cho thấy phổ thu được của mẫu thử và mẫu chuẩn hoàn toàn giống nhau (hệ số similarity là 0,999984 khá gần 1). (Hình 3.19 và 3.20). Mẫu chuẩn Mẫu thử Hình 3.19. Phổ UV-VIS của mẫu chuẩn và mẫu thử khi định lượng Emodin tinh chế được Hình 3.20. Kết quả chồng phổ pic Emodin của mẫu chuẩn và mẫu thử khi định lượng Emodin tinh chế được Nhận xét: Các kết quả thực nghiệm chứng tỏ rằng mẫu thử (sản phẩm tinh chế được) đúng là Emodin. Trên cơ sở kết quả chồng phổ pic Emodin của mẫu chuẩn và mẫu thử, đồng thời sử dụng phần mềm LCsolution để xác định mức độ tinh khiết của các pic sắc ký, ta nhận thấy pic sắc ký ở dung dịch thử khá tinh khiết với hệ số “peak purity”, đều bằng 1, không phát hiện thấy pic tạp (impurity not detected) lẫn vào pic Emodin. (Hình 3.21). Điều này cho thấy chương trình HPLC có khả năng tách tốt chất Emodin đồng thời cũng góp phần đánh giá Emodin tinh chế được khá tinh khiết. Dung dịch chuẩn Dung dịch thử Hình 3.21. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic Emodin khi định lượng Emodin tinh chế được 3.4.3. Định lượng Emodin tinh chế được Tiến hành định lượng bằng phương pháp xây dựng ở mục 3.4.1.3. Trong đó chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn và 6 dung dịch thử để tiêm sắc ký. Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn 1 để xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký (mục 3.4.1.2), tiêm 3 lần dung dịch chuẩn 2 và lấy giá trị diện tích pic trung bình của các dung dịch chuẩn để tính toán kết quả 6 mẫu thử. Tính hàm lượng Emodin trong mẫu thử theo công thức (3.1), mục 3.4.1.3. Các mẫu thử 1, 2, 3 được tính theo mẫu chuẩn 1, các mẫu thử 4, 5, 6 được tính theo mẫu chuẩn 2. Kết quả định lượng cuối cùng sẽ được tính là trung bình cộng của các kết quả hàm lượng tìm ra. Kết quả định lượng được thể hiện ở bảng 3.10. Bảng 3.10. Kết quả định lượng Emodin tinh chế được Mẫu Lượng cân (mg) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) Mẫu Lượng cân (mg) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) Chuẩn 1 5,15 TB = 1378372 98,32 Chuẩn 2 5,71 TB = 1543307 98,32 Thử 1 4,92 1287890 96,16 Thử 4 5,27 1402590 96,82 Thử 2 5,38 1419766 96,94 Thử 5 5,33 1409927 96,23 Thử 3 5,21 1369287 96,55 Thử 6 5,90 1565425 96,52 Thông số thống kê 96,54 % S = 0,310 SX = 0,127 RSD = 0,32 % rX=ta.SX = 0,33 % Khoảng tin cậy: ± ta.SX = 96,54 ± 0,33 (%) Kết luận: Kết quả trình bày ở bảng 3.10 cho thấy Emodin tinh chế được có hàm lượng là 96,54 ± 0,33 %. 3.4.4. Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được Tiến hành phương pháp HPLC detector UV, với các điều kiện sắc ký tương tự như mục 3.4.1.1. Chuẩn bị các dung dịch để tiêm sắc ký: Dung dịch thử: Hoà tan Emodin tinh chế được trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng methanol. Chuẩn bị 3 dung dịch thử và 3 dung dịch đối chiếu tương ứng. Tiêm các dung dịch đối chiếu và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Thời gian chạy sắc ký đối với dung dịch thử gấp 4,6 lần thời gian lưu của pic Emodin ở dung dịch đối chiếu. Ghi lại sắc ký đồ các dung dịch chuẩn và dung dịch thử. (Hình 3.22, 3.23) Hình 3.22. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được Hình 3.23. Sắc ký đồ dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được Dùng phần mềm LCsolution tính toán các thông số của các pic phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử (Bảng 3.11). Từ các thông số này đánh giá khả năng tách của chương trình sắc ký đối với các pic tạp. Bảng 3.11. Một số thông số của các pic phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được Dung dịch thử Pic phụ Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.min) Hệ số bất đối Độ phân giải với pic kề trước Độ phân giải với pic kề sau Số đĩa lý thuyết 1 1 3,021 25600 1,199 - 5,512 3499 2 6,187 37863 0,988 6,679 8,160 6349 3 9,432 38145 1,067 8,160 12,976 6057 4 18,512 168665 1,042 12,976 - 6552 2 1 3,072 24520 1,205 - 5,536 3534 2 6,326 44401 1,043 6,610 8,252 6143 3 9,738 37806 1,001 8,252 12,712 5970 4 18,780 167038 0,999 12,712 - 6689 3 1 3,045 26118 1,231 - 5,484 3388 2 6,268 45851 1,025 6,622 8,332 6097 3 9,596 35588 1,068 8,332 12,633 6458 4 18,735 178702 1,014 12,633 - 5979 Nhận xét: Các pic phụ thu được trên sắc ký đồ của các dung dịch thử đều khá cân đối