Luận văn Nghiên cứu ứng dụng Enzyme α-Amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

– Khoa NN & SHUD Trang 6 hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất tinh khiết. α-amylase, β-amylase, glucoamylase là những enzyme biến tính tinh bột quan trọng nhất. α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) là loại enzyme ngoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu nhiên. Đó cũng là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột với sản phẩm chính tạo thành là các dextrin. β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose. Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6 glucoside ở amylopectin nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 ÷ 60% maltose và dextrin giới hạn. Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose. Enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin, glycogen và những polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isoamylase thường được sử dụng kết hợp với β-amylase trong sản xuất siro hay đường glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase. 2.2.1 - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)  Đặc tính α-amylase từ động vật và vi sinh vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị I như Cl- > Br- > I-, α-amylase từ thực vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II như Ca2+. α- amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu enzyme α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. α-amylase bền nhiệt hơn các amylase khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 7 Bảng 2.2: Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau STT Enzyme Nguồn Khoảng pH tốithích Khoảng nhiệt độ tối thích (0C) 1 α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis 4,5 - 9(6,5 - 7,5) 70 - 85 (95) 2 α-amylase vi khuẩnchịu nhiệt Bac. licheniformic 5,8 - 8 (7,0) 90 - 105 (120) Aspergillus oryzae 4,0 - 7,0 55 - 60 3 α-amylase nấm sợi Aspergillus niger 5,0 - 6,0 80 Dịch malt 3,5 - 6,5 70 4 α-amylase malt Bột malt 4,5 - 7,0 85 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) α-amylase có nguồn gốc khác nhau có thành aicd amin khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic. Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH, -NH2. α- amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1 ÷ 30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1 ÷ 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2,3 của enzyme. Ngoài duy trì cấu hình hoạt động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Cơ chế tác dụng α-amylase có khả năng phân cắt liên kết -1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó α-amylase được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme) Quá trình thủy phân này trải qua nhiều giai đoạn:  Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thủy phân nhanh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.  Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-, trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 8 chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm malttotetrose, matotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên sản phẩm cuối cùng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin phân tử thấp và các izomaltose 8% (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Dưới tác dụng của α-amylase, dung dịch hồ tinh bột sẽ bị làm loãng nhanh chóng và các dextrin sẽ được tạo thành cho phản ứng màu với iodine hay cho màu đỏ nâu. Do đó có thể xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột hoặc xác định lượng tinh bột đã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với iodine hoặc bằng cách xác định đường khử tạo thành (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)  Đặc tính Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc -SH, - COOH, cùng với vòng amidazol, của các gốc histidine. Enzyme β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định. Enzyme β-amylase không bền khi có Ca2+, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 700C. Nhiệt độ tối thích là 550C Hình 2.2 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 9 và pH tối thích là 5,1-5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Cơ chế tác dụng Enzyme β-amylase thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside trong tinh bột, glycogen, polysacharid đồng loại. Phân cắt tuần tự gốc maltose ở đầu không khử, maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exoenzyme). Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo thành 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β- amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Các dextrin này có chứa liên kết α-1,6 glycoside bắt màu đỏ tím với iod. Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%) (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.2.3  - amylase ( - 1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)  Đặc tính   - amylase còn có tên gọi là glucoamylase.   - amylase có chủ yếu trong nấm mốc và một số loài vi khuẩn, -amylase bền với acid hơn β-amylase.   - amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+.   - amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết-1,4 glucoside và-1,6 glucoside.  Cơ chế tác dụng Glucoamylase phân hủy tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo thành glucose mà không cần có một enzyme amylase nào khác. Nó có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysaccharide đồng loạt ở các mối nối liên kết -1,4 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men được và do đó nâng cao hiệu suất nấu rượu từ tinh bột (Nguyễn Đức Lượng, 2004). β - amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 10 Bảng 2.3: Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau. Nguồn enzyme Khoảng pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (0C) Aspergillus 3,0 – 6,0(4,5 – 5,0) 55 – 60 90 A. awamori 2,0 – 7,0(3,0 – 5,0) 55 – 65 85 Rhizopus 3,0 - 6,0(3,5 – 5,5) 55 – 60 70 - 80 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hình 2.3: Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột 2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase Enzyme oligo-1,6-glucosidase thủy phân liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose và các dextrin thành đường có thể lên men được. Enzyme có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm. Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase và dextrin- 1,6-glucosidase. Amylose Amylopectin Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 11 2.2.5 Pullulanase Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glycoside trong tinh bột và glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. Enzyme này có khả năng thủy phân những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α- 1,6-glycoside. 2.2.6 Transglucosidase Enzyme transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó thường gây sự nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6-glucoside để tạo thành panose và izomaltose. Cơ chế phân cắt tinh bột của amylase được minh họa trong hình sau: Hình 2.4: Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME 2.3.1 Nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra 3 giai đoạn: Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 12  Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.  Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.  Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo. Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được. 2.3.2 Nồng độ enzyme Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme. Tốc độ phản ứng V = k [E] Trong đó: V: tốc độ phản ứng [E]: nồng độ enzyme Cũng có trường hợp khi nồng dộ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004). Hình 2.6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng enzyme Nồng độ cơ chất0 Km Tốc độ phản ứng max2 1 V Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 13 Thời gian phản ứng của enzyme amylase sẽ giảm nếu như tăng nồng độ enzyme amylase theo thời gian. 2.3.3 Nhiệt độ Bản chất của enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc. Tại khoảng nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt độ tăng 100C (Nguyễn Thị Thu Thủy). Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Qua đồ thị trên ta thấy nhiệt độ tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn. Tuy nhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt độ, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa do khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất Nồng độ enzyme0 Tốc độ phản ứng Hình 2.7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Hình 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứng Nhiệt độ (0C)0 Tốc độ phản ứng Hình 2.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme Hình 2.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 14 nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ mất dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.3.4 pH môi trường Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. Trong những thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động enzyme. Vượt quá giới hạn pH này hoạt động enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Đối với enzyme amylase, pH hoạt động tối thích tùy thuộc vào nguồn gốc sản xuất enzyme. Ở đây thời gian thủy phân của nó thấp nhất. 2.3.5 Các chất kìm hãm Hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm một số chất như những ion kim loại Mg2+… các chất vô cơ, hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào. Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Phản ứng enzyme [E] và chất kìm hãm [I] nhanh chóng đạt đến cân bằng: Trong đó: K1, K2: hằng số tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng pH0 Hình 2.11: Ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứng Hình 2.12: Ảnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 15  Các chất kìm hãm cạnh tranh Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó chúng có khả năng kết hợp với enzyme ở trung tâm hoạt động của enzyme. Chúng choán vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động của enzyme, kết quả là enzyme không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức ES (Nguyễn Đức Lượng, 2002).  Các chất kìm hãm không cạnh tranh Khác với kiểu cạnh tranh trên, kiểu cạnh tranh này là chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme . Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S ES E + P E + I EI ES + I EIS EI + S  EIS (Nguyễn Đức Lượng, 2002)  Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + S ES  E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004) 2.3.6 Các chất hoạt hóa Chất hoạt hóa là các chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành E + I K1 K2 E I Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 16 hoạt động, từ hoạt động yếu trở nên hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa nhóm, chuyển gốc hóa học. - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme. - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptide, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động. - Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa các ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme . - Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua nồng độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004). 2.4 PHƯƠNG TRÌNH ĐỘNG HỌC – PHƯƠNG TRÌNH MICHALIS- MENTEN Sơ đồ phản ứng enzyme hai giai đoạn theo cơ chế Michalis - Menten có thể viết như sau: Trong đó: k1: hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES. k2: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại chất ban đầu và enzyme. k3: hằng số vận tốc phản ứng phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P. Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ phức hợp ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn. Từ phương trình (1) ta có thể thiết lập các phương trình vận tốc phản ứng như sau: - Vận tốc phản ứng tạo thành phức hợp ES là: k1[E] [S] = k1([E0] – [ES]) [S] (2) E S+ k2 k1 ES +E Pk3 (1) Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 17 Với: [E0]: nồng độ enzyme ban đầu [ES]: nồng độ phức trung gian enzyme - cơ chất [E]: nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt đến cân bằng Do đó: [E] = [E0] – [ES] Nồng độ cơ chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến cân bằng vì nồng độ cơ chất trong phản ứng luôn lớn hơn nhiều lần nồng độ enzyme, do đó có thể bỏ qua lượng [S] ở trong phức chất ES; khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme thường xác định vận tốc ban đầu, lượng cơ chất bị chuyển hóa chưa đáng kể so với nồng độ ban đầu của nó. - Vận tốc phân ly phức hợp ES là tổng vận tốc của hai phản ứng.  