Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột và ứng dụng trong xử lý nước thải sản xuất nui

ột ở Việt Nam chủ yếu dùng cho chế biến các mặt hàng lương thực thực phẩm dùng hàng ngày như: sản xuất bún, bánh phở, miến dong, mì, hủ tíu … cũng ñóng một vai trò không nhỏ trong thị phần chung của - 16 - việc sản xuất tinh bột. Tuy nhiên, các cơ sở sản xuất này còn mang tính tự phát, tùy tiện, quy mô sản xuất không lớn chỉ tập trung ở các làng nghề, trang thiết bị còn lạc hậu.…ðối với loại hình sản xuất các sản phẩm từ khoai mì như tinh bột mì, khoai mì cho sản xuất ethanol, thức ăn gia súc dạng khoai mì lát,…chiếm tỷ lệ cao trong cơ cấu ngành chế biến lương thực và hầu hết lại ñược sản xuất bởi các nhà máy lớn, trang thiết bị hiện ñại…vì khoai mì ñược xem là mặt hàng ñắt giá và là ngành kinh tế nông nghiệp xuất khẩu quan trọng. Như vậy có thể thấy chế biến tinh bột ñóng vai trò rất lớn không những ñối với ngành lương thực – thực phẩm Việt Nam mà còn ñóng vai trò quan trọng trong việc phát triển nền kinh tế, nâng cao kim ngạch xuất khẩu cho ñất nước. 2.3.2 Tác ñộng của nước thải sản xuất tinh bột ñến môi trường Thời gian gần ñây số lượng các nhà máy chế biến tinh bột bị ñình chỉ hoạt ñộng như nhà máy chế biến tinh bột sắn VEDAN Hà Tĩnh, nhà máy tinh bột sắn Thanh Chương Nghệ An; các nhà máy bị lên án về tình trạng ô nhiễm môi trường do xả nước thải chưa qua xử lý hay xả nước thải chưa ñạt tiêu chuẩn ra môi trường như: nhà máy tinh bột sắn Intimex tỉnh Nghệ An; nhà máy tinh bột sắn Pococev tỉnh Thừa Thiên Huế, cơ sở chế biến tinh bột mì Ngọc Thạch tỉnh Bình Thuận; nhà máy sản xuất tinh bột sắn Tịnh Phong, nhà máy chế biến tinh bột sắn ðắk … Mặt khác, hiện nay các cơ sở chế biến tinh bột tập trung thành làng nghề với trang thiết bị còn lạc hậu và quy mô sản xuất nhỏ nên hầu như không có hệ thống xử lý nước thải riêng và ñúng kỹ thuật. Còn các nhà máy sản xuất với quy mô lớn tuy ñã trang bị hệ thống xử lý nước thải nhưng mới chỉ có rất ít hệ thống hoàn chỉnh có khả năng xử lý triệt ñể nước thải trước khi xả ra môi trường. Gần ñây nhất là hậu quả tác ñộng lên sông Thị Vải của Nhà máy Vedan – ðồng Nai. Theo kết quả mô phỏng của Viện Tài nguyên Môi trường, khu vực ô nhiễm khiến hoạt ñộng nuôi trồng, ñánh bắt thủy sản bị ảnh hưởng nặng có diện tích gần 2.000ha thuộc ñịa bàn các xã Phước An, Long Thọ (huyện Nhơn Trạch), Long Phước, Phước Thái (huyện Long Thành) của tỉnh ðồng Nai cùng các xã Mỹ Xuân, Phước Hòa và thị trấn Phú Mỹ của huyện Tân Thành, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Vùng ô nhiễm gây ảnh hưởng nhẹ ñến nuôi trồng, ñánh bắt thủy sản có diện tích gần 700ha - 17 - thuộc các xã Phước An, Vĩnh Thanh (huyện Nhơn Trạch, ðồng Nai), Phước Hòa (huyện Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu) và xã Thạnh An, huyện Cần Giờ, TP.HCM. Trong ñó, diện tích bị ảnh hưởng của xã Thạnh An ước tính chỉ gần 84ha. Trên sông Vàm Cỏ - Tây Ninh, chỉ tính riêng khu vực xã Phước Vinh, tháng 5/2009 ñã có hơn 150.000 con cá lăng nha 10 tháng tuổi và 1 tháng tuổi nuôi trong