Luận văn Nghiên cứu tổng hợp và nang hóa nano sắt từ lên liposome định hướng ứng dụng làm vật liệu mang thuốc

nhóm của GS.TSKH. Nguyễn Hữu Đức – Trường Đại học Công nghệ, PGS.TS. Nguyễn Hoàng Hải – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, PGS.TS. Trần Hoàng Hải – Viện Khoa học Vật lý Thành phố Hồ Chí Minh [27]. 1.1.5. Ứng dụng của ION 1.1.5.1. Phân tách và chọn lọc tế bào, ADN Trong y sinh học, việc tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng thường được dùng để tăng nồng độ khi phân tích, làm sạch hoặc cho một mục đích khác. Thời gian gần đây, kỹ thuật phân tách bằng từ tính thường được sử dụng vì một số ưu điểm hơn so với các phương pháp phân tách truyền thống. Một ưu điểm nổi bật của phương pháp là quy trình đơn giản, tất cả các bước của quá trình phân tách có thể được thực hiện trong ống nghiệm mà không cần phải có hệ thống sắc ký lỏng đắt tiền [28]. Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn: đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu và tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường. Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính, thường dùng là hạt oxide sắt. Các hạt này được bao phủ bởi các chất có tính tương hợp sinh học như dextran, polyvinyl alcohol (PVA), hoặc có khả năng liên kết với mục tiêu cần tách như 22 dopamine, vancomycin, vừa giúp các hạt nano phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ, vừa tăng khả năng liên kết của hạt nano với mục tiêu. Ví dụ, nhóm amino của vancomycin được dùng để cố định kháng nguyên trên bề mặt hạt nano từ, giúp hệ có khả năng bắt giữ và xác định các chủng vi khuẩn Enterococci kháng vancomycin hoặc các vi khuẩn Gram dương ngay cả ở nồng độ thấp [29]. Hình 1.8. Nguyên tắc tách tế bào bằng từ trường Việc sử dụng nano từ còn là một trong những phương pháp rất nhạy để có thể tách tế bào ung thư từ máu, đặc biệt là khi nồng độ tế bào ung thư rất thấp, khó có thể tìm thấy bằng các phương pháp khác. Người ta có thể phát hiện kí sinh trùng sốt rét trong máu bằng cách đo từ tính của kí sinh trùng đánh dấu từ. Ngoài ra, trong phương pháp PCR nhằm khuyếch đại ADN nào đó, quá trình làm giàu ADN ban đầu cũng được thực hiện nhờ hạt nano từ tính. Với nguyên tắt tương tự như phân tách tế bào, hạt nano từ tính cũng được dùng để phân tách DNA. 1.1.5.1. Tăng thân nhiệt cục bộ Phương pháp đốt các tế bào ung thư bằng từ trường ngoài mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường là một trong những ứng dụng quan trọng của hạt nano từ tính. Những nghiên cứu đầu tiên về đốt nhiệt cục bộ bằng hạt nano từ xuất hiện từ năm 1957. Nguyên tắc hoạt động là phân tán các hạt nano từ tính có kích thước từ 20-100 nm trong các mô mong muốn sau đó tác dụng một từ trường xoay chiều bên ngoài đủ lớn về cường độ và tần số để làm cho các hạt nano hưởng ứng và tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh. Nhiệt 23 độ khoảng 42°C trong khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thư trong khi các tế bào thường vẫn an toàn [30]. Khó khăn chủ yếu là việc dẫn truyền lượng hạt nano phù hợp để tạo ra đủ nhiệt lượng khi có mặt từ trường ngoài mạnh trong phạm vi điều trị cho phép. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đốt nóng cục bộ là lưu lượng máu và phân bố của các mô. 1.1.5.2. Dẫn truyền thuốc Một trong những nhược điểm lớn nhất của hóa trị liệu là tính không đặc hiệu. Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh xâm nhập và tiêu diệt cả tế bào ung thư lẫn tế bào thường, gây ra nhiều tác dụng phụ. Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như một hệ mang thuốc đến vị trí khối u đã được nghiên cứu từ những năm 1970 [31]. Việc sử dụng hệ chất mang hướng đích này có hai lợi ích chính: hạn chế sự xâm nhập của các thuốc vào các mô lành nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; và giảm lượng thuốc điều trị [32]. Nguyên lý của ứng dụng này là gắn kết hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học với thuốc điều trị tạo thành một hệ chất mang. Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào vị trí của khối u. Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzyme hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ. Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nano, các thông số sinh lý học như khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trường, mức độ liên kết thuốc/hạt, và thể tích của khối u. Ngoài ra, các chất mang thường đi vào tĩnh mạch hoặc động mạch nên các thông số thủy lực như thông lượng máu, nồng độ chất lỏng từ, thời gian tuần hoàn cũng ảnh hưởng đến hiệu quả dẫn truyền thuốc [33]. Các hạt nano kích thước trên 200 nm có thời gian tồn tại trong máu thấp do bị bắt giữ bởi lá lách, sau đó bị loại bỏ bởi hệ thống thực bào. Các hạt nano kích thước dưới 10 nm thì dễ bị thanh thải bởi 24 thận. Do đó, kích thước khoảng 10-100 nm là tối ưu để ứng dụng hạt nano từ tính trong dẫn truyền thuốc [12]. Hình 1.9. Nguyên lý dẫn truyền thuốc bằng vật liệu nano từ tính Các hạt nano từ tính thường dùng là oxide sắt từ (magnetite Fe3O4, maghemite γ-Fe2O3) được bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA, dextran, silica hoặc liposome. Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các phân tử khác như nhóm chức carboxyl, biotin, avidin, carbodiimide, 1.1.5.3. Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ Ảnh cộng hưởng từ (MRI) dựa trên sự cộng hưởng từ hạt nhân của các proton trong phân tử, chủ yếu là nước tồn tại trong mô tế bào. Vì môi trường xung quanh mỗi mô tế bào thay đổi phụ thuộc vào vị trí của chúng trong cơ thể, nên có thể dùng MRI để xác định những dạng mô khác nhau. Đây là một phương pháp tiên tiến để chuẩn đoán bệnh một cách chính xác, đặc biệt là ung thư. Phương pháp này có thể giúp ta phân biệt được các khối u lành tính hay ác tính, đã di căn chưa, để có thể có biện pháp điều trị thích hợp và kịp thời. Hình 1.10. Ảnh MRI của chuột trước và sau khi tiêm ION [34]. 25 1.2. LIPOSOME 1.2.1. Khái niệm Liposome là hệ phân phối thuốc dưới dạng tiểu bào (vesicular), được đề xuất bởi Gregoriadis vào năm 1991 [35]. Thành phần chính của liposome là phospholipid có nguồn gốc tự nhiên (đậu nành, hạt hướng dương, lòng đỏ trứng,...) và cholesterol. Hình 1.11. Công thức phân tử của: A) Cholesterol và B) Phospholipid Về mặt cấu trúc, liposome có dạng hình cầu gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi vỏ phospholipid kép (thường có thành phần là phospholipid và cholesterol), có kích thước từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet. Tùy thuộc vào đặc tính ưa dầu hay nước, dược chất có thể ở trong khoang nước, nằm giữa lớp phospholipid kép hoặc hấp phụ trên bề mặt của lớp phospholipid kép. Hơn nữa, nhờ vào thể tích lõi nước bên trong lớn và khả năng tương thích sinh học của vỏ lipid bên ngoài, liposome còn có thể phân phối số lượng lớn các đại phân tử như DNA, protein và các tác nhân tăng độ tương phản hình ảnh [36]. Hình 1.12. A) Cấu tạo và B) Nguyên lý mang thuốc của liposome 26 1.2.2. Ưu điểm và nhược điểm 