Luận văn Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio Cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4oC - 8oC và đưa ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm trong điều kiện không cần giữ lạnh [4], [20]. Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phòng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm. Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục. * Bảo quản bệnh phẩm Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu). Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 4oC ( nếu chưa được xét nghiệm ngay ). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển [34]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.4.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae Sơ đồ các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae trong phòng thí nghiệm [13]. Hình 2.1. Sơ đồ phân lập chẩn đoán V. cholerae TCBS, Th¹ch KiÒm 370C/ 24 giê TÝnh chÊt sinh ho¸ 370C/3-6 giê Soi T•¬i Pepton kiÒm 370C/3-6 giê TCBS, Th¹ch KiÒm Oxidaza (+) KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); H¬i(-); H2S (-) Mannit (+); di ®éng (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+) Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+) Ng•ng kÕt kh¸ng huyÕt thanh §a gi¸ O1 §a gi¸ O139 §¬n gi¸ Ogawa §¬n gi¸ Inaba 370C/3-6 giê Pepton kiÒm BÖnh phÈm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật soi tƣơi trực tiếp Hòa mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lên lam kính, đậy la men, soi tiêu bản trực tiếp bằng kính hiển vi ( Hình 3.4 ) kết quả cho thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường, soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi ngôi. Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phân và chất nôn của bệnh nhân nhằm phát hiện vi khuẩn di động. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen vi khuẩn tả có một lông ở đầu nên khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngôi. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thực hiện các bước như sau: - Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên. Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi nếu nghi ngờ V. cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiên có một số vi khuẩn đường ruột khác cũng di động khi soi tươi trên kính hiển vi). - Lam kính 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ một giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nhưng không được phù hợp với điều kiện của các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động như sao đổi ngôi. Hình 2.2. Hình vẽ lam kính và la men soi tƣơi bằng kính hiển vi Lam kính Lamen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phương pháp soi tươi trên kính hiển vi nền đen hoặc phản pha dùng để phát hiện tính di động của V. cholerae, đặc biệt khi phân của bệnh nhân chứa >10 5 vi khuẩn/gam phân. Hơn nữa kỹ thuật này còn dùng kết hợp kháng huyết thanh V. cholerrae để ức chế sự di động trên nền khi soi và chỉ trong vòng từ 3 - 5 phút khoảng 50% vi khuẩn V. cholerae bị tụ lại, vì vậy kỹ thuật này có giá trị để chẩn đoán nhanh trong vùng có dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này tùy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên. * Kỹ thuật nhuộm Gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. * Phƣơng pháp dùng kít nhanh Dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với V. cholerae O1 và O139 thành hai băng riêng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo vàng) cặp đôi với kháng thể đơn dòng, cặp đôi này gắn với kháng nguyên của mẫu thử. Hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose và gắn với kháng thể kháng V. cholerae O1 và O139 và hình thành các băng màu đỏ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật nuôi cấy Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua các bước cấy chuyển khác nhau do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại phù hợp với loại vi khuẩn kia, phương pháp nuôi cấy được coi là “tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn có mặt hạn chế là thời gian trả lời kết quả khảng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae nếu bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh. * Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các kỹ thuật khác, ngoài ra áp dụng kỹ thuật PCR để tìm độc tố CT trong thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot. Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000 bp. Đoạn DNA được khếch đại ( DNA đích ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide. Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng [21], [25]. 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá V. cholerae dƣơng tính trong nghiên cứu * Soi tươi : Hình thể nhỏ, di động nhanh trên lam kính; * Nhuộm Gram: Gram âm, hình cong dấu phẩy; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Nuôi cấy: + Trên môi trường pepton kiềm mặn, mọc đục 3-6 h, có váng nổi mặt môi trường; + Trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc nhỏ, trong, tròn, bờ đều, vi khuẩn mọc sau 6-24 giờ; + Trên môi trường thạchTCBS nếu nghi ngờ V. cholerae khuẩn lạc màu vàng, nhỏ, trong, thời gian mọc khuẩn lạc 12 – 24 giờ; + Phản ứng Oxidaza : Dương tính khi chuyển màu xanh tím; + Sinh vật hoá học: Lên men đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza; + Ngưng kết KHT đa giá và đơn giá; * Test nhanh : Xuất hiện 2 vạch là vạch chứng và vạch mẫu thử; * Phương pháp PCR dương tính. CHƢƠNG III Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới tính và lứa tuổi là một trong những đặc điểm được chúng tôi quan tâm kết hợp với yếu tố dịch tễ khi tiến hành lấy mẫu xem khả năng bị mắc bệnh tả ở giới nào hoặc độ tuổi bao nhiêu. Nên trong quá trình tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân, chúng tôi thu thập được một số thông tin về sự phân bố theo giới tính và nhóm tuổi như sau: Bảng 3.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới n X ± SD Trung vị min - max Nữ 164 34,2±14,5 34(24-45) 8 - 67 P> 0,05 Nam 106 31,8±15,5 34(17-44) 5 - 68 Tổng 270 33,3±14,9 34(21-45) 5 - 68 Bảng phân bố đối tượng nghiên cứu ( Bảng 3.1; bảng 3.2; biểu đồ 3.1) cho thấy nhóm tuổi thấp nhất đối với nữ là 8 và đối với nam là 5; độ tuổi cao nhất đối với nữ là 67 đối với nam là 68. Kết quả cho thấy sự khác biệt về tuổi giữa các bệnh nhân nam và nữ không có ý nghĩa thống kê ( P > 0,05 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 18 22 46 79 95 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5-10 Tuổi > 50 Tuổi 11-20 Tuổi 41 - 50 Tuổi 31-40 Tuổi 21-30 Tuổi Số mẫu thu thập tính theo độ tuổi Biểu đồ 3.1. Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu Nghiên cứu của Nguyễn Đăng Hiền và cộng sự (2008 ) cho kết quả trong tổng số 1.808 trẻ em nhập viện do tiêu chảy có tới 1.018 trẻ tiêu chảy cấp do virut Rota và hầu hết các trường hợp này thường xuất hiện chủ yếu trong 3 năm đầu khi trẻ mới sinh [12]. Trong nghiên cứu chúng tôi không đánh giá tác nhân do virut Rota, chỉ tham khảo qua điều trị của thầy thuốc, chủ yếu dựa vào các biểu hiện lâm sàng để loại bỏ nguyên nhân gây tiêu chảy do vi rút nên lứa tuổi 5-10 thu thập được 10 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 3,6 % , Lứa tuổi này có tỷ lệ nghi mắc tả thấp cũng phù hợp với các nghiên cứu khác vì sự biến động của lứa tuổi này không lớn mọi sinh hoạt phụ thuộc gia đình, nếu có thời gian chúng tôi đánh giá thêm tác nhân do virut Rota ở lứa tuổi mới sinh đến 10 tuổi thì ý nghĩa nghiên cứu sẽ mở rộng hơn. Nghiên cứu của M.Ehara và cộng sự (2004) cho rằng nguy cơ mắc bệnh tả của trẻ em dưới 15 tuổi thường tăng vào đầu vụ dịch [55]. Nghiên cứu của Thẩm Chí Mục (1994) cho kết quả ngược lại cho rằng nhóm tuổi này lại tăng vào cuối vụ dịch [28]. Tuy nhiên các kết quả trên cũng chỉ dừng lại đánh giá một vụ dịch nhưng cũng có thể là những gợi mở cho các nghiên cứu tiếp theo trong chương trình phòng chống các bệnh tiêu chảy ở nhóm tuổi này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi Tuổi Số mẫu Tỷ lệ (%) 5 -10 10 3,60 11-20 22 8,15 21 -30 95 35,17 31-40 79 29,15 41-50 46 17,36 >50 18 6,57 Tổng cộng 270 100 Lứa tuổi từ 21- 30 thu thập được 95 mẫu chiếm tỷ lệ 35,17 % lứa tuổi 31- 40 thu thập được 79 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 29,15 % sau đến lứa tuổi 41 – 50 chiếm tỷ lệ 17,36 % ( Bảng 3.2 ). Đây là những lứa tuổi lao động quan trọng trong xã hội và có tỷ lệ mắc tả cao nhất so với các lứa tuổi khác, ở lứa tuổi này có nhiều mối liên quan về yếu tố dịch tễ như đi học, đi công tác, đi làm…và điều đặc biệt sinh hoạt ăn uống