bè chết, gây thiệt hại nhiều tỷ ñồng. ðầu tháng 4/2010 vừa qua, khoảng 80.000 con cá nuôi của 16 hộ tại ấp Phước Lập, Phước Trung lại tiếp tục chết. Tại Báo cáo kết quả kiểm tra mẫu nước mặt trên sông Vàm Cỏ Ðông ñoạn Ðồi Thơ - khu vực ranh giới giữa huyện Châu Thành và huyện Tân Biên (nơi có hai nhà máy chế biến khoai, mì thường xuyên xả nước thải ra sông vào ban ñêm) cho thấy hàm lượng COD vượt gấp 2,2 lần, hàm lượng BOD5 vượt 3,5 lần so với QCVN 08:2008/BTNMT quy ñịnh cho cấp nước sinh hoạt. Nguyên nhân chết cá nuôi ở những khu vực này ñược xác ñịnh do nước thải từ hơn 80 nhà máy sản xuất mì trong khu vực. 2.3.3 ðặc ñiểm nguồn nước thải nhà máy sản xuất tinh bột Nước thải sản xuất tinh bột mì gồm hai loại chính: - Nước rửa củ: nước thải từ công ñoạn rửa, loại bỏ phần rễ, lớp vỏ gỗ và ñất cát bám trước khi ñưa vào nghiền. Theo ước tình, lượng nước thải rửa củ chiếm 42% tổng lượng nước thải của nhà máy. Nước này chỉ ô nhiễm bởi cát ñất tách ra từ củ, ít ô nhiễm chất hữu cơ hòa tan. Do ñó, ñối với nước rửa củ nên tách riêng nhằm giảm lượng nước thải và có thể tái sử dụng sau khi xử lý ñơn giản. - Nước thải chế biến: nước thải từ các công ñoạn nghiền, tách bã, lọc … trong quá trình sản xuất. Nước thải chế biến có chứa hàm lượng cặn lơ lửng và chất hữu cơ rất cao. Thành phần nước thải chế biền gồm tinh bột, ñường, protein, cellulose, các khoáng chất và ñộc tố CN- Khi ñề cập ñến ñặc ñiểm của nước thải nhà máy chế biến tinh bột thì cần xem xét ở cả hai quy mô sản xuất là quy mô nhỏ với các sản phẩm như bún, phở, nui…và quy mô lớn hơn với sản phẩm là tinh bột khoai mì. Quy mô sản xuất nhỏ - 18 - Hình 2.3 Quy trình sản xuất nui và công ñoạn phát sinh nước thải - 19 - Hình 2.4 Quy trính sản xuất tinh bột mì và các công ñoạn phát sinh nước thải (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11. 2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) - 20 - Từ các quy trình sản xuất mì, nui và tinh bột khoai mì trên nhận thấy nguồn phát sinh của nước thải tinh bột chủ yếu từ các công ñoạn trích ly, tách nước và tách bã, nước rửa dụng cụ thiết bị. Với hàm lượng chất hữu cơ cao, COD dao ñộng từ 13.300 – 19.500 mg/l, N và P tổng dao ñộng 86 – 115, pH 3.8 – 5.2, về mặt cảm quan, nước thải sản xuất tinh bột có màu trắng ngà, ñục, bốc mùi chua nồng. Hàm lượng cặn lơ lửng của tương ñối cao vì xác mì mịn và khó lắng nên bị cuốn theo nước xả từ bể ngâm, SS có thể lên ñến vài ngàn mg/l tùy thuộc vào công nghệ sản xuất. ðộc tố CN- trong nước thải dao ñộng từ 2 – 75 mg/l, ñây là yếu tố cản trở hoạt ñộng của vi sinh vật trong quá trình xử lý. Mức ñộ ô nhiễm của một số loại nước thải tinh bột ñiển hình ñược trình bày trong các bảng 2.5, 2.6, 2.7. Bảng 2.5 Thành phần nước thải nhà máy chế biến tinh bột mì (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11–2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) Các chỉ tiêu ðơn vị tính Giá trị pH COD BOD5 SS N – NH3 N- NO2 N – NO3 P tổng CN- SO4 2- - mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 4.2 – 5.1 2.500 – 17.000 2.120 – 14.750 120 – 3.000 136 – 300 0 – 0.2 0.5 – 0.8 250 – 450 2 – 75 52 - 65 - 21 - Bảng 2.6 Thành phần nước thải cơ sở tinh chế tinh bột mì làng nghề Mỹ ðức (Nguồn: ðề tài nghiên cứu khoa học (QMT06.03), ðại học Quốc gia Hà Nội) Thông số Hàm lượng COD 4768 mg/l BOD5 3190 mg/l BOD5/COD 0.76 NH4 + 37.69 mg/l NO2 - 0.61 mg/l pH 3.54 Bảng 2.7 Thành phần nước thải cơ sở sản xuất bún (Nguồn: ðề tài nghiên cứu khoa học (QMT06.03), ðại học Quốc gia Hà Nội) Thông số Hàm lượng COD 3076.3 mg/l BOD5 2154.2 mg/l BOD5/COD 0.7 NH4 + 29.89 mg/l NO2 - 0.56 mg/l pH 4.91 2.3.4 Hệ thống xử lý nước thải yêu cầu cho nhà máy sản xuất tinh bột Với ñặc trưng hàm lượng COD và BOD của loại nước thải này rất cao, tỷ lệ BOD/COD khoảng từ 0.5 – 0.7 và thành phần gồm các chất hữu cơ dễ phân hủy nên thích hợp cho quá trình xử lý bằng phương pháp sinh học, kết hợp giữa xử lý kỵ khí và hiếu khí. Tuy nhiên, nước thải sản xuất tinh bột có chứa hàm lượng ñộc ñố CN-, là yếu tố gây ức chết hoạt ñộng của vi sinh vật. Do ñó, trong quá trình xử lý, trước hết phải loại bỏ ñộc tố này. Phương pháp hiệu quả nhất là lên men acid dưới tác dụng của vi sinh vật trong bùn tự hoại.  Một số hệ thống xử lý nước thải tinh bột thường ñược áp dụng - 22 - Hình 2.5 Quy trình xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11. 2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) Hình 2.6 Quy trình xử lý nước thải cục bộ cho một cơ sở sản xuất quy mô gia ñình (A) và cụm các cơ sở sản xuất tập trung (B) (Nguồn: Công trình xử lý nước thải làng nghề lương thực Hoài Hảo, Công ty Môi Trường Ngọc Lân) (A) (B) - 23 - Từ các hệ thống xử lý nước thải tinh bột trên nhận thấy các hệ thống xử lý ñều áp dụng phương pháp sinh học. Bản chất của phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là sử dụng khả năng sống và hoạt ñộng của vi sinh vật ñể khoáng hóa các chất bẩn hữu cơ trong nước thải thành các chất vô cơ, các chất khí ñơn giản và nước. Vai trò của giai ñoạn xử lý sinh học ñối với nước thải tinh bột Công nghệ xử lý nước thải nói chung và nước thải tinh bột nói riêng ngày càng ñi sâu vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp sinh học cũng ñã chứng minh hiệu quả xử lý triệt ñể hơn hẳn những biện pháp xử lý hóa lý khác, ñể xử lý các chất hữu cơ hòa tan và keo dễ phân hủy. Chi phí xử lí bằng phương pháp sinh học, so với các phương pháp hóa học và hóa lý là thấp hơn một cách ñáng kể. Kết quả của quá trình xử lý là các chất thải ñược chuyển hóa hoàn toàn thành dòng thải ñáp ứng tiêu chuẩn ñè ra với các mục ñích sử dụng khác nhau. 2.4 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT PHÂN HỦY TINH BỘT 2.4.1 Tổng quan về tinh bột Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu trong thực vật, ñặc biệt là trong những cây có củ. Trong tế bào thực vật, tinh bột tồn tại ở dạng các hạt tinh bột. Các loài thực vật khác nhau thì các hạt tinh bột có kích thước và hình dạng khác nhau, ñồng thời tính chất vật lý và hóa học cũng khác nhau. Tinh bột là một polysaccaride chứa hỗn hợp amylose và amylopectin. Trong tinh bột tỷ lệ amylose thường