Luận văn Nghiên cứu ứng dụng đạm thủy phân từ trùn quế (Perionyx Excavatus) để nuôi cấy vi sinh vật

ày mất nhiều thời gian. Phương pháp đếm điện tử: Người ta dung máy đếm điện tử. Nguyên tắc là sự thay đổi đột ngột của điện trở được ghi thành một chấn động. Điện trở ở một khe có chất lỏng chảy qua, số tế bào vi sinh vật làm điện trở gia tăng. Điểm bất lợi là chấn động được tạo ra với cả hạt bụi nên máy phải thật sạch. Phương pháp quang học: Dùng quang phổ kế. Chiếu một chùm tia sáng qua một ống nghiệm chứa vi khuẩn, độ đục của môi trường làm giảm cường độ của chùm tia sáng và được ghi nhận trên một khung chia thành đơn vị OD. Vì số ánh sáng tương ứng với mật số tế bào nên người ta so sánh với đường biểu diễn chuẩn để suy ra mật số tế bào trong một đơn vị thể tích. III. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước nhóm enzyme protease Hiện nay, ở nước ta và trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng sản phẩm từ enzyme protease. 1. Trong nước của thịt cá nếu chỉ do một loại enzyme duy nhất tác động thì không bao giờ hoàn toàn, nếu có tác động của các loại enzyme khác thêm vào thì quá trình a sẽ nhanh hơn. cá trong quá trình lên men nước mắm có bổ sung 10% nấm sợi Aspergillus oryzae 22 tuần xuống còn 14 tuần, tăng hàm lượng đạm tổng số, đạm amin, giảm lượng đạm amôn, có khả năng áp dụng để sản xuất nước mắm nhanh. Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá (1998) nghiên cứu quá trình lên men nước mắm cá trích có bổ sung 10% chế phẩm protease nấm sợi, kết quả trong hai tháng đầu mật số vi sinh vật ưa muối trong nước bổi cao hơn so với nước bổi không bổ sung nấm sợi. Đạm tổng số và đạm amin tăng cao, đồng thời giảm đáng kể lượng đạm amôn. Vũ Ngọc Bội và Đồng Thị Thanh Thu (2003) nghiên cứu thu nhận protease từ canh trường nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis (Saurida tumbil) và thử nghiệm sản xuất nước mắm từ cá cơm thường (Stolephorus commersonii tốt nhất ở nhiệt độ 50 C, pH tự nhiên của cơ chất, nồng độ protease 0,3%, lượng nước bổ sung 20% và có bổ sung 3% muối ăn hoặc 8% ethanol hay 4% sorbitol để ức chế quá trình gây thối, trong đó sử dụng sorbitol cho bột đạm có hàm lượng acid amin cao hơn, mùi thơm hơn và đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật. Sử dụng protease B. subtilis , sản phẩm có hàm lượng và thành phần acid amin cao hơn phương pháp truyền thống và các phương pháp bổ sung các enzyme thương mại : NFĐ, Neutrase, Flavourzyme. và ctv. (2005) nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng để sản xuất chitin từ phế liệu tôm và cải tiến quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành. Kết quả cho thấy nguồn thu nhận có hiệu quả nhất là vi sinh vật. Từ đó đã xây dựng được quy trình thu nhận chế phẩm protease từ Bacillus subtilis cồn tốt nhất ở nhiệt độ 50  5 giờ. Sản xuất nước chấm bằng phương pháp kết hợp enzyme-acid cho phép giảm lượng acid sử dụng, rút ngắn chu kỳ sản xuất và hạ giá thành sản phẩm. 2. Ngoài nước Nielsen P.M. el al . Kết quả cho thấy phương pháp OPA dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và chính xác hơn, phạm vi áp dụng rộng hơn và ít độc hại hơn so với phương pháp TNBS (trinitro-benzene-sulfonic acid). Hrčková Martina et al nhau: Flavourzyme, Novozym và Alc  5% bằng ba enzyme protease khác (19%),  (12,9%). Salem F. M. A. et al. (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ đầu quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Aspmo Stein Ivar et al 55 của nó hoặc bổ sung một trong số bảy enzyme protease thương mại . Nakajima Nobuyoshi et al Lumbricus rubellus. - - . PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Phương tiện nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học 1. Nguyên liệu Trùn quế đã đông khô trữ lạnh ở -20oC. 2. Thiết bị và dụng cụ Một số thiết bị như: tủ ủ (Ehret), máy quang phổ kế (U-1500, Hitachi), máy ly tâm (Centaur 2, U.K), máy khuấy từ (Heidolph, Germany), máy đo pH (inoLab), bếp điện, cân phân tích, buồng cấy vi sinh vật, máy lắc ủ (Heidolph, Germany), nồi khử trùng.….. Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong, ống nghiệm, micropipet, que cấy… 3. Hóa chất BSA (Biovin Serum Albumin) (Merck), NaCl (Merck), Borax (Disodium tetraborate) (TQ), SDS (Sodium dodecyl sulfat) (Merck), OPA (Ortho- phthaldialdehyde) (Merck), DTT (Dithiothreitol) (Merck), Serine (Merck), Ethanol (Merck), HCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), Acid phosphoric 85% (Merck). Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton (Hà Lan), dịch chiết thịt bò, dịch chiết nấm men, agar, natri clorua, đường… - Môi trường Luria Broth (LB): Pepton 10 gam Yeast extract 5 gam NaCl 10 gam Agar 15-20 gam (nếu dùng môi trường đặc) Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH 7,2. - Môi trường nuôi cấy nấm men (YEB): Dịch chiết thịt bò 5 gam Dịch chiết nấm men 1 gam Pepton 5 gam Đường 5 gam Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH = 6 Môi trường đạm dịch trùn quế thủy phân được tính để thay thế dựa trên lượng đạm amin của 10 hoặc 5 gam pepton tùy theo môi trường nuôi cấy. II. Phương pháp nghiên cứu 1. Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu a. Chuẩn bị mẫu - Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm < 5%) và trữ lạnh ở -20oC. Đem xay mịn bằng máy xay sinh tố rồi tiến hành tự thủy phân với các điều kiện tối ưu cho quá trình tự thủy phân đã được nghiên cứu theo Phạm Thị Quỳnh Trâm (2008). - Tiến hành: Cân 26,52 gam trùn quế sấy đông khô đã xay mịn, bổ sung 173,48 ml nước cất, dịch thủy phân đạt nồng độ protein 9%. Thuỷ phân trong 24 giờ ở nhiệt độ 55oC. Cân lượng pepton Hà Lan (độ ẩm < 6 %) tương đương trùn quế sấy đông khô pha trong cùng lượng nước cất. Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin. b. Xác định thành phần đạm nguyên liệu Hàm lượng đạm tổng số Phương pháp: dùng phương pháp Kjeldahl (Phụ lục 1) Hàm lượng protein hòa tan Phương pháp: đo hàm lượng protein nguyên liệu theo phương pháp Bradford (Phụ lục 2) Hàm lượng đạm amin Phương pháp: Xác định theo phương pháp OPA (Nielsen et al, 2001). (Phụ lục 3) 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật a. Thí nghiệm 1: Xác định lượng đạm amin của trùn quế thay thế đạm amin của pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. Coli DH 5 - Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường LB nuôi cấy chủng vi khuẩn E. Coli DH 5 . Đây là chủng vi khuẩn được dùng trong công nghệ gen và hiện đang sử dụng tại phòng Công nghệ gen thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ. - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ: A1 = 0% A2 = 25% A3 = 50% A4 = 75% A5 = 100% - Tiến hành: Vi khuẩn E. coli DH 5được nuôi trong môi trường Luria Broth. Pepton và dịch đạm trùn quế được xác định hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA (Nielsen, 2001) để quy về lượng đạm amin như nhau giữa các nghiệm thức từ A1 đến A5. Sau đó chủng 0,1% (v/v) vi khuẩn E. coli DH 5 . Tiến hành ủ ở 37oC với tốc độ lắc là 110 vòng/ phút. Sau 16 giờ tăng trưởng sẽ đo độ đục ở bước sóng 600nm (OD600nm) để xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn trên các nghiệm thức. Kết quả: Chọn được lượng bột đạm thích hợp để tiến hành thí nghiệm 2. b. Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. Coli DH 5theo thời gian Môi trường lỏng - Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn E. Coli DH 5 sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng đạm amin thay thế đã chọn từ thí nghiệm 1 và so sánh sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5theo thời gian trên hai môi trường đạm pepton và đạm thay thế. - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ: B1 = 3 giờ B2 = 6 giờ B3 = 9 giờ B4 = 15 giờ B5 = 18 giờ B6 = 21 giờ B7 = 24 giờ B8 = 27 giờ B9 = 30 giờ - Tiến hành: Vi khuẩn cũng được chủng 0,1% (v/v) vào môi trường Luria Broth. Và nuôi trên máy lắc ủ, 110 vòng/phút, nhiệt độ 37oC. Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại. Cứ sau 3 giờ kể từ khi bắt đầu chủng vi khuẩn cho đến 30 giờ, lấy 1,5ml cho vào eppendorf, trữ ở 4oC để tiến hành đo độ đục ở OD600nm. Môi trường thạch đĩa. - Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc E. coli DH 5 theo thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thay thế. - Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống môi trường lỏng (Luria Broth) nhưng có thêm agar 2%. Dùng que cấy chuyển vi khuẩn E.coli DH 5 lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 37oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của vi khuẩn sau 16, 24, 36 giờ. c. Thí nghiệm 3: Xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae - Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae. Đây là chủng nấm men được sử dụng lên men rượu phổ biến và hiện đang sử dụng tại phòng Vi sinh thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ. - Bố trí thí nghiệm: C1 = 0% C2 = 25% C3 = 50% C4 = 75% C5 = 100% Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố C: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ. - Tiến hành: Chủng 0,1%(v/v) nấm men vào các bình tam giác 100ml có chứa môi trường nuôi cấy nấm men với hàm lượng đạm amin bằng nhau giữa các nghiệm thức. Ủ lắc ở 30oC, 110vòng/phút. Sau 24 giờ phát triển, tiến hành đo độ đục môi trường nuôi ở OD600nm. d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời gian Môi trường lỏng - Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng nấm men YEB sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng bột đạm thay thế đã chọn từ thí nghiệm 3. - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố D: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ: D1 = 3 giờ D2 = 6 giờ D3 = 9 giờ D4 = 15 giờ D5 = 18 giờ D6 = 21 giờ D7 = 24 giờ D8 = 27 giờ D9 = 30 giờ - Tiến hành: Thí nghiệm này cũng được tiến hành tương tự với thí nghiệm 2. Môi trường thạch dĩa - Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc nấm men YEB theo thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm bột trùn quế thay thế. - Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống như trong môi trường lỏng nhưng thêm 2% agar. Dùng que cấy chuyển nấm men lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 30oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của nấm men sau 24 và 36 giờ. PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 1. Thành phần đạm nguyên liệu Mẫu trùn quế chuẩn bị trong phần thực nghiệm II.1.a, sau 24 giờ tự thủy phân được đun sôi 30 phút, ly tâm 7000 vòng/phút, 20 phút. Thu được 180 ml dịch đạm thủy phân xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin cùng với mẫu pepton (Hà Lan) làm đối chứng. Kết quả ghi nhận được theo bảng 4. Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton. Mẫu Protein tổng (mg) Đạm amin tổng (mgN) Dịch đạm thuỷ phân 20,88 1299 Pepton Hà Lan 49,06 719 Trong dịch đạm thuỷ phân và pepton, thành phần chiếm đa số là các peptid ngắn và acid amin, do đó khi xác định protein bằng phương pháp Bradford cho kết quả rất thấp do thuốc thử này chỉ bắt màu với những protein có trọng lượng phân tử trên 4000 Da (Nielsen S.S, 2003). Ngoài ra, với cùng một khối lượng mẫu 26,52 gam thì hàm lượng đạm amin trong bột trùn quế đã được thủy phân cao hơn so với pepton Hà Lan, gấp khoảng 1,8 lần. Dự đoán đây có thể là môi trường rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, kết quả này bước đầu rất có ý nghĩa để tính lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếp theo. 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 Tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và 100% (A1, A2, A3, A4 và A5), không thay đổi các thành phần khác. Sau 16 giờ nuôi cấy liên tục, tiến hành lấy mẫu đo độ đục ở độ hấp thụ OD600nm. Kết quả cho ở bảng 5 cho ta thấy các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% có độ đục không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Nghiệm thức thay thế đạm pepton bằng 100% đạm trùn quế có độ đục cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại. Điều này chứng tỏ với môi trường đạm trùn quế thủy phân 100% vi khuẩn E. coli DH 5 đã phát triển tốt nhất và tốt hơn cả môi trường chỉ có đạm pepton thương mại (nghiêm thức A1). Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5 . Nghiệm thức A1 A2 A3 A4 A5 OD* 600nm 0,518b 0,517b 0,530ab 0,518b 0,540a * Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05) Kết quả thí nghiệm cũng tương tự của Nakajima và ctv (2000) dùng dịch đạm tự thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E. Coli XL 1-Blue cho sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môi trường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy. Như vậy có thể khẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thế đạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB. Hình 2 sau đây mô tả sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 sau 16 giờ nuôi cấy. A1 A2 A3 A4 A5 A1 A2 A3 A4 A5 Hình 2: Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5 16 giờ b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian Trong môi trường lỏng Sau thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế lượng pepton thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 , nhận thấy dịch trùn quế thủy phân hoàn toàn có thể thay thế bột đạm pepton, nên trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng nhóm vi khuẩn này theo thời gian được nuôi cấy trên hai môi trường 100% dịch thủy phân trùn quế và 100% lượng pepton theo môi trường LB. Kết quả hình 3 cho thấy đường tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5theo thời gian trên hai môi trường đều như nhau. Ở thời điểm ban đầu vi khuẩn có mật số bằng nhau, nhưng sau 3 giờ tăng trưởng vi khuẩn bắt đầu tăng sinh khối mạnh (giai đoạn log) và đạt đến cực đại ở móc thời gian 18 giờ. Sau đó thì chuyển sang giai đoạn cân bằng và chết. Tuy nhiên, trong môi trường đạm trùn quế thủy phân, vi khuẩn phát triển mạnh hơn khoảng 1,5 lần so với môi trường đạm pepton. Ngay từ đầu giai đoạn log, E. coli DH 5 trong môi trường đạm trùn quế đã có xu hướng phát triển vượt trội và đạt giá trị OD600nm tối đa (0,650) ở 18 giờ. Trong khi đó, nếu sử dụng đạm pepton thì giá trị OD600nm chỉ đạt 0,436. Sau thời điểm này thì ở cả hai môi trường đạm khác nhau vi khuẩn đều chuyển sang giai đoạn cân bằng. Kết quả thống kê ở từng thời điểm từ 6 giờ đến 30 giờ giữa hai nghiệm thức đều có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) (bảng 11, phụ lục 1).Từ kết quả trên, một lần nữa khẳng định khả năng thay thế đạm trùn quế trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn là rất khả thi, mở ra một hướng ứng dụng mới từ trùn quế. Đây là nguồn đạm dồi dào vừa rẻ tiền lại vừa cho hiệu quả cao. 0.7 0.6 OD 600nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0  0 5 10 15 20 25 30 Thời gian tăng trưởng (giờ)  Pepton Trùn quế thủy phân Hình 3: Sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian Môi trường thạch đĩa Trong cùng điều kiện nuôi cấy, mật số vi khuẩn, thành phần dinh dưỡng là như nhau, hai môi trường chỉ khác nhau ở nguồn đạm pepton và đạm từ trùn quế. Sự khác biệt về kích thước tăng trưởng của vi khuẩn trên hai loại đạm pepton và đạm trùn quế được thể hiện rõ trên hình 4, 5 và 6 nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LB. Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 4: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16 giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 5: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5 sau 24 giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 6: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5 sau 36 giờ Quan sát khuẩn lạc trên hai đĩa môi trường ở mỗi điểm thời gian, nhận thấy chúng to dần từ 16 giờ đến 36 giờ. Khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế luôn luôn có kích thước lớn hơn trên môi trường đạm pepton. Như vậy