1.2.2.1. Ưu điểm - Liposome có thể nang hóa được các dược chất ưa nước (nằm ở khoang nước bên trong) và các dược chất ưa dầu (nằm giữa lớp phospholipid kép). Liposome đồng thời còn có tác dụng bảo vệ và phóng thích dược chất một cách có kiểm soát. - Lớp màng phospholipid kép của liposome có cấu trúc tương tự lớp màng sinh học của tế bào sống do đó liposome có độ an toàn cao đối với cơ thể. - Liposome có thể được thiết kế để tăng nồng độ dược chất ở những mô đặc biệt, hoặc tạo ra những hệ liposome nhạy với nhiệt độ, pH [37]. 1.2.2.2. Nhược điểm - Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt hóa học, vật lý và sinh học. Do là hệ không đồng pha, các tiểu phân trong hệ luôn có khả năng kết tụ dẫn đến sự không ổn định của liposome. Mặt khác, lớp vỏ của liposome là các lipid rất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH và vi sinh. - Nguyên liệu của liposome đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, đắt tiền nên giá thành sản phẩm cao. - Các phương pháp chế tạo liposome đều sự dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid nên ảnh hưởng bất lợi đến môi trường, và có thể gây hại cho sức khỏe người sử dụng nếu không được loại bỏ hoàn toàn. - Đa số các phương pháp chế tạo liposome đều chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô công nghiệp. - Tỉ lệ nang hóa dược chất của liposome chưa cao, khó mang được các dược chất có khối lượng phân tử lớn [37]. 1.2.3. Phân loại 27 Tùy theo phương pháp bào chế, thành phần lipid, điện tích bề mặt mà sản phẩm liposome có các đặc tính khác nhau về kích thước, cấu trúc và khả năng nang hóa. Liposome thường được phân loại dựa vào cấu trúc của lớp màng phospholipid kép và phương pháp bào chế. 1.2.3.1. Phân loại theo cấu trúc Liposome phân loại theo cấu trúc được thể hiện trong Bảng 1.1 Bảng 1.1. Phân loại liposome theo kích thước và số lớp màng phospholipid kép Dạng liposome Viết tắt Kích thước Số màng lipid kép Đơn lớp loại nhỏ SUV 20-100 nm 1 Đơn lớp loại lớn LUV 100-1000 nm 1 Đơn lớp khổng lồ GUV 1-200 μm 1 Đa lớp OLV 0.1-1 μm 2-5 Đa lớp MLV > 0,5 µm 5-25 Liposome chứa liposome MVV > 1 µm Cấu trúc đa ngăn Hình 1.13. Phân loại liposome theo cấu trúc màng lipid kép 28 1.2.3.2. Phân loại theo phương pháp điều chế - REV (Reverse – phase evaporation vesicles): liposome được điều chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. - VET (Vesicles by extrusion techniques): liposome được điều chế bằng kỹ thuật ép đùn. - DRV (Dehydration – Rehydration vesicles): liposome được điều chế bằng phương pháp dehydrate hóa – hydrate hóa trở lại. - FTV (Freeze – thaw vesicles): liposome được điều chế bằng phương pháp đông lạnh-xả đông [38]. 1.2.3.3. Phân loại theo thế hệ a) Conventional liposome Thế hệ liposome đầu tiên là Conventional Liposome (C Liposome). Thành phần chỉ gồm phospholipid và (hoặc) cholesterol, thích hợp để mang các dạng thuốc tác dụng trên hệ thống đại thực bào như các thuốc kháng vi sinh vật, thuốc điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị ung thư và ngăn chặn khối u phát triển. C Liposome được xem là các hạt “ngoại lai” và bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System, MPS). Phần lớn MPS là các tế bào Kuffer ở gan và đại thực bào của lá lách. Do không bền vững trong dịch sinh học nên C Liposome phóng thích nhanh các phân tử đã được kết nang ở bên trong nhờ sự tương tác qua lại với hai nhóm protein plasma là HDL và opsonin đã hấp thụ lên bề mặt liposome. HDL và opsonin đóng vai trò là các chất trung gian cho