Luận văn Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm

hồi máu) và trong dùng điều trị kéo dài. Các tác dụng này của Lumbrokinase tái tổ hợp tương đương với thuốc chuẩn Boluoke (lumbrokinase) của Canada. Năm 2018, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hoàng và cộng sự cũng đã xác định độc tính cấp và bán trường diễn của lumbrokinase tái tổ hợp. Kết quả cho thấy lumbrokinase không gây độc trên động vật thực nghiệm. Giá 21 trị LD 50 của lumbrokinase tái tổ hợp trên chuột nhắt trắng qua đường tiêu hoá khi theo dõi 7 ngày là không xác định được, 100% chuột sống sót sau 7 ngày uống lumbrokinase với liều lượng 50 mg/kg thể trọng. Sản phẩm lumbrokinase tái tổ hợp không gây ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ thí nghiệm cũng như hình ảnh vi đại thể của tế bào gan chuột sau khi uống chế phẩm 45 ngày [48]. Các nghiên cứu về quy trình kiểm tra giám sát chất lượng các thuốc và thực phẩm chức năng điều trị các bệnh huyết khối cũng đã được công bố. Năm 2010, Nguyễn Thanh Thảo - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã nghiên cứu và xây dựng thành công phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase trong chế phẩm chứa đồng thời hai enzyme là streptokinase và streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải trên đĩa thạch agarose. Phương pháp có độ đúng, độ lặp lại cao và độ tuyến tính nằm trong khoảng từ 9 đến 28050 đơn vị streptokinase/ml. Phương pháp này có tác dụng thiết thực trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp cả hai enzyme này với trang thiết bị và các hóa chất thông dụng, kỹ thuật không phức tạp, có thể thực hiện được ở các cơ sở kiểm nghiệm cấp tỉnh, thành phố và các doanh nghiệp [49]. Năm 2019, Nguyễn Thị Hằng và cs đã tiến hành thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang. Các kết quả thực nghiệm của nhóm tác giả chứng minh rằng quy trình xác định hoạt lực nattokinase bằng phương pháp đo quang có độ đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép về thẩm định phương pháp phân tích các hoạt chất sinh học, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ enzyme đem phản ứng và chênh lệch độ hấp thụ của hỗn hợp enzyme cơ chất sau phản ứng trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,69 đến 1,34 FU/ml. Từ đó cho thấy rằng có thể áp dụng phương pháp đo quang để xác định hoạt lực của nattokinase trong các chế phẩm có chứa enzyme này [50]. Mặc dù cả trong nước và trên thế giới đều đã có nhiều công trình nghiên cứu về lumbrokinase cả chế phẩm tự nhiên lẫn chế phẩm tái tổ hợp, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu dừng lại ở mức độ tinh sạch, thử hoạt tính 22 và đánh giá các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này. Các nghiên cứu về độ ổn định và các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm này còn hạn chế. Xuất phát từ tình hình đó chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu tạo chế phẩm lumbrokinase chất lượng cao và an toàn, góp phần vào công tác sản xuất các chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng phục vụ hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối, một căn bệnh rất nguy hiểm và đáng quan tâm hiện nay. 23 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu Giun quế (Perionyx escavatus) được thu mua từ trang trại giun quế GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội. 2.1.2. Hóa chất Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều là các hóa chất tinh khiết, của các hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính được kê ở bảng 2.1. Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất (nước) Acrylamide, temed, bộ thuốc nhuộm Gram, thuốc thử N, N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid Merck (Đức) Acetone, butanol, ethanol, methanol, amonium sulphate Xilong (Trung Quốc) Bộ Kit API 20E, regent kit Biomerieux (Pháp) SDS, thrombin, plasmin, fibrinogen Sigma (Mỹ) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Schalau (Tây Ban Nha) Thang protein chuẩn Fermentas (Latvia) Cột cut off 10 kda và 50 kDa Millipore (Đức) 2.1.3. Các dung dịch và đệm Các loại dung dịch và đệm dùng trong thí nghiệm đều được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn, có thành phần và nồng độ theo bảng 2.2. 