ở quán cơm bình dân nên yếu tố vệ sinh không đảm bảo. Nghiên cứu Thẩm Chí Mục (1996) đã đánh giá vai trò của thực phẩm và vệ sinh của người phục vụ kết quả là 28,7 % số mẫu thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh và 20 % mẫu bàn tay nhân viên không đạt tiêu chuẩn [27]. Phan Đạo và cộng sự cho rằng trong thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập được vi khuẩn tả cao trên 50% [9]. Với nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ phân lập dương tính vi khuẩn tả là 5,93 %. Qua điều tra yếu tố dịch tễ của các bệnh nhân trước khi vào viện có 11 bệnh nhân mắc bệnh tả có nguồn lây nhiễm mầm bệnh từ Hà Nội chiếm tỷ lệ 68,75 %. Phải chăng tại tỉnh Thái Nguyên chưa đến điểm đỉnh của vụ dịch mà tỷ lệ mắc bệnh do yếu tố bên ngoài đưa đến sau đó được phát hiện. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phân bố nhóm đối tượng theo giới tính 39.30% 60.70% Nữ Nam Biểu đồ 3.2. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới tính Nhìn chung bệnh tả không phân biệt theo giới tính, mọi người đều có thể mắc bệnh. Nghiên cứu của Vũ Minh Hương và cộng sự (1994 ) cho biết tỷ lệ dương tính ở nữ là 57,88 % và ở nam giới là 42,12 % [16]. Theo nghiên cứu của Dalsgaard A và cộng sự (1997) ở Peru đã xảy ra vụ dịch tả tác nhân do V. cholerae O1 đã có 230 người mắc tiêu chảy cấp trong đó tỷ lệ nữ mắc bệnh là 59,24 % và nam giới mắc bệnh là 40,76 % [54]. Kết quả ( Biểu đồ 3.2) cho thấy tỷ lệ nữ mắc tiêu chảy cấp là 60,7 % và nam 39,3 % cũng phù hợp với nhận xét của các tác giả trên ( Biểu đồ 3.2 ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dƣơng tính V. cholerae theo giới tính Giới tính Mắc tả Tỷ lệ % Nam 9 56,25 Nữ 7 43,75 Tổng 16 100 Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính cho kết quả 9 bệnh nhân nam mắc chiếm tỷ lệ 56,25 % trong khi đó nữ có 7 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 43,75 % ( Bảng 3.3 ) Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc tả, nhưng có tác giả cho rằng ở lứa tuổi trẻ và tuổi cao trên 50 tuổi có tỷ lệ mắc cao [18], [45], nghiên cứu của CDC (2004) nhận xét khi không kiểm soát yếu tố dịch tễ dịch sẽ lan rộng trong cộng đồng lúc đó lứa tuổi từ 26-50 tỷ lệ mắc sẽ thấp hơn so với lứa tuổi từ 1-18 tuổi hoặc tuổi trên 50 [49], phải chăng sức đề kháng của trẻ em và người cao tuổi yếu nên tỷ lệ mắc bệnh cao. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào đưa ra một thang tuổi nhất định có tính chất mẫu về các trường hợp mắc tả. Nhận xét của chúng tôi cũng phù hợp với nhận xét nghiên cứu của Thẩm Chí Mục về đánh giá đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua các vụ dịch ở Nam Hà tỷ lệ nam giới chiếm tỷ lệ 54,38 % [27]. 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh nhân theo địa điểm lấy mẫu Các mẫu trong nghiên cứu được thu thập là lấy mẫu phân của những bệnh nhân đến điều trị tại 6 khoa lây của bệnh viện trên địa bàn tỉnh với tiêu chuẩn lựa chọn là những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp, với các triệu chứng lâm sàng điển hình nghi mắc tả, không sốt. Kết quả được trình bày tại ( Bảng 3.4 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.4. Tỷ lệ thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu Mã hóa Địa điểm lấy mẫu Tỷ lệ (%) BV1 Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 45,19 BV2 Bệnh viện Đa khoa huyện Đồng Hỷ 14,07 BV3 Bệnh viện C 12,59 BV4 Bệnh viện A 10,74 BV5 Bệnh viện Đa khoa huyện Đại Từ 8,89 BV6 Bệnh viện Đa khoa huyện Định Hóa 8,52 Tổng: 100 Trên 6 bệnh viện lấy mẫu cho thấy: BV1 là bệnh viện trực thuộc Trung ương nằm trung tâm tỉnh Thái Nguyên, Thành phố Thái Nguyên có diện tích 177 km 2, dân số 294.759 người với một trường Đại học Thái Nguyên gồm 6 trường Đại học thành viên và hơn 20 trường trung cấp, cao đẳng, số giường bệnh trên 500 giường do vậy số bệnh nhân nhân nghi mắc tả cũng chiếm tỷ lệ cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy số bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi tả ở BV1 chiếm tỷ lệ cao nhất 45,19 %. Ngược lại ở BV6 là huyện Định Hóa số mắc tiêu chảy cấp nghi tả chiếm tỷ lệ thấp 8,52 % điều này cũng phù hợp với tình hình mắc chung vì huyện Định Hóa cách trung tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên tỉnh Thái Nguyên 50 km, có diện tích rộng 520,75 km2 với dân số 90.000 người, số giường bệnh trên 200, phải chăng với diện tích rộng mật độ dân cư thưa yếu tố dịch tễ không nhiều nên khả năng lây nhiễm cũng giảm. 122 38 34 29 24 23 0 20 40 60 80 100 120 140 Số luợng BV1 BV2 BV3 BV4 BV5 BV6 Khu vực nghiên cứu Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa điểm lấy mẫu Biểu đồ 3.3. Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình nghiên cứu Kết quả (Biểu đồ 3.3 ) cho thấy tại BV1 thu thập được mẫu của 122 bệnh nhân, các bệnh viện còn lại thu thập được từ 23 – 38 bệnh nhân. 3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện V. cholerae 3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tƣơi Đây là tiêu chí để đánh giá các phương pháp trong quá trình nghiên cứu, việc phát hiện vi khuẩn tả di động trên kính hiển vi nền đen đã được áp dụng từ lâu, tuy nhiên nhiều phòng thí nghiệm không có kính hiển vi nền đen để thực hiện phương pháp này. Với lý do đó chúng tôi đã trực tiếp soi tươi tìm vi khuẩn trên kính hiển vi thường để xem tính chất di động. Bảng 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Soi tƣơi n % Di động 28 10,37 Không di động 242 89,63 Tổng 270 100 Vi khuẩn di động quan sát được trên lam kính khi soi trên kính hiển vi, đây là kỹ thuật thực hiện đầu tiên trong quá trình phân tích, có ý nghĩa đánh giá định hướng ban đầu. Kỹ thuật này tuy đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm cũng như kỹ năng thực hành. Nghiên cứu của chúng tôi khi quan sát soi kính cho thấy vi khuẩn di động ( Hình 3.4 ) là 28 mẫu trên 270 mẫu thu thập chiếm tỷ lệ 10,37% ( Bảng 3.5 ). Như vậy nếu thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi mẫu ngay tại cơ sở sẽ giúp cho thầy thuốc có hướng điều trị. Thực hiện một kỹ thuật đơn giản kết hợp với tập huấn kỹ thuật hàng năm chúng tôi nghĩ rằng các kỹ thuật viên sẽ thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi. Hình 3.4. Hình thể V. cholerae soi tƣơi 3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.5. Hình thể vi khuẩn V. cholerae nhuộm Gram Bảng 3.6. Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dƣới kính hiển vi Nhuộm Gram n Tỷ lệ % Gram âm 45 16,66 Gram dƣơng 225 94,44 Tổng 270 100 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 45 mẫu bắt màu Gram âm chiếm tỷ lệ 16,66% ( Bảng 3.6 ), kỹ thuật nhuộm cho kết quả nhanh, đơn giản, thực tế đã góp phần đáng kể trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn tả ngay tại cơ sở. Kỹ thuật nhuộm soi là nhận biết Gram âm nhưng kết hợp nhận biết hình thể là mảnh cong, không có vỏ, điều đặc biệt dễ nhận biết là có hình dấu phẩy thì khả năng phát hiện sẽ cao hơn, kỹ thuật nhuộm soi được dùng để sàng lọc có hướng điều trị kịp thời sau đó vẫn phải chẩn đoán khảng định bằng phương pháp nuôi cấy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.2.3. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy Quá trình nhận biết khuẩn lạc và xác định rõ vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy là rất cần thiết, kết quả nghiên cứu thể hiện ( Bảng 3.7 ) Bảng 3.7. Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn Các loại vi sinh vật Nuôi cấy Số mẫu (+) / 270 mẫu Tỷ lệ (%) V. cholerae O1 16 5,92 E. coli 47 17,40 N.A.G 4 1,49 Nghiên cứu của tác giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xã của huyện Từ Liêm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tính của các loại vi khuẩn gây tiêu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất hiện khi các căn nguyên khác phát triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đó xuất hiện các căn nguyên khác. Nghiên cứu của Lê Lan Hương và cộng sự (1995) đã nghiên cứu trên 121 mẫu phân bệnh nhân có 32 mẫu dương tính với một số vi khuẩn gây tiêu chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 % [15], kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Thế Trâm và cộng sự (1985) tại phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tính đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy là 11,34% [42]. Còn tại các bệnh viện có ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyên Hải miền Trung qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê với 5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tính với 4 tác nhân gây bệnh là 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đánh giá nghiên cứu của chúng tôi về phân lập các loại vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mẫu phân ở bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi mắc tả trên 270 mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 có 16 mẫu dương tính, với vi khuẩn E. coli có 47 mẫu dương tính, các phẩy khuẩn không phải vi khuẩn tả (N.A.G) có 4 mẫu, trong nghiên cứu chúng tôi các vi khuẩn gây tiêu chảy có tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương với các công bố của các tác giả khác. Ngoài ra có một số loaị vi khuẩn khác nhưng vì điều kiện và thời gian ngắn nên chúng tôi chưa đánh giá hết được. Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật nuôi cấy Kết quả Nuôi cấy Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 Tổng 270 100 Tỷ lệ V. cholerae O1 phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả 16 mẫu dương tính trên 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ thuật này cho kết quả rất chính xác nhưng phải qua nhiều bước khác nhau, đặc biệt phải có phòng xét nghiệm vi sinh hợp lý đúng tiêu chuẩn, đủ môi trường nuôi cấy, cán bộ xét nghiệm phải có kinh nghiệm phán đoán để có các hướng cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khâu cuối cùng của kỹ thuật là khẳng định bằng ngưng kết kháng huyết thanh đa giá, đơn giá trước khi kết luận. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tỷ lệ phát hiện dương tính V.cholerae O1bằng kỹ thuật nuôi cấy 5.93% 94.07% Âm tính Dương tính Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ dƣơng tính V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy được coi là " tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn còn mặt hạn chế đó là thời gian trả lời kết quả khẳng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh. Kỹ thuật nuôi cấy đã chọn lọc được khuẩn lạc thuần khiết và đặc hiệu ngoài kinh nghiệm của cán bộ xét nghiệm thì yếu tố môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, môi trường phải đảm bảo chất lượng. Trên môi trường thạch kiềm rất tốt cho sự phát triển của V. cholerae nhưng ngược lại các loại vi khuẩn khác lại không phù hợp do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại tốt với loại vi khuẩn khác. Môi trường thạch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là môi trường chọn lọc tốt nhất để phân lập V. cholerae và được dùng rộng rãi trên thị trường, môi trường đã được thương mại hoá đông khô nên dễ pha chế, môi trường có màu xanh sau khi pha chế nhưng chỉ lưu giữ được một thời gian ngắn (3 - 5 ngày ) những khuẩn lạc mọc trên môi trường này không thích hợp cho phản ứng ngưng kết với phản ứng kháng huyết thanh, khuẩn lạc nghi ngờ mọc sau 12 giờ có khuẩn lạc tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng do lên men đường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên saccharose, những vi khuẩn không lên men saccharose có khuẩn lạc màu xanh lơ có thể là V. parahaemolyticus, khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae cần phải cấy trên các môi trường ít chất ức chế như thạch thường, môi trường KIA. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá, các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt V. cholerae. Bảng 3.9. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng TCBS Kích thƣớc khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc n Tỷ lệ % nhỏ 2-3 mm vàng, bóng 67 24,81 nhỏ 1-3 mm không màu 203 75,19 Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả 67 mẫu có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS chiếm tỷ lệ 24,81 % ( Bảng 3.9 ). Môi trường TCBS ( Hình 3.7 ) là môi trường chọn lọc rất tốt trong việc phân lập V. cholerae tuy nhiên khuẩn lạc này không trực tiếp thực hiện phản ứng Oxidase tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc V. parahemoliticus và V. cholerae O1 Hình 3.8. Khuẩn lạc V. cholerae trên môi trƣờng thạch kiềm * Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm: Là môi trường thạch thường nhưng có pH kiềm ( pH = 9 ) thích hợp cho V. cholerae phát triển, khuẩn lạc V. cholerae nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase. Bảng 3.10. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm Kích thƣớc Màu sắc khuẩn n Tỷ lệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệ