Luận văn Nghiên cứu ứng dụng Enzyme vào sản xuất rượu vang nếp trắng

lopectin (Nguồn: www.biology.iastate.edu) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 15 Amylopectin tạo thành từ 600-6000 gốc đường glucose, trọng lượng phân tử từ 96120-961000 đơn vị. Tính chất của amylopectin: hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, không tạo màu với iod, không bị tủa với butanol và pentanol. (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006) 2.2.2 Glycogen Glycogen là nguồn năng lượng và nguồn glucid được dự trữ trong cơ thể người và động vật, chúng có lượng lớn trong gan và cơ. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy trong một vài thực vật bậc cao, trong nấm và trong các vi sinh vật. Cấu tạo của glycogen tương tự như amylopectin nhưng số điểm phân nhánh nhiều hơn. Tính chất của glycogen: dễ tan trong nước nóng, cho màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iod, khi thủy phân băng acid hoặc enzyme thu được chủ yếu là glucose, maltose, isomatose. (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006) 2.2.3 Protein  Khái niệm: Protein là hợp chất cao phân tử (hình 2.12), phổ biến rộng rãi trong các tế bào và chiếm 50% trọng lượng khô của tế bào. Khi thủy phân protein ta thu được các acid amin. Protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp “protos” có nghĩa là đầu tiên, quan trọng. Protein được tìm thấy trong mọi thành phần của tế bào, tham gia vào thành phần cấu trúc và chức năng của tế bào. Chúng động vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản, sinh trưởng của vi sinh vật.  Thành phần hóa học: Tất cả các phân tử protein đều chứa các nguyên tố cơ bản: C (50-55%), O (21,5- 23,5%), N (15-18%), H (5,5-7,3%). Ngoài ra, trong thành phần của chúng còn chứa các nguyên tố khác với hàm lượng không đáng kể: P, S, Fe, Zn, Cu, Ca, Mg. (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006) Hình 2.12 Cấu trúc bậc 1 của protein Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 16 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME  Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme (hình 2.13). Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức sau: V = k[E] Trong đó: V : Tốc độ phản ứng k: hằng số tốc độ phản ứng [E] : Nồng độ enzyme Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm  Nồng độ cơ chất Vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất được thể hiện ở hình 2.14. Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn:  Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. E + S ES  Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất 0 Nồng độ enzyme [E] Hình 2.13 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng T ốc đ ộ ph ản ứ ng (V ) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 17  Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.  Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme (hình 2.15). Cũng như các phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein, nó kém bền với nhiệt độ nên tốc độ phản ứng enzyme không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C. Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng, ở khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme khi nhiệt độ tăng lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng 1,4-2 lần. Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động 0 Nhiệt độ V ận tố c củ a en zy m e (V ) Hình 2.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme 0 Km Nồng độ cơ chất Tố c độ p hả n ứn g (V ) Hình 2.14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme 2 1 Vmax Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 18 mạnh nhất ở nhiệt độ 40-500C. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C thì hoạt động của enzyme bị hạn chế mạnh và khi nâng nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH và chất bảo vệ.  pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường (hình 2.16), mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme – cơ chất và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme.Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Đa số enzyme hoat động mạnh ở môi trường acid yếu, kiềm yếu và trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động mạnh ở môi trường kiềm và acid.  Chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng của enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm, người ta chia ra những chất kìm hãm sau : pH V ận tố c củ a en zy m e (v ) pH tối thích Hình 2.16 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 19 Các chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động làm cho cơ chất không có cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và cơ chất làm giảm số lượng của các enzyme kết hợp với cơ chất. Do đó, cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. E + S ES E + P E + I EI Các chất kìm hãm không cạnh tranh: Chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, làm giảm hoạt động xúc tác của enzyme dẫn đến giảm vận tốc phản ứng. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, enzyme vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S ES E + P E + I EI ES + I EIS EI + S EIS Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: Các sản phẩm phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và chất B. Khi đó, sản phẩm P1 và P2 được xem như chất kìm hãm của enzyme. Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho enzyme không hoạt động, khi đó cơ chất thứ hai này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS  Chất hoạt hóa Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 20 Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là:  Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học  Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme  Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động  Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 - 1,65 A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme. 2.4 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN 2.4.1 Khái quát về quá trình lên men rượu Lên men rượu là một quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí.  Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, lên men rượu butylic…  Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men acid acetic, acid citric… Lên men rượu, bia đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men (Yeast). Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Nguời ta còn có thể gọi là quá trình cồn hóa, rượu hóa. Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kì chính:  Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)  Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 21 2.4.2 Cơ chế của quá trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1 ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đuờng lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành. Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C lượng CO2 hòa tan vào nước là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002) 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu:  Nồng độ đường: Nồng độ đường thích hợp nhất của nấm men trong sản xuất rượu vang là 20 – 28%, nếu cao hơn thì năng lực lên men giảm và ngược lại nếu thấp sẽ không tạo được điều kiện cho quá trình lên men. Trên thực tế, ở nồng độ đường 30 – 35% thì sự lên men bị đình chỉ. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 22  Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 – 220C có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 – 450C. Nếu nhịêt độ quá 500C nấm men sẽ chết.  Ảnh hưởng của acid (pH): Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH 3,8 – 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần (thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH 8,0 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.  Ảnh hưởng của nồng độ rượu: Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% đã có ảnh hưởng xấu.  Ảnh hưởng của oxy: Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pasteur” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Tùy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 23 gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển. Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng O2 cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002). 2.4.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men  Sự tạo thành acid: Quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid lactic. Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic, một phân tử bị oxy hoá và phân tử thứ hai sẽ bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic được tạo bởi pyruvate dehydronase theo phản ứng: CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH2CHOHCOOH + NAD Hoặc CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Acid citric theo Laphon được tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng được biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic được biểu diễn như sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 24 Glycerin và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu etanol, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường 2 – 3% so với lượng đưa vào. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và đường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%. Lên men đường xảy ra theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)  Sự tạo thành rượu bậc cao: Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic...Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin. Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2)-COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2. Như vậy, việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau đó mất CO2 và cuối cùng aldehyt bị khử để tạo ra alcol. Bằng con đường tương tự, nhiều acid amin cũng được tạo thành như valine và isoleucine… chúng là tiền đề để tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xảy ra rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho các quá trình khác tiếp theo.  Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác: Sự tạo thành ester Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng. Phương trình tổng quát: R1CH2OH + R2COOH R2COO-CH2R1 + H2O Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 25 Ester etylic có thể được tạo thành do alcol etylic kết hợp với acid acetic. Sự tạo thành sẽ dễ hơn khi các cấu tử tham gia phản ứng là các aldehyde: R1CHO + R2CHO R1COO-CH2R2 Sự tạo thành metanol Trong quá trình nấu nguyên liệu, các chất pectin ester của acid polygalacturonic bị thủy phân tạo thành acid pectic và alcol metylic. Sự tạo thành fufurol Đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccharose, glucose, fructose và một ít maltose được tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt độ cao các đường sẽ bị phân hủy và mất nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin. Đường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol. Sự tạo thành aldehyde Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể được tạo thành qua con đường oxy hóa các loại rượu. Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde. Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. 2.5 PHẢN ỨNG MAILLARD Phản ứng Maillard được biết đến như sự hóa nâu không do enzyme, được báo cáo lần đầu tiên bởi Louis-Camille Maillard, là trong một bài báo cáo ngắn của Viện hàn lâm Pháp vào năm 1912 (Maillard, 1912). Phản ứng Maillard là phản ứng giữa đường khử và hợp chất amin chứa nhóm amin chưa bị ion hóa (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). Phản ứng có thể dẫn tới một số hệ quả sau:  Sự tạo hợp chất màu nâu gọi là melanoidin. Các hợp chất này có chứa hàm lượng nitơ khác nhau và có phân tử lượng cũng như khả năng hòa tan trong nước khác nhau  Tạo hợp chất dễ bay hơi  Tạo vị đắng  Tạo reductone, đó là những chất có tính khử mạnh giúp thực phẩm ổn định trước các tác nhân oxy hóa  Mất các acid amin không thay thế (Cysteine, Methionine) Decarboxyl hóa Acid pyruvic acetaldehyde Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 26  Tạo các hợp chất có khả năng gây ung thư  Sự sinh khí CO2 thường thấy khi tồn trữ ở nhiệt độ cao do sự giảm cấp strecker 2.5.1 Các điều kiện phản ứng  Nhiệt độ Sự gia tăng tốc độ phản ứng hóa nâu đồng thời với việc gia tăng nhiệt độ. Tồn trữ ở nhiệt độ thấp sẽ có lợi hơn trong việc tránh các tiến trình hóa nâu (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008).  pH và chất đệm Chất đệm là chất có khả năng chống lại sự thay đổi pH của môi trường khi tăng [H+] hoặc [OH-]. Vì vậy, vai trò của chất đệm trong sự hóa nâu không do enzyme là làm tăng tốc độ hóa nâu của hệ thống acid amin – đường khử. Trong quá trình phản ứng các sản phẩm có tính acid sinh ra, các chất đệm sẽ kết hợp với các acid đó, giữ môi trường hơi kiềm thích hợp cho các tiến trình hóa nâu.Phản ứng Carbonyl – amin có thể xảy ra trong môi trường acid hay môi trường kiềm mặc dù nó xảy ra trong môi trường kiềm ưu thế hơn. Môi trường acid thường được dùng để ngăn cản phản ứng Maillard (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). Phản ứng hóa nâu của glucose và một số acid amin phụ thuộc vào pH môi trường được thể hiện ở hình 2.17.  Thành phần ẩm Phản ứng xảy ra trong môi trường có nước. Sự làm khô hoàn toàn sẽ làm dừng tiến trình hóa nâu. Tuy nhiên, phản ứng xảy ra cực đại ở trạng thái khá khô và thấp hơn ở trạng thái độ ẩm cao (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). Sự phụ thuộc của phản ứng Maillard vào hoạt độ nước được thể hiện ở hình 2.18 . Hình 2.17 Ảnh hưởng của môi trường lên phản ứng Maillard của D-glucose và các acid amin ở 1210C trong 10 phút (Nguồn: www.landfood.ubc.ca) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm 27 Hình 2.18 cho thấy phản ứng xảy ra nhanh ở giá trị aw trung bình (0,5 – 0,8). Tuy nhiên, hoạt độ nước thích hợp nhất cho hệ thống phản ứng còn tùy thuộc vào các thành phần có trong thực phẩm.  Đường Trong phản ứng Maillard, đường là thành phần cơ bản, nó cung cấp nhóm carbonyl cần thiết để phản ứng với nhóm α – amin tự do. Phản ứng này tự nó không chỉ giới hạn trong các monosaccharide nhưng cũng có thể tiến hành trên các disaccharide khử như: maltose, lactose,...Tuy nhiên các loại đường không khử không thể tham gia cho đến khi nối glycoside bị cắt rời phóng thích thành phần đường khử có khả năng tham gia phản ứng. Trong đó, đường aldopentose hoạt động hơn đường aldohexose. Disaccharide có tính khử ít hơn monosaccharide (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). 2.5.2 Cơ chế phản ứng Phản ứng Maillard là sự kết hợp các chất đường như: aldose, cetose với các amin theo các con đường phức tạp và khác nhau. Sản phẩm ngưng tụ đầu tiên là một base Schiff, sau đó tạo vòng thành chất thế nitơ N- subtituted glycosylamine tham gia vào một chuỗi phản ứng, sắp xếp lại cấu tạo amodori thành một tác chất bị thế nitơ N – subtituted 1