24 Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dich Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue G250, 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch Bradford working 425 ml H2O, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88% phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc Dung dịch A Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8,8 Dung dịch B Đệm 0,5 M tris HCl, pH 6,8 Dung dịch C 30% acrylamide, 0,8% bis- acrylamide Dung dịch D 10% SDS, 10 mM EDTA Dung dịch đệm phosphate pH 7,2 gốc 34 g KH2PO4 trong 1000 ml nước cất Dung dịch đệm phosphate pH 7,2 working Pha loãng dung dịch đệm pH 7,2 gốc 800 lần Dung dịch đệm hoạt hóa túi thẩm tích 10 mM NaHCO3, 1 mM EDTA Dung dịch đệm potassium phosphate 1M K2HPO4 1 M, KH2PO4 1 M pha trong nước cất, pH 7,4 Dung dịch đệm potassium phosphate 20 mM Pha loãng đệm potassium phosphate 1 M 50 lần Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) 25 methanol; 10% (v/v) acid acetic Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic Đệm điện di protein 20 mM tris HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,8 Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M tris HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol 2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Các môi trường nuôi cấy đều được pha dựa trên công thức chuẩn của Dược Điển Việt Nam 5 và một số Dược Điển nước ngoài [51], [52]. Công thức pha chế môi trường theo bảng 2.3. Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường Thành phần Môi trường thạch casein đậu tương Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g; bột đậu tương thủy phân bởi papain 5,0 g; natri chloride 5,0 g; thạch 15,0 g, nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2. Môi trường lỏng casein đậu tương Casein thủy phân bởi pancreatin 17,0 g; dikali hydrophosphate 2,5 g; bột đậu tương thuỷ phân bởi papain 3,0 g; glucose 2,5 g; natri chloride 5,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2. Môi trường thạch Sabouraud – dextrose Glucose monohydrate 40,0 g; peptone 5,0 g; casein thủy phân bởi pancreatine 5,0 g; thạch 15,0 g; cloramphenicol 50 mg; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 5,6 ± 0,2. Môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria - Mossel Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; glucose monohydrate 5,0 g; mật bò khô 20,0 g; kali dihydrophosphate 2,0 g; dinatri hydrophosphate 8,0 g; xanh briliant 15 mg; nnước tinh khiết 1000 ml; pH sau tiệt khuẩn 7,2± 0,2. Đun sôi trong 30 phút và 26 làm lạnh ngay. Môi trường muối mật violet-red Cao nấm men 3,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatine 7,0 g; muối mật 1,5 g; natri clorid 5,0 g; glucose monohydrat 10,0 g; đỏ trung tính 30 mg; tím tinh thể 2 mg; thạch 15,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau tiệt trùng 7,2± 0,2. Môi trường được đun sôi để tiệt trùng. Môi trường lỏng Mac-Conkey Gelatin thủy phân từ pancreatin 20,0 g; llactose monohydrate 10,0 g; mật bò khô 5,0 g; tía bromocresol 10,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2 Môi trường thạch Mac - Conkey Natri clorid: 5,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatin: 17,0 g; thạch: 13,5 g; pepton: 3,0 g; đỏ trung tính: 30,0 mg; lactose: 10,0 g; tím tinh thể: 1,0 mg; muối mật: 1,5 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,1 ± 0,2 Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; dikali hydrophosphat 2,0 g; thạch 10,0 g; lactose 10,0 g; eosin Y 0,4 g; xanh methylene 0,065 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,1 ± 0,2. Môi trường thạch muối - manitol Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; thạch 15,0 g; pepton 5,0 g; đỏ phenol 0,025 g; cao thịt bò 1,0 g; natri clorid 75,0 g; D- manitol; 10,0 g; nước cất 1000 ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,4 ± 0,2. Môi trường thạch xylose – lysin – desoxycholat Xylose 3,5 g; L-lysin 5,0 g; lactose monohydrate 7,5 sucrose 7,5 g; natri chloride 5,0 g; cao nấm men 3,0 g; đỏ phenol 80 mg; thạch 13,5 g, natri desoxycholat 2,5 g; natri thiosulphate 6,8 g; sắt amoni citrate 0,8 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau tiệt khuẩn 7,4 ± 0,2. Tiệt khuẩn bằng cách đun sôi. Môi trường lỏng tăng sinh Salmonella Peptone đậu tương 4,5 g; magnesi clorid hexahydrate 29,0 g; natri chloride 8,0 g; dikali phosphate 0,4 g; kali dihydrophosphate 0,6 g; xanh malachite 0,036 g; nước tinh khiết 27 Rappaport Vassiliadis vừa đủ 1000 ml, pH sau khi tiệt khuẩn 5,2 ± 0,2 Môi trường thạch xanh Brilliant Peptone 5,0 g; đường trắng 10,0 g; cao men bia 3,0 g; đỏ phenol 80 mg; casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; lactose 10,0 g; xanh brilliant 12,5 g; natri chloride 5,0 g; thạch 20,0 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml. pH sau khi tiệt khuẩn 6,9 ± 0,2 Môi trường thạch – sắt – ba đường Casein thủy phân từ pancreatin 10,0 g; sắt (II) amonisulfat 0,3 g; peptone 20,0 g; natri chloride 5,0 g; lactose 20 g; natri thiosulfat 0,3 g; đường trắng 10,0 g; thạch 12,0 g; D-glucose monohydrate 1,0 g; đỏ phenol 0,025 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml. pH sau khi tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2 2.1.5. Chủng vi sinh vật Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh Tên chủng Hãng sản xuất (nước) Staphylococcus aureus ATCC 6538 Biologic (Mỹ) Escherichia coli ATCC 8739 Salmonella tiphymurium ATCC 14028 2.1.6. Máy móc và thiết bị Các máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu hiện đại và có độ chính xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học và Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (Bảng 2.5). toàn bộ phép thử vi sinh được tiến hành trong phòng thí nghiệm vi sinh của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP, ISO/IEC 17025 và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm tiền đánh giá của WHO. 28 Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Xuất xứ (hãng, nước sản xuất) Cân phân tích BL10S Hệ thống điên di ngang Hệ thống lọc nước RO Hệ thống tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật Máy đo pH Máy Votex OSI Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Máy li tâm lạnh CF1 RXII Máy quang phổ UV 200 Nồi hấp tiệt trùng Tủ an toàn sinh học Safe fast lite Tủ ổn nhiệt MIR 12 Tủ lạnh 4oC GR N4 VTV Tủ lạnh sâu -20oC VCF 280 Tủ lạnh sâu -84oC MDF 192 Sartorius (Đức) Biorad (Mỹ) Merck (Đức) Memmert (Đức) Metler Toleto (Trung Quốc) Rotolab (Đức) Hettich (Đức) Hitachi (Nhật Bản) Labomed (Mỹ) Tomy Kygyo, Hyrayama (Nhật) Faster (Ý) Sanyo (Nhật) Toshiba (Nhật) Deawoo (Hàn quốc) Sanyo (Nhật Bản) 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô Giun quế Perionyx excavatus được thu mua từ trại nuôi giun quế GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội. Sau khi ngâm và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại hết các chất cặn bã trong đường tiêu hóa, lựa chọn những cá thể còn sống, khỏe mạnh, đang trong thời kì sinh sản, có đai sinh dục để sử dụng cho thí nghiệm. Nghiền đồng thể 100 g giun đã rửa sạch với 400 ml NaCl 0,9%, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên. Dịch trên tiếp tục được ly tâm 29 12000 vòng/phút, trong 15 phút, thu được dịch enzyme thô. Sử dụng dịch enzyme thô này cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase 2.2.2.1. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ Nguyên tắc của phương pháp này là khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm vì thế tạo ra kết tủa. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn loại dung môi là acetone, butanol, ethanol và methanol. Sử dụng 5 ml dịch thô, thêm 20 ml dung môi (tỉ lệ 1:4), tủa ở -200C trong 30 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa. Hòa tủa bằng đệm potassium phosphate 20 mM pH 7,4. 