kết quả này đã kiểm chứng lại về mặt dinh dưỡng nhờ thành phần đạm amin có mặt trong dịch trùn quế thủy phân cao hơn bột pepton nên đã giúp cho khuẩn lạc phát triển tốt. c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. Tương tự như thí nghiệm 1, tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và 100% (C1, C2, C3, C4 và C5), không thay đổi các thành phần khác. Kết quả đo OD600nm (bảng 6) cho thấy với hàm lượng đạm amin của trùn quế thay thế cho đạm pepton tăng dần thì mức độ tăng trưởng của nấm men cũng tăng theo và hoàn toàn khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Nghiệm thức 100% đạm trùn quế thủy phân (nghiệm thức C5) cho giá trị OD cao nhất (0,975), khác biệt có ý nghĩa với tất cả các nghiệm thức còn lại. Do đó, C5 vẫn là nghiệm thức được chọn thay thế cho đạm pepton hiệu quả nhất. Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae . Nghiệm thức C1 C2 C3 C4 C5 OD* 600nm 0,802e 0,850d 0,902c 0,942b 0,975a * Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05) C1 C2 C3 C4 C5 C1 C2 C3 C4 C5 Hình 7: Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ Với kết quả này một lần nữa chứng tỏ dịch đạm thủy phân từ trùn quế tương tự dịch đạm từ loài trùn đất Lumbricus rubellus, đều cho sự tăng trưởng tốt cả trên môi trường nuôi cấy nấm men bánh mì với tỉ lệ bột pepton thay thế 0,2%. d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian Môi trường lỏng Thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế sử dụng trong môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae cho thấy có thể thay thế 100% lượng pepton Hà Lan. Vì vậy, trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng chủng nấm men này theo thời gian được thực hiện với nghiệm thức 100% dịch thủy phân trùn quế và nghiệm thức 100% lượng pepton làm đối chứng. Kết quả được thể hiện ở hình 8 cho thấy giữa hai môi trường đạm trùn quế thủy phân và pepton đều có đường tăng trưởng theo thời gian như nhau và có sự khác biệt không nhiều về độ đục được đo OD600nm ở các thời điểm giữa hai nghiệm thức có thể do trong thí nghiệm này nguồn đạm từ trùn quế trong môi trường YEB sử dụng không nhiều (0,5% theo w/v). Kết quả được thống kê ở bảng 14 (phụ lục 1) cũng cho thấy nhận định trên là chính xác vì chỉ có các thời điểm 6, 9, 21, 27 và 30 giờ khác biệt có ý nghĩa. Nhìn chung, các thời điểm ở nghiệm thức sử dụng đạm từ trùn quế thủy phân đều cao hơn so với nghiệm thức nuôi cấy trên môi trường đạm pepton Hà lan nhưng độ lệch không rõ như thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn E.Coli DH 5 có thể do môi trường LB sử dụng nguồn đạm khá cao (1% theo w/v). Như vậy, một lần nữa chứng minh nguồn đạm thủy phân từ trùn quế có thể thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy nấm men hiệu quả hơn, đồng thời giảm giá thành cho môi trường nuôi cấy. 1.0 0.9 0.8 OD 600nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0  0 5 10 15 20 25 30 Thời gian tăng trưởng (giờ)  Pepton Trùn quế thủy phân Hình 8: Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trường đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian Môi trường thạch đĩa Quan sát khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae sau 24 và 36 giờ ủ trên môi trường YEB nhưng có thêm agar 2% ở hình 9 và 10 cho thấy các khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế có kích thước từ bằng đến to hơn trên môi trường đạm pepton. Từ đó, khẳng định rằng nguồn đạm từ trùn quế hoàn toàn có khả năng thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy vi sinh vật với hiệu quả tối ưu. Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 9: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 10: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36 giờ 3. Hiệu quả kinh tế giữa bột đạm từ trùn quế và bột pepton Hà Lan 1 lít môi trường LB và môi trường YEB. Nếu dựa vào bảng kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton (bảng 4). Tính toán lượng đạm amin tương đương nhau khi pha môi trường, trong 10 gam pepton có khoảng 270mgN thì lượng trùn quế sử dụng để thủy phân có lượng đạm amin tương đương chỉ cần có 5,5 gam. Kết quả bảng 7 và 8 cho thấy giá thành giảm gần một nửa cho 1 lít môi trường nuôi cấy, chủ yếu cho các hóa chất khác. Vì thế việc sử dụng nguồn dịch đạm thủy phân từ trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá trị thương mại của loài trùn đất nuôi công nghiệp này góp phần mở rộng và phát triển mô hình nuôi trùn quế phục vụ người dân vùng đồng bằng sông Cửu Long. Bảng 7: Giá thành 1 lít môi trường LB Thành phần Số lượng Đơn giá (đồng/gam) Thành tiền (đồng) Pepton Dịch chiết nấm men NaCl 10 gam 5 gam 10 gam 3.000 4.000 200 30.000 20.000 2.000 Môi trường LB 1 Lít TỔNG 52.000 Bột trùn quế Dịch chiết nấm men NaCl 5,5 gam 5 gam 10 gam 300 * 4.000 200 1.650 20.000 2.000 Môi trường LB 1 Lít TỔNG 23.650 Bảng 8: Giá thành 1 lít môi trường YEB Thành phần Số lượng Đơn giá (đồng/gam) Thành tiền (đồng) Dịch chiết thịt bò Pepton Dịch chiết nấm men Sacarose 5 gam 5 gam 1 gam 5 gam 4.000 3.000 4.000 500 20.000 15.000 4.000 2.000 Môi trường YEB 1 Lít TỔNG 41.000 Dịch chiết thịt bò Bột trùn quế Dịch chiết nấm men Sacarose 5 gam 2,75 gam 1 gam 5 gam 4.000 300* 4.000 500 20.000 830 4.000 2.000 Môi trường YEB 1 Lít TỔNG 26.830 * Theo Phạm Thị Quỳnh Trâm để được 1 kg bột trùn quế sau khi thủy phân, trừ mọi chi phí khấu hao máy móc, tiêu tốn năng lượng, nhân công, sấy phun giá thành khoảng 300.000 đồng. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận Từ các kết quả thí nghiệm, rút ra được kết luận sau: 1. Có thể thay thế đạm pepton hoàn toàn bằng đạm thủy phân từ trùn quế trong môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. 2. Cùng một lượng đạm amin, nguồn đạm thủy phân từ trùn quế cho sự tăng trưởng nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn E. coli DH 5 và từ bằng đến tốt hơn khi nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton Hà Lan. 3. Khi thay thế bột đạm từ trùn quế có thể giảm giá thành xuống 1/2 lần cho 1 lít môi trường nuôi cấy so với bột đạm pepton từ Hà lan. Điều này sẽ tiết kiệm được chi phí rất lớn một khi sử dụng môi trường nuôi cấy vi sinh vật với quy mô công nghiệp. II. Đề nghị 1. Thử nghiệm trên một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật khác để kiểm chứng bột đạm thủy phân cho độ tin cậy cao hơn. 2. Bổ sung chất phụ gia vào sản phẩm thủy phân dịch trùn quế trước khi sấy phun để có độ ẩm thích hợp nhằm bảo quản bột đạm trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Thị Hương Giang. 2008. Bài giảng protein và enzyme. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ .2005. Thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2007. Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục. 4. Nguyễn Hữu Hiệp. 2007. Giáo trình vi sinh vật đại cương. Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ. 5. Nguyễn Đức Lượng. 1996. Công nghệ vi sinh vật, Tập 1: cơ sở vi sinh vật công nghiệp. Trường Đại học Bách khoa TP. HCM 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB ĐH Quốc gia TP.HCM. 7. Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá. 1998. Sử dụng chế phẩm protease nấm sợi sản xuất nhanh nước mắm, Luận án thạc sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đaị học Cần Thơ. , Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn và Phạm Thị Ánh Hồng. 2006. Nghiên cứu chiết tách và tinh sạch protease từ trùn quế, Hội nghị Khoa học lần thứ 5- Tóm tắt nội dung báo cáo khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. 10. Phan Thị Bích Trâm, Phạm Thị Quỳnh Trâm, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, 2008. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo đạm amin của quá trình tự phân giải trùn quế (Perionyx excavatus), Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 121(4), 53-56 11. Phạm Thị Quỳnh Trâm. 2008. Khả năng sử dụng sản phẩm tự phân giải (autolysis) của trùn quế (Perionyx excavatus) làm thức ăn c