sự nhập bào của liposome bởi MPS. Vì vậy tốc độ thanh thải của liposome từ sự tuần hoàn máu phụ thuộc vào khả năng bám vào bề mặt liposome của opsonin. Mặt khác sự thanh thải của liposome từ dòng máu phụ thuộc vào các đặc tính của liposome như trạng thái lỏng của lớp màng kép, bề mặt và kích thước của túi. Khuynh hướng rõ rệt của C Liposome là bị bắt giữ bởi các tế bào đích của MPS. Ðiều này là rất thuận lợi cho việc phân phối thuốc đến các đại thực bào nhưng lại cản trở sự sử dụng liposome trong cơ thể để dẫn thuốc một cách chọn lọc đến các vị trí khác. C Liposome bị bắt giữ bởi các tế 29 bào MPS đã hạn chế sự phát triển của liposome trong việc làm phương tiện dẫn thuốc trong nhiều năm qua. Sau nhiều công trình nghiên cứu khác nhau, các liposome với độ bền cao đã được tạo ra. Liposome cấu tạo từ lipid kết hợp với polyethylene glycol (PEG) với các đặc tính tránh được sự hấp thụ của MPS và tăng thời gian lưu thông trong tuần hoàn máu, liposome có thể chịu được các sửa đổi một cách đặc biệt của màng kép hoặc có thể được bao phủ với các phân tử khác nhau. Các loại liposome này bao gồm proteo liposome, mang protein kích thích dung hợp; liposome nhạy với pH, có khả năng tránh được sự phân hủy của lysosome; liposome cation tạo ra các phức hợp với DNA; liposome nhạy cảm với tế bào đích, không hợp nhất sau khi bám vào tế bào đích và giải phóng vật chất chứa bên trong vào vùng lân cận tế bào này; liposome miễn dịch điều khiển các vị trí đặc hiệu bởi các kháng thể ghép đôi tới các bề mặt của chúng [38]. b) Long-circualating liposome Như đã đề cập ở trên, C Liposome bị bắt giữ nhanh chóng bởi MPS đã hạn chế khả năng sử dụng đối với các loại tế bào khác. Các liposome nhỏ, cứng, giàu cholesterol làm tăng tính bền vững trong plasma, tránh được sự hấp thụ của MPS. Các phương pháp khác nhằm làm tăng thời gian lưu thông của liposome trong máu là kết hợp vào liposome các polyvinyl pyrolidone polyacrylamide lipid, glucoronic acid lipid hoặc phospholipid distearoyl phosphatidylcholine. Bao bọc liposome với protein, polysaccharide và glycolipid của hồng cầu cũng làm tăng thời gian lưu thông trong máu của chúng. Một cấu trúc khác đã cho thấy thời gian lưu thông trong dòng máu dài hơn là liposome mang phospholipid kết hợp với một polymer ưa nước tổng hợp (PEG). Các liposome này có cấu trúc không gian bền vững và có khả năng giảm thiểu sự hấp thụ của MPS tốt nhất. Polymer PEG cản trở sự tương tác qua lại của protein huyết thanh với bề mặt của liposome do tác dụng kỵ nước và tính linh động của chúng và kết quả là làm giảm sự hấp thụ liposome của các tế bào MPS [38]. 30 c) Targeted liposome Phương pháp có nhiều triển vọng nhất đối với sự chọn lọc tế bào đích của liposome với các vị trí đặc hiệu là gắn vào bề mặt của liposome các phối tử (ví dụ như các kháng thể, đường dư lượng, protein hoặc hormone) có thể nhận ra các phân tử đặc hiệu. Các kháng thể hoặc các phối tử khác nhau như folate, transferrin, anionized albumin, dextran bám vào các thụ quan làm tăng khả năng điều hòa trên bề mặt của tế bào đích. Chúng có thể được gắn lên bề mặt của liposome bằng cách sử dụng các gai dạng neo hoặc đầu mút PEG, xen vào lớp màng kép của liposome nhờ một chất dẫn xuất của phospholipid. Liposome miễn dịch mang trên bề mặt các kháng thể cặp đôi đồng hóa trị, đảm bảo sự phân phối thuốc đến các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu. Một số kết quả khả quan đã đạt được trên mô hình động vật trong ống nghiệm và trong cơ thể. Mặc dù đã sử dụng kháng thể người để điều trị ung thư nhưng chúng vẫn chưa được phổ biến rộng rãi trong lâm sàng. Nhiều phân tử đã được phát hiện trên bề mặt tế bào trong các điều kiện bệnh lý, vì vậy liposome miễn dịch được xem là một công cụ chẩn đoán và chữa bệnh đầy hứa hẹn trong tương lai. Tuy nhiên tính bám đặc hiệu của liposome với tế bào đích không phải lúc nào cũng dẫn đến sự phân phối thuốc có hiệu quả. Các kháng nguyên đích mà tế bào tiếp thu có thể làm trung gian phân phối thuốc nội bào hiệu quả. Vì vậy chiến lược tạo ra liposome miễn dịch được tối ưu hóa để sự phân phối thuốc và sự tiếp thu nội bào xảy ra [38]. d) Sensitive liposome - Liposome nhạy nhiệt: liposome nhạy với nhiệt đã được tổng hợp từ phospholipid với nhiệt độ chuyển pha khoảng 40ºC. Liposome này đã được sử dụng thành công trong các mô hình in vitro và in vivo nhưng chưa được đưa vào lâm sàng mặc dù sự tăng nhiệt cục bộ đã được sử dụng để điều trị kháng ung thư và nhiệt độ trên 40ºC là dễ dàng có được ở các mô khác nhau. 31 - Liposome nhạy với pH: để tránh sự phân hủy của lysosome, liposome nhạy pH, không ổn định và kích thích dung hợp ở pH 6 ra đời. Liposome này bao gồm một hỗn hợp phosphatidyl ethanolamine (PE) với acidic phospholipid. Ở pH 6,5; sau khi proton hóa lớp màng kép, PE chuyển pha màng kép thành pha hexagon, không bền, trở nên kích thích dung hợp và giải phóng các chất chứa trong liposome vào cytosol. Liposome nhạy pH đã được sử dụng một cách thành công trong việc làm vector chuyển nucleic acid. - Liposome nhạy với tế bào đích: liposome nhạy với tế bào đích đã được tổng hợp thành công nhờ sự bền vững của PE trong lớp màng kép với các kháng thể có nguồn gốc từ aicd béo (thường là palmitic acid). Sau khi bám vào bề mặt các tế bào đích, sự tập trung của các phân tử globulin miễn dịch ở các điểm tiếp xúc làm cho lớp màng kép của liposome không ổn định. Tại vị trí này, các chất chứa trong liposome được giải phóng vào các vùng lân cận của tế bào đích. Kỹ thuật này đã được sử dụng để phân phối các tác nhân kháng virus [38]. 1.2.4. Phương pháp tổng hợp Ngày nay, có nhiều phương pháp có thể được áp dụng để chế tạo hệ giá mang liposome, trong đó có 5 phương pháp được sử dụng phổ biến nhất, bao gồm: phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid; phương pháp tiêm ether, tiêm ethanol; phương pháp bay hơi pha đảo và phương pháp thẩm tách bằng chất hoạt động bề mặt. 1.2.4.1. Phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid Phương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid được Bangham đưa ra và phát triển từ năm 1965 và cho đến nay vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để bào chế liposome nhờ vào tính tiện ích, dễ thực hiện, không yêu cầu thiết bị công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và hiệu quả mang thuốc cao so với các phương pháp khác. Cách tiến hành: 32 - Lipid được hoà tan trong hệ dung môi và tiến hành cô quay hệ dung dịch để làm bay hơi dung môi, tăng dần nồng độ lipid trong hệ. Các phân tử lipid theo cơ chế tự hợp tạo thành các lớp màng lipid mỏng. Sau khi làm bay hơi hết dung môi, tiến hành hydrate hoá lớp màng mỏng lipid này bằng dung dịch đệm hoặc dung dịch mang thuốc. Quá trình này được tiến hành bằng cách khuấy trộn để tạo được các liposome có kích thước lớn và các liposome đa lớp. Để làm nhỏ các hạt này và tạo liposome đơn lớp, các phương pháp như: sóng siêu âm, qua màng đùn, đồng hoá được áp dụng. - Tuỳ vào bản chất của thuốc mà thuốc được đưa vào liposome ở các giai đoạn khác nhau. Thuốc thuộc hệ ưa dầu sẽ được phân tán cùng với lipid trong dung môi ở giai đoạn đầu, hiệu suất mang thuốc khá cao và có thể đạt gần 100%. Ngược lại, nếu thuộc hệ ưa nước, thuốc sẽ được hoà tan với dung dịch đệm dùng để hydrat lớp màng lipid. Trong trường hợp này, hiệu suất thu được sẽ không cao (thấp hơn 30%) [37, 39]. Hình 1.14. Sơ đồ phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid 1.2.4.2. Phương pháp tiêm ether Kỹ thuật này lần đầu tiên được nghiên cứu bởi Bangham và cộng sự năm 1976. 