chiếm 25% còn amylopectin chiếm 75%. Tỷ lệ này thay ñổi tùy theo từng loại thực vật. Cả amylose và amylopectin ñều ñược cấu tạo tử ñơn phân là D-glucose. Amylose tan ñược trong nước nóng, còn amylopectin không tan ñược trong nước nóng mà tạo thành các thể keo. Amylose có trọng lượng phân tử 50.000 - 160.000 Dallton, ñược cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose, liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylose chứa 0.03% photpho và bắt màu xanh với Iot, khi bị ñun nóng màu xanh này nhanh chóng biến mất. - 24 - Hình 2.7 Cấu trúc phân tử amylose (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 ñến hàng chục triệu Dallton, ñược cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, liên kết với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside tạo thành mạch thẳng phân nhánh, mỗi nhánh có khoảng 8 – 30 gốc α-D glucopyroranose. Amylopectin chứa 0.1 – 0.8% photpho và bắt màu tím hay màu ñỏ tím với Iot. Hình 2.8 Cấu trúc phân tử amylopectin (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) 2.4.2 Quá trình phân hủy tinh bột Tinh bột bị phân hủy bời enzyme amylase. Sản phẩm của quá trình phân hủy tinh bột gồm ñường glucose, ñường maltose, dextrin …. Một phần các ñường này sẽ tan trong nước, một phần ñi vào tế bào vi sinh vật và tham gia các quá trình chuyển hóa khác trong tế bào. - 25 - Hình 2.9 Quá trình chuyển hóa tinh bột của vi sinh vật (Nguồn: Nguyễn ðức Lượng (2003), Công nghệ xử lý nước thải) Glucose ñi vào trong tế bào vi sinh vật, chúng sẽ ñi theo hai hướng chuyển hóa cơ bản. Hướng thứ nhất, vi sinh vật dùng glucose như nguồn vật liệu xây dựng tế bào. Từ glucose tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các polysaccharide của tế bào (protein, lipid trung tính, acid nucleic, photpholipid). Hướng thứ hai, ngoài sự tham gia vào quá trình tổng hợp vật chất của tế bào thì vi sinh vật còn thực hiện các quá trình hô hấp hiếu khí giải phóng toàn bộ năng lượng có trong glucose. Trong hô hấp yếm khí, năng lượng không ñược giải phóng hết mà chúng ñược giữ lại trong các sản phẩm trung gian. 2.4.3 Hệ enzyme tham gia quá trình phân hủy tinh bột Nhóm enzyme có tên gọi chung là glycoside hay carbohydase xúc tác cắt liên kết glucoside nối các ñơn vị ñường ñơn trong thành phần tinh bột, giải phóng glucose và các loại ñường khác. Trong ñó glucose là nguyên liệu ñầu vào ñể sản xuất ra - 26 - nhiều sản phẩm công nghiệp quan trọng. Các vi sinh vật tham gia quá trình thủy phân tinh bột thường có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase ngoại bào, các enzyme này ñược chia ra làm 4 nhóm: - Enzyme α-amylase (α-1,4 glucan-4-glucanohydrolase) : có khả năng tác ñộng vào bất kỳ liên kết 1,4-glucoside nào trong phân tử tinh bột, do ñó α-amylase còn ñược gọi là endoamylase. Dưới tác ñộng của α-amylase, phân tử tinh bột ñược cắt thành nhiều ñoạn ngắn gọi là sự dịch hóa tinh bột, tạo ra dextrin có phân tử lượng thấp và một lượng nhỏ maltose. Hình 2.10 Các giai ñoạn quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) - Enzyme