2.2.2.2. Phương pháp tủa muối amonium sulphate Nguyên tắc của phương pháp này là dựa và sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (trong đó có enzyme) ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch enzyme thô ban đầu. Dịch enzyme thô được tủa muối amonium sulphate ở các nồng độ: 30%, 40%, 50%, 60% và 70%, các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 40C. Lượng muối amonium sulphate được thêm vào các dung dịch tủa được tính theo công thức [53]: G = 515 x (X – X0)/100 – 0,27 x X Trong đó: G: Số gram muối amonium sulphate cần thêm vào dịch enzyme X: Độ bão hòa cần thiết X0: Độ bão hòa cho trước Tủa protein thu được hòa tan trong đệm potassium phosphate 20 mM, pH 7,4 và được loại muối bằng phương pháp thẩm tích. 30 Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm tích sau đó cho dịch tủa thu được vào túi, đặt túi thẩm tích trong nước cất lạnh, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ để loại muối, trong quá trình thẩm tích thay nước cất lạnh khoảng 2h/lần. Toàn bộ quá trình thẩm tích được thực hiện ở 40C. Dịch enzyme sau khi tủa và thẩm tích loại muối được đo hàm lượng protein và xác định hoạt tính thủy phân fibrin. Phân đoạn có hoạt tính riêng cao nhất sẽ tiếp tục được tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100. 2.2.2.3. Phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G100 Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra, dựa trên mức độ di chuyển khác nhau của các phân tử đó trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký. Mẫu được nạp vào đầu một cột có chứa các hạt làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao. Sephadex là một loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100 μm, được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran và epichlorohydrin. Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn hơn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước. Phân tử có kích thước trung bình có thể thỉnh thoảng đi được vào bên trong hạt sẽ rời cột ở vị trí giữa và những phân tử nhỏ sẽ phải đi đoạn đường dài hơn nên sẽ ra khỏi cột sau cùng [54]. Cột có kích thước 26 x 0,6 cm được cân bằng với đệm 20 mM potassium phosphate pH 7,4. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml, thu được 24 phân đoạn các phân đoạn thu được được đo hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân fibrin, và điện di trên gel polyacrylamide 12,5 %. 2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch bằng cột cut off Sử dụng cột cut off 10 kDa và 50 kDa để tinh sạch mẫu. Phân đoạn enzyme có hoạt tính riêng cao nhất sau khi qua cột sephadex G100 được chuyển lên cột cut off 10 kDa, ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, thu toàn 31 bộ pha trên. Phần dịch pha trên được chuyển lên cột cut off 50 kDa ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút để tách các protein có kích thước lớn hơn hoặc bằng 50 kDa ra khỏi hỗ hợp. Sản phẩm sau đó được kiểm tra hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân casein, hoạt tính thủy phân fibrin và điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. 2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp đĩa fibrin của Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ thể người) làm chuẩn [55]. Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân fibrin bằng LK tạo vòng tròn trong suốt. Đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Hoạt tính thủy phân fibrin của LK được xác định dựa trên đường chuẩn plasmin. Tiến hành: Chuẩn bị đĩa: Mỗi đĩa petri đường kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch fibrinogen tinh khiết trong NaCl 0,9% (nồng độ 0,2%) được ngưng kết bằng 15 µl thrombin (100 UI/ml). Chú ý, đĩa đặt ở vị trí phẳng, dung dịch được đổ cho đồng đều, tránh tạo bọt khí. Đĩa được để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để fibrin đông tụ hoàn toàn. Ủ phản ứng: Nhỏ từng giọt 10 μl dịch enzyme lên đĩa (giọt phải tròn), ủ 37oC trong 5 giờ. Khi đông tụ, fibrin có màu trắng đục, do đó, các vùng bị thủy phân trở nên trong suốt, dễ dàng quan sát