33 Cách tiến hành: - Dung dịch lipid sẽ được hòa tan trong diethylether hoặc hỗn hợp ether/methanol. - Tiêm dung dịch trên vào pha nước chứa hoạt chất ở nhiệt độ 55 – 65oC hoặc dưới áp suất giảm. Trong quá trình tiêm và phân tán vào trong pha nước, ether sẽ bốc hơi và hình thành các liposome. Đối với phương pháp này, nhiệt độ của pha nước, nồng độ lipid trong ether và tốc độ tiêm là các yếu tố quan trọng cần được kiểm soát trong quá trình điều chế. Nhược điểm chính của phương pháp là liposome thu được không đồng nhất và một số thành phần của công thức có thể phân hủy dưới nhiệt độ cao [40]. 1.2.4.3. Phương pháp tiêm ethanol Cách tiến hành: - Lipid được hòa tan trong ethanol (nồng độ lipid khoảng 50 µmol/ml, đôi khi có thể đạt đến 100 µmol/ml). - Tiêm nhanh dung dịch lipid vào một lượng lớn pha nước hoặc hệ đệm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của phospholipid. Nồng độ ethanol sau khi tiêm trong dung dịch không vượt quá 7,5%. Quá trình tiêm có thể được tiến hành dưới áp suất giảm. Kích thước của các tiểu phân tạo thành phụ thuộc vào nồng độ lipid hòa tan trong ethanol, thông thường nồng độ phospholipid nằm trong khoảng 4 – 40 mM, kích thước của các liposome được tạo ra từ 30 – 120 nm. Phương pháp có ưu điểm là không sử dụng nhiệt độ nên các thành phần lipid ổn định, không bị phân hủy. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là dung dịch liposome thu được có nồng độ thấp, khó khăn khi loại bỏ hoàn toàn ethanol và nhiều hợp chất sinh học bị bất hoạt trong dung dịch có ethanol. Phương pháp tiêm ether và ethanol chủ yếu thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm [39, 40]. 34 1.2.4.4. Phương pháp bay hơi pha đảo Trong phương pháp này, lipid đóng vai trò như chất hoạt động bề mặt để phân tán pha nước chứa thuốc vào dung môi không phân cực. Sau quá trình khuấy trộn, người ta tạo được hệ micell các hạt lipid bao gói dung dịch thuốc bên trong. Tiến hành cô quay dung dịch này để bay hơi hết dung môi hữu cơ, các micell sẽ tụ hợp với nhau tạo thành các lớp gel. Tiến hành hydrate hoá gel này ta thu được hệ iposome mang thuốc. Ưu điểm của phương pháp là hiệu quả nang hóa hoạt chất cao (đạt đến 80%), có thể nang hóa các hoạt chất phân tử nhỏ, lớn và đại phân tử. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp trải qua giai đoạn siêu âm ngắn có thể dẫn đến chia cắt hoặc làm bất hoạt một số phân tử lớn (DNA, protein), khó áp dụng khi chế tạo lượng lớn và phải dùng dung môi. Để cải thiện các nhược điểm trên đòi hỏi tỷ trọng của dung môi hữu cơ gần với tỷ trọng pha nước hoặc có thể dùng CO2 siêu tới hạn để thay cho dung môi hữu cơ (phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn – SCRPE). Với cải tiến này có thể bào chế liposome với các dược chất kém bền như peptide [39, 40]. 1.2.4.5. Phương pháp thẩm tách bằng CHĐBM Cách tiến hành: - Dùng CHĐBM có nồng độ micelle tới hạn để hòa tan lipid. - Loại bỏ CHĐBM để làm giàu phospholipid trong micelle làm cho phospholipid kết hợp thành liposome lớn một lớp. CHĐBM có thể được loại bỏ bởi phương pháp thẩm tách. Thuận lợi của phương pháp thẩm tách CHĐBM là tạo ra liposome có kích thước đồng nhất và đảm bảo được tính lặp lại giữa các lô mẻ thí nghiệm. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp là khó loại bỏ ra hết CHĐBM khỏi liposome. CHĐBM có thể loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách, sắc ký gel Sephadex hoặc trao đổi ion. 35 1.3. LIPOSOME NANG HÓA NANO OXIDE SẮT TỪ Như đã biết, nano oxide sắt từ (ION) là một loại vật liệu có năng lượng bề mặt lớn, bên cạnh đó do cấu trúc đơn domain, các hạt ION có moment từ rất lớn xung quanh chúng. Điều này dẫn đến ION rất dễ bị kết tụ với nhau gây nhiều hạn chế cho việc ứng dụng ION, nhất là trong lĩnh vực y sinh. Nhằm ngăn sự kết tụ đồng thời bảo vệ ION khỏi sự oxi hóa, ION được biến tính bề mặt bằng nhiều tác nhân khác nhau. Trong đó có các tác nhân polymer như chitosan, poly(ethylene glycol), dextran, poly(vinyl alcohol), poly(vinyl pyrrolidone) và alginate [41-45]; các tác nhân vô cơ như silica [46]; hoặc tác nhân hữu cơ như citric acid, oleic acid [47]. Trong thời gian gần đây, việc sử dụng liposome như một phương pháp mới nhằm bảo vệ hạt ION đã thu hút nhiều sự chú ý từ các nhà khoa học. Mặc dù hạt ION trần dễ kết tụ rất khó được nang hóa vào liposome, ION có thể được bảo vệ bằng các tác nhân kể trên, sau đó nang hóa vào liposome nhằm tạo lớp bảo vệ kép. Liposome đã được biết đến là một hệ chất mang có độ tương hợp sinh học cao và khả năng nang hóa rất tốt, do đó, việc nang hóa ION vào liposome không những có thể giúp tăng hiệu quả bảo vệ ION khỏi sự kết tụ và oxi hóa, giúp tăng tính tương hợp sinh học của ION, mà còn khiến liposome có được những đặc tính quý của ION, điển hình là tính siêu thuận từ. Tính chất này có thể giúp liposome được hướng đích chủ động bằng cách áp từ trường ngoài. Ngoài ra, liposome với lớp lipid kép ưa dầu và lõi ưa nước, có thể nang hóa cùng lúc ION và các loại thuốc khác, tạo thành hệ chất mang đa chức năng có tiềm năng ứng dụng rất cao. Một số nghiên cứu điển hình trên thế giới về liposome nang hóa ION: Năm 2007, Akira Ito và cộng sự đã tổng hợp hệ liposome mang đồng thời ION (kích thước 10 nm) ở lõi và 4-S-cysteaminylphenol (4-S-CAP) ở lớp lipid kép. Tỉ lệ nang hóa ban đầu là 40 mg ION trong 15 mg lipid. Hệ chất mang được tổng hợp theo phương pháp hydrate hóa màng lipid mỏng, hydrate hóa bằng đánh xoáy và siêu âm mang lipid với dung dịch ION trong nước. Hệ chất mang có kích thước 124.5 nm khi không nang hóa 4-S-CAP, khi tăng lượng 4- 36 S-CAP đến 100 uM, kích thước hạt tăng, và xuất hiện kết tủa khi lượng 4-S- CAP vượt quá 100 uM [48]. Năm 2011, Katagiri và cộng sự đã tổng hợp hệ liposome biến tính copolymer nhạy nhiệt mang ION phủ oleic acid (OCION) từ phosphatidylcholine lòng trắng trứng (EYPC). Hệ chất mang được tổng hợp theo phương pháp hydrate hóa màng mỏng, hydrate hóa bằng siêu âm và ép đùn qua màng polycarbonate. Với các tỉ lệ OCION nang hóa là 0, 10 và 30% (w/w) so với khối lượng lipid, kích thước hạt của hệ trong dung môi lần lượt là 82, 141 và 131 nm [49]. Năm 2012, Frascione và cộng sự đã tổng hợp liposome nang hóa ION phủ dextran (kích thước động học 20 nm). Kích thước hệ chất mang khoảng 160- 170 nm. Với các nồng độ sắt ban đầu từ 0.5, 1.0, 2.0 và 3.0 mg/ml, hiệu suất nang hóa đạt lần lượt là 92, 75, 83 và 74%. Sau một tuần bảo quản, hiệu suất nang hóa được đo lại là 42, 72, 63 và 65%, chứng tỏ có sự phóng thích ION theo thời gian [50]. Năm 2018, Skouras và cộng sự đã