β-amylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase) : có khả năng cắt ñứt liên kết 1,4 glucoside ở cuối phân tử tinh bột, bởi thế còn gọi là exoamylase, tạo ra sản phẩm là maltose và β-limit dextrin. (chiếm khoảng 40 – 45%) - R-enzyme (α-1,6-glycosiadse) có khả năng cắt ñứt mối liên kết 1,6 glucoside tại những chỗ phân nhánh của amylopectin. - Amyloseglycosidase phân giải tinh bột thành glucose và các oligosaccharide, enzyme này có khả năng phân cắt cả hai loại liên kết 1,4 glucosice và 1,6 glucoside. - 27 - Hình 2.11 Cơ chế thủy phân tinh bột (Nguồn: Nguyễn Tiến Thắng (2008), Giáo trình công nghệ enzyme). Ngoài amylase, trong thực tế còn có sự hiện diện của các enzyme khác thủy phân tinh bột và ñường oligo như dextranase, glycosidase, β-glucosidase, lactase. Tuy nhiên hệ enzyem amylase thường ñược quan tâm và sử dụng phổ biến hơn. 2.4.4 Vi sinh vật phân hủy tinh bột Các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột khi chúng có hệ enzyme amylase. Một số vi sinh vật có hệ enzyme amylase ñược trình bày ở bảng 2.13 Bao gồm nhiều loại nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn, trong ñó chiếm vai trò quan trọng là vi khuẩn - 28 - Bảng 2.8 Các vi sinh vật có hệ enzyme amylase (Nguồn: Nguyễn ðức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2-Vi sinh vật học công nghiệp) STT Vi sinh vật Hệ enzyme 1 2 3 4 5 6 7 Asp. Awamori Asp.niger Asp.usami Asp.oryzae Bacillus.spp Endomyces.spp Phizopus delemar α-amylase β-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase α-amylase β-amylase glucoamylase α-amylase β -amylase glucoamylase glucoamylase Bảng 2.9 Một số chủng vi khuẩn trong nước thải có hệ enzyme α- amylase : vi sinh vật khối lượng phân tử của enzyme pH tối ưu nhiệt ñô tối ưu B.amilotiquefaciens 49000 5.9 65 B.licheniformics 22500 5.0-9.0 76 B.stearothermophilus 49000 5.4-6.1 70 B.subtilis 47000 5.3-6.4 50 - 29 - Bảng 2.10 Một số chủng vi khuẩn trong nước thải có hệ enzyme β- amylase : vi sinh vật khối lượng phân tử của enzyme pH tối ưu nhiệt ñô tối ưu B.cereus 58000 7 40 B.polymyxa 42000 7.5 40 B.megaterium 58000 6.5 40-65 2.5 PHÂN LẬP VI SINH VẬT PHÂN HỦY TINH BỘT 2.5.1 Nguyên tắc phân lập Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban ñầu và ñưa về dạng thuần khiết. ðây là một bước có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. ðể phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột, ñầu tiên, phải lựa chọn nguồn lấy mẫu là nguồn có sự hiện diện của tinh bột (nước thải tinh bột, bùn hoạt tính tinh bột, các chế phẩm xử lý nước thải tinh bột…). Tách rời các tế bào vi sinh vật và nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng ñặc trưng ñể cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau (môi trường dinh dưỡng ñặc trưng ở ñây thành phần phải có tinh bột là nguồn carbon duy nhất). Kiểm tra và khẳng ñịnh các ñặc ñiểm hình thái và các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật. Sau cùng, giữ giống và bảo quản giống mới phân lập. 2.5.2 Phương pháp phân lập Lựa chọn nguồn lấy mẫu: có ba cách lựa chọn nguồn lấy