Phản ứng phân ly phức hợp ES để tạo E và S (ngược lại với phản ứng kết hợp)  Phản ứng biến đổi phức hợp ES thành sản phẩm phản ứng P và giải phóng enzyme ở dạng ban đầu E. Do đó vận tốc phân ly phức hợp ES bằng: k2 [ES] + k3[ES] = (k2 + k3) [ES] (3) Khi hệ thống phản ứng đạt tới cân bằng, vận tốc tạo thành ES bằng vận tốc phân ly ES: k1 ([E0] – [ES]) [S] = (k1+k2) [ES] (4) Để đơn giản dùng hằng số: 1 32 k kkKm  Từ (4) ta suy ra:       SK SEES m   0 (5) Như trên chúng ta có nói, ES càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, thì tất cả các phân tử enzyme có trong phản ứng đều tham gia trong phức ES, vận tốc phản ứng sẽ đạt đến cực đại (Vmax). Do đó ta có thể lập tỷ lệ sau:    0max E ES V V  (6) Từ (5) ta có: Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 18        SK S E ES m   0 Thay vào phương trình (6) ta sẽ có:    SK S V V m   max    SK SVV m   max (7) Đây là phương trình Michaelis – Menten đã được Hoiden và Briggx hoàn thiện. Km được gọi là hằng số Michaelis và đặc trưng cho mỗi enzyme - Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng enzyme càng lớn (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006). Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 19 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 02/02/2009 đến 03/05/2009 Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu Nếp trắng được mua ở chợ Xuân Khánh - Thành Phố Cần Thơ, chọn loại không lẫn các loại nếp khác, có mùi thơm đặc trưng. Enzyme α-amylase ở dạng thương mại được mua ở cửa hàng hóa chất - Thành phố Cần Thơ. 3.1.3 Hóa chất  Dung dịch acid acetic 0,2M  Dung dịch natri acetate 0,2M  NaOH 0,1N, HCl  Pb(CH3COO)2 30%, Na2SO4 bão hòa  Fehling A, fehling B, metyl xanh  KI, iod khan  Acid citric dùng để chỉnh pH  Tinh bột tinh khiết 3.1.4 Dụng cụ  Máy nghiền  Cân kỹ thuật  Buret, pipet, micropipette, bình tam giác  Nồi ủ nhiệt  pH kế  Bếp điện  Các dụng cụ cần thiết khác của phòng thí nghiệm: nhiệt kế, ống đong… 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân tích hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 20 Xác định Vmax, Km theo phương pháp Lineweaver – Burk. Các số liệu được xử lý bằng chương trình thống kê StatGraphics – Plus 4.0 và sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.  Mục đích Xác định được điều kiện tối ưu về pH và nhiệt độ cho quá trình thủy phân của α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng.  Chuẩn bị mẫu - Nguyên liệu nếp trắng đã được nghiền nhỏ. - Enzyme α-amylase  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nhiệt độ và pH với 2 lần lặp lại. Nhân tố A: pH được khảo sát ở 5 mức độ, từ 5,5 đến 7,5. A1: 5,5 A3: 6,5 A5: 7,5 A2: 6,0 A4: 7,0 Nhân tố B: nhân tố nhiệt độ (0C), khảo sát ở 3 mức độ, từ 800C đến 900C. B1: 80 B2: 85 B3: 90 Tổng số nghiệm thức:5 x 3 = 15 nghiệm thức. Tổng số mẫu thí nghiệm: 15 x 2 = 30 mẫu. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: A1 A2 A3 A4 A5 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 21 B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 B2 A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2 B3 A1B3 A2B3 A3B3 A4B3 A5B3  Tiến hành thí nghiệm Sơ đồ tiến hành thí nghiệm  Chỉ tiêu theo dõi: xác định lượng đường khử tạo thành. 3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quátrình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.  Mục đích Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tính của enzyme α- amylase thông qua hằng số Km.  Chuẩn bị mẫu - Nếp trắng nghiền nhỏ - Enzyme α-amylase  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố. Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước (1 nếp : 4 nước) Chỉnh pH theo các mức pH khác nhau Nâng nhiệt đến nhiệt độ cần khảo sát rồi bổ sung 0,3% enzyme α-amylase vào dung dịch Giữ mẫu 15 phút Chuẩn đường khử Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 22 Nhân tố C: Nồng độ tinh bột nếp (%) C1: 5 C3: 15 C5: 25 C7: 35 C2: 10 C4: 20 C6: 30 Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 mẫu.  Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:  Chỉ tiêu theo dõi: Xác định lượng đường khử tạo thành CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α- AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG Tài liệu tham khảo cho thấy, khả năng hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào pH và nhiệt độ. Mỗi enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất của Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước theo tỷ lệ đã bố trí Chỉnh pH 6,5 Nâng nhiệt đến 850C rồi bổ sung 0,5% enzyme α-amylase vào dung dịch Giữ mẫu 30 phút Chuẩn đường khử Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 23 nó ở một giá trị pH nhất định và ở một nhiệt độ nhất định.. Chính vì vậy, thí nghiệm này được thực hiện với mục đích là tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α- amylase hoạt động thủy phân tinh bột nếp trắng. Trong thí nghiệm này, enzyme α-amylase được sử dụng với nồng độ là 0,3% và thời gian thủy phân là 15 phút. Dung dịch sau khi thủy phân đem phân tích hàm lượng đường khử. Thí nghiệm đươc tiến hành với hai nhân tố và hai lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 4.1 và hình 4.1. Bảng 4.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α- amylase đối với nguyên liệu nếp trắng pH Nhiệt độ (0C) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Trung bình 80 4,186 4,719 4,815 4,412 4,028 4,431b 85 4,334 5,015 5,058 4,486 4,125 4,604a 90 4,063 4,530 4,678 4,283 3,950 4,283c Trung bình 4,194c 4,754a 4,850a 4,363b 4,034d Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một cột thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê