MỤC LỤC
Lời c ảm ơn
Mục lục
Danh mục các b ảng . . .i
Danh mục các hình . . .ii
Kí hiệu, chữ viết tắt . . .iii
Đặt v ấn đề . . .1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU .3
1.1. Tình hình nghiên c ứu trên thế gi ớ i. 3
1.2. Tình hình nghiên c ứu ở trong nước .6
Chương 2. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