mẫu: phân lập giống trong tự nhiên, phân lập giống trong ñiều kiện sản xuất và phân lập từ các ống giống bị thoái hóa. - Phân lập giống trong tự nhiên: lựa chọn nguồn phân lập là từ môi trường tự nhiên bản thân vi sinh vật. Ví dụ, cần phân lập các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột, trước hết phải xác ñịnh ñược các chủng vi sinh vật có hệ enzyme amylase và nơi sinh sống của chúng, từ ñiểm xuất phát ñó sẽ xác ñịnh ñược nguồn lấy mẩu phân lập. Ví dụ như vi khuẩn Bacillus subtilis có hệ enzyme amylase rất mạnh có thể phân lập chủ yếu từ môi trường ñất. - 30 - - Phân lập giống trong ñiều kiện sản xuất: chọn vị trí nguồn phân lập từ nguồn phát sinh cơ chất cần cho quá trình sống của vi sinh vật ñó. Ví dụ cần phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và ứng dụng ty trong xử lý nước thải tinh bột thì nguồn lấy mẫu phân lập ở ñây chính là nước thải hoặc bùn hoạt tính của nhà máy sản xuất tinh bột. - Phân lập giống trong các ống giống thoái hóa: do các ñiều kiện bảo quản và giữ giống không ñảm bảo ảnh hưởng ñến các ñặc tính của vi sinh vật từ ñó làm kéo theo ảnh hưởng ñến khả năng ứng dụng của giống trong ản xuất nên ta phải phân lập lại giống. Mục ñích của phương pháp này là luôn luôn duy trì ñược giống tốt cho sản xuất. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban ñầu: bằng các phương pháp tạo khuẩn lạc riêng rẽ như trải ñĩa, cấy ria, ñổ ñĩa, tiến hành cấy truyền ñến khi ñạt ñược thuần nhất một loại khuẩn lạc trên môi trường. Sau ñó, pha loãng khuẩn lạc với nước muối sinh lý, dùng kỹ thuật cấy trang và quan sát sự thuần nhất của khuẩn lạc khi phát triển trên môi trường. Kiểm tra các ñặc ñiểm hình thái và khẳng ñịnh các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật: bao gồm các phương pháp nhuộm gram, nhuộm bào tử, nguộm vỏ nhày, kiểm tra khả năng di ñộng… khẳng ñịnh các phản ứng sinh hóa bằng các phương pháp kiểm ñịnh catalase, indol, metyl red, citrate… sau ñó thống kê kết quả và ñưa ra dự ñoán giống cần phân lập. Giữ giống và bảo quản giống: có thể áp dụng một trong những phương pháp như phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản trong ñất hoặc cát, phương pháp bảo quản giống trong hạt ngũ côc, phương pháp bảo quản giống trong lớp dầu, phương pháp ñông khô, phương pháp làm lạnh ñông… ðược sử dụng rộng rãi hiện nay là cấy chuyền và bảo quản lạnh, phương pháp ñông khô và phương pháp làm lạnh ñông. Ở phần tìm hiểu chung về nước thải tinh bột nhận thấy thành phần của nước thải tinh bột chứa hàm lượng chất hữu cơ rất cao, ñồng thời tỷ lệ BOD5/COD khoảng 0.5 - 0.6 do ñó thích hợp cho xử lý bằng phương pháp sinh học. Trong số các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột thì Bacillus là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng - 31 - và tiềm năng nhất. ðây là cơ sở cho lý do chọn lọc các chủng có khả năng phân hủy tinh bột trong giai ñoạn phân lập. - 32 - Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM 3.1.1 Thời gian Thí nghiệm ñược thực hiện từ ngày 5/04/2010 – 28/06/2010 3.1.2 ðịa ñiểm ðịa ñiểm lấy mẫu: Công ty TNHH SX - TM - DV Phương ðông (FUDO food). ðịa chỉ: 8/30A - Ấp 4 - Xã ðông Thạnh - Huyện Hóc Môn - Tp. Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường ðại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 3.2.1 Dụng cụ Các dụng cụ và thiết bị dùng trong phân tích chỉ tiêu nước thải (bình ñịnh mức, ống nghiệm, bếp ñun, bình phá mẫu, pipet…) Các dụng cụ và thiết bị dùng trong phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột (ống nghiệm, ñĩa petri, autoclave, micro pipet, bếp ñun, cốc thủy tinh…) Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong các phương pháp ứng dụng chủng phân lập vào xử lý nước thải (máy lắc, tủ sấy…) 3.2.2 Hóa chất Hóa chất dùng cho phân tích chỉ tiêu môi trường (K2Cr2O7, H2SO4, NaOH, CuSO4, Na2S2O3, FAS, feroin, hồ tinh bột, molybdate…) Hóa chất dùng cho phân lập và xác ñịnh vi sinh vật phân hủy tinh bột (pepton, tinh bột tan, cao nấm men, agar, cimmon citrate, trypton, MRPV, urea…) - 33 - 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu dùng ñể phân lập ñược lấy từ nước thải và bùn hoạt tính của cơ sở sản xuất nui gạo Ký hiệu mẫu tương ứng như sau : nguồn nước thải (N) và bùn hoạt tính (B). 3.3.2 Phương pháp phân lập và xác ñịnh vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột: 3.3.2.1 Phương pháp phân lập Giai ñoạn phân lập - Bước 1: tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trong mẫu. Mẫu nước thải tinh bột và bùn hoạt tính từ nhà máy tinh bột ñược xử lý bằng cách ñun ở 85oC trong 15 phút. Sau ñó tiến hành pha loãng ở ba ñộ pha loãng khác nhau và cấy trang trên môi trường dinh dưỡng X
ủ 37oC
sau 24 giờ tiến hành cấy ria từng loại khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường dinh dưỡng X ñến khi thuần khiết các khuẩn lạc. Môi trường X là môi trường có chứa nguồn C, N cơ bản và một lượng tinh bột tan làm chất cảm ứng cho vi sinh vật phân hủy tinh bột phát triển. - Bước hai: kiểm tra và khẳng ñịnh khả năng phân hủy tinh bột. Sau khi có các khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành cấy vạch các khuẩn lạc vào môi trường dinh dưỡng Y, ủ 37oC. Sau 24 giờ, nhỏ dung dịch thuốc thử lugol vào các khuẩn lạc. Các chủng có khả năng phân hủy tinh bột sẽ xuất hiện vòng tan trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường còn lại trên ñĩa có màu xanh dương. Chủng nào không có khả năng phân hủy tinh bột thì xung quanh bắt màu xanh dương và không có vòng tan trong suốt. Môi trường Y là môi trường dinh dưỡng trong với nguồn C duy nhất là tinh bột. Chỉ những chủng vi sinh vật phân hủy ñược tinh bột mới có ñược nguồn C ñể phát triển. - 34 - Hình 3.1 Quy trình phân lập Mẫu nước thải N Mẫu bùn hoạt tính N Cấy trang trên môi trường dinh dưỡng X chứa tinh bột tan Cấy ria tạo khuẩn lạc riêng rẽ Cấy khuẩn lạc thuần khiết Thử khả năng phân hủy tinh bột trên môi trường dinh dưỡng Y với thuốc thử lugol (+) giữ cấy truyền Nhuộm gram (+) giữ cấy truyền Xác ñịnh các ñặc ñiểm hình thái Xác ñịnh các phản ứng sinh hóa Tổng hợp kết quả (-) loại (-) loại - 35 - 3.3.2.2 Các phương pháp xác ñịnh hình thái vi khuẩn Bảng 3.1 Các phương pháp xác ñịnh hình thái vi khuẩn STT Tên thử nghiệm Thuốc nhuộm Kết quả 1 Nhuộm Gram Tím tinh thể, lugol, fucshin Gram dương: màu tím Gram âm: màu hồng 2 Vỏ nhày Tím tinh thể, CuSO4 20% Tế bào màu tím Vỏ nhày màu nhạt 3 Bào tử Malichite, fucshin Tê bào màu hồng Bào tử màu lục 3.3.2.3 Các phản ứng sinh hóa xác ñịnh vi sinh vật Bảng 3.2 Các phản ứng sinh hóa xác ñịnh vi sinh vật Stt Tên thử nghiệm Môi trường sử dụng Thuốc thử Kết quả dương tính Kết quả âm tính 1 Phân hủy tinh bột Y Lugol Xung quanh vết cấy có vòng tan, phần môi trường màu xanh lam Xung quanh vết cấy không có vòng tan, phần môi trường màu xanh lam 2 Di ñộng Z - Vi khuẩn mọc lan ra vết cấy, môi trường ñục Vi khuẩn chỉ mọc dọc vết cấy, môi trường vẫn trong 3 Indol Trypton Kovac’s Bề mặt môi trường xuất hiện vòng ñỏ Bề mặt môi trường không xuất hiện vòng ñỏ - 36 - 4 Metyl red MRPV Metyl red Môi trường chuyển sang màu ñỏ Môi trường không ñổi màu 5 Voges- proskauer MRPV KOH, α- naphtol Xuất hiện vòng ñỏ trên bề mặt môi trường Không xuất hiện vòng ñỏ trên bề mặt môi trường 6 Citrate Simmon citrate - Môi trường chuyển sang màu xanh lam Môi trường không ñổi màu – màu xanh lục 7 Nitrate A diphenyla min Môi trường chuyển sang xanh lam Môi trường không ñổi màu 8 Urease Ure broth - Môi trường chuyển sang màu ñỏ hồng Môi trường không ñổi màu – màu tím 9 Lipase B - Xung quanh vết cấy có vòng tan trong suốt Xung quanh vết cấy không có vòng trong suốt 10 Catalase Y H2O2 Có sủi bọt Không sủi bọt 11 KIA/TSI TSI - Sử dụng gucose và lactose: toàn môi trường màu vàng. Không sử dụng hai nguồn ñường: toàn môi trường màu ñỏ. Phần nghiên màu ñỏ, phần sâu màu vàng: sử dụng glucose và ko6ng sử dụng lactose. Môi trường có phần màu ñen: sinh H2S Môi trường có khoảng trống, nứt thạch: có sinh hơi - 37 - 3.3.3 Phương pháp xác ñịnh thời gian tăng trưởng tối ưu của các chủng Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập ñược ở ñiều kiện lắc trong các bình erlen có 50ml môi trường dinh dưỡng chứa khoáng và tinh bột là nguồn C duy nhất. Sau các khoảng thời gian nhất ñịnh, ño mật ñộ sinh khối tế bào bằng máy ño quang phổ ở bước sóng 610nm. 3.3.4 Phương pháp xác ñịnh các thông số ô nhiễm ñầu vào của nước thải Các thông số môi trường cần ñược xác ñịnh bao gồm: thông số BOD, COD, N tổng số, P tổng số, pH. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành kiểm tra chỉ số Coliform tổng ñể ñánh giá mức ñộ ô nhiễm phân của nước thải trước khi xử lý. - 38 - Bảng 3.3 Các thông số môi trường và phương pháp xác ñịnh. Các thông số môi trường Phương pháp xác ñịnh COD (nhu cầu oxy hóa học) Oxy hóa chất hữu cơ trong mẫu bằng hỗn hợp K2Cr2O7 và H2SO4 có xúc tác. Lượng K2Cr2O7 và H2SO4 sẽ giảm tương ứng với lượng chất hữu cơ có trong mẫu. Lượng K2Cr2O7 dư sẽ ñược ñịnh phân bằng dung dịch Fe(NH4)2(SO4)2 với chỉ thị feroin. Từ ñó tính ñược lượng chất hữu cơ trong mẫu tỉ lệ với lượng K2Cr2O7 ñã phản ứng với chất hữu cơ. BOD (nhu cầu oxy sinh học) Sử dụng chai DO có V = 300ml. ðo hàm lượng DO ban ñầu và sau 5 ngày ủ ở