bằng mắt thường. Sau 5 giờ, đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình. Xây dựng đường chuẩn plasmin: Để xác định chính xác hoạt tính của enzyme nghiên cứu cần xây dựng đường chuẩn hoạt tính. Hoạt tính của enzyme thủy phân fibrin thường được so sánh với hoạt tính của plasmin, là enzyme thủy phân fibrin trong cơ thể. Plasmin được pha trong đệm potassium phosphate 20 mM; pH 7,4. Nhỏ dung dịch enzyme lên đĩa fibrin (0,75- 2,4 IU), ủ 37oC trong 5 giờ, đo đường kính và tính diện tích vòng phản ứng. Đường chuẩn plasmin chỉ tuyến tính trong dải hoạt độ từ 0,75- 2,4 IU. Do đó, chúng tôi chọn dải này để xác định hoạt tính thủy phân fibrin của 32 enzyme trong quá trình thí nghiệm. Đường chuẩn có phương trình : y= 49,215x + 24,493 (Hình 2.1). Trong đó, y là diện tích vòng phản ứng (mm2) và x là hoạt tính enzyme (IU). Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin 2.2.4. Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [56]. Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch bovine serum albumin huyết thanh bò (Hình 2. 2). Tiến hành: Ống thí nghiệm: 100 μl dịch mẫu được bổ sung 0,9 ml dung dịch bradford working. Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm sau 2 phút. Ống đối chứng: Thay dung dịch cần định lượng protein bằng nước cất. Dựng đường chuẩn: Bovine serum albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước cất với dải nồng độ từ 3-30 μg/ml. 100 μl dung dịch BSA chuẩn được bổ sung 0,9 ml dung dịch Bradford working, đảo đều và tiến hành so màu ở bước sóng 595 nm. 33 Đường chuẩn có phương trình y = 0,031x + 0,1298. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm (OD595nm) và x là hàm lượng protein (μg/ml). y = 0.031x + 0.1298 R² = 0.9839 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 O D ( 5 9 5 n m ) Nồng độ BSA (μg/ml) Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA 2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein Nguyên lý: Hoạt tính thủy phân casein được xác định dựa theo phương pháp Anson cải tiến [57]. Protein thuộc nhóm serine- protease nên có khả năng thủy phân cơ chất là casein tạo sản phẩm là các tyrosine tự do. Tiến hành: Ống thí nghiệm: 250 μl dung dịch 1% casein pha trong 50 mM đệm potassium phosphate pH 7,4 được cho vào ống nghiệm, bổ sung 125 μl dịch enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 370C trong 30 phút. Sau đó, bổ sung 625 μl dung dịch 5% TCA, đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, và ly tâm 1000 vòng/phút trong 3 phút. Thu 250 μl dịch trong, bổ sung 1 ml dung dịch 6% Na2CO3, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, thêm 250 μl dung dịch 0,2 N Folin. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và so màu ở bước sóng 750 nm. Ống đối chứng: 125 μl dịch enzyme được bổ sung 625 μl dung dịch 5% TCA, ủ nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó, bổ sung 250 μl dung dịch 1% casein 34 pha trong 50 mM đệm potassium phosphate pH 7,4. Hỗn hợp được đảo đều và ủ ở 370C trong 30 phút. Các bước sau tiến hành tương tự với ống thí nghiệm. Xây dựng đường chuẩn tyrosine: Dưới xúc tác của enzyme LK, casein bị thủy phân tạo sản phẩm là các đơn phân tyrosine. Lượng tyrosine tạo ra từ phản ứng được tính toán nhờ sử dụng L- tyrosine tinh khiết của hãng (Merck) làm chất chuẩn. Quy trình xây dựng đường chuẩn tyrosine tiến hành tương tự như quy trình ủ phản ứng enzyme với casein ở trên. Đường chuẩn có phương trình: y= 0,904x+0,017. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 750 nm (OD750nm) và x là nồng độ tyrosine (µmol). Nồng độ tyrosine (µmol) Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine 2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide Nguyên lý: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% polyacrylamide theo phương pháp điện di biến tính của Leammli và cs (1970) [58]. Theo đó, các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Tiến hành: Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên, O D 75 0 n m 35 cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.6. Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5% STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô (ml) 1 H20 khử trùng 1,94 1,18 2 Dung dịch A 1,5 3 Dung dịch B 0,5 4 Dung dịch C 2,5 0,3 5 Dung dịch D 0,06 0,02 6 APS 0,024 0,01 7 TEDMED 0,007 0,005 Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ lệ mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95oC, 10 phút. Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy. Sau khi tẩy màu kiểm tra kết quả bằng mắt thường. 2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn Tất cả các chỉ tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn được thực hiện theo phương pháp trong Dược điển Việt Nam 5 [51]. 2.2.7.1. Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm Xử lý mẫu: Cân khoảng 10 g chế phẩm, thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 để thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1 (hỗn hợp X). Tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4. Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm có độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4 vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha loãng tiến hành trên 2 đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml môi trường thạch casein đậu tương, trộn đều, để môi trường đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa. Ủ đĩa ở 30-350C trong vòng 3-5 ngày. 36 Đếm tổng số vi nấm: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm có độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4 vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha loãng tiến hành trên 2 đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml thạch Sabouraud, trộn đều, để môi trường đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa. Ủ đĩa ở 20-250C trong vòng 5-7 ngày. Tính kết quả: Sau thời gian ủ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chọn 1 nồng độ pha loãng tại đó số lượng khuẩn lạc là lớn nhất và đĩa có số lượng khuẩn lạc không quá 250 khuẩn lạc đối với vi khuẩn và không quá 50 khuẩn lạc đối với vi nấm. Số lượng vi sinh vật trong 1 g chế phẩm được tính theo công thức: NTB = (N1 + N2) /2 *d Trong đó, N1, N2: Số khuẩn lạc trong đĩa 1 và đĩa 2 d: Độ pha loãng 2.2.7.2. Xác định tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật Chuẩn bị mẫu như đã được mô tả trong mục 2.2.7.1 nhưng thay thế dung dịch đệm phosphat pH 7, 2 bằng môi trường lỏng casein đậu tương thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1 (hỗn hợp A) và ủ ở 20-250C trong 2-5 h. Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm Số lượng vi khuẩn Gram âm dung nạp mật có trong 1 g chế phẩm 0,1 g 0,01 g 0,001 g + + + Lớn hơn 103 + + - Nhỏ hơn 103 và lớn hơn 102 + - - Nhỏ hơn 102 và lớn hơn 101 - - - Nhỏ hơn 101 Lấy từng thể tích hỗn hợp A tương ứng với 0,1 g; 0,01 g; 0,001 g chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường lỏng Enterobacteria Mossel, lắc đều, ủ ở 30-350C/24-48 h. Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng Enterobacteria Mossel, tiếp tục thử nghiệm như sau: với mỗi ống môi trường Enterobacteria Mossel lỏng cấy một quai cấy lên bề mặt một đĩa môi trường muối mật Violet-Red, ủ ở ủ ở 30-350C/18-24 h. Nếu trên đĩa môi trường muối mật Violet-Red có các khuẩn lạc màu đỏ chứng tỏ kết quả dương tính. 37 2.2.7.3.Phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh Cấy 10,0 ml hỗn hợp X đã thu được trong mục 2.2.7.1 vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30-350C/24-48 h. Sau thời gian nuôi cấy nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng casein đậu tương, tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng casein đậu tương sang các môi trường đặc hiệu cho từng vi khuẩn. a. Xác định Escherichia coli Lắc đều bình môi trường lỏng casein đậu tương, lấy 1 ml hỗn dịch canh thang chủng này cấy vào bình chứa 100 ml môi trường lỏng MacConkey, ủ ở 42°C - 44°C/24 - 48 hh. Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng MacConkey sang bề mặt đĩa môi trường thạch MacConkey ủ ở 30 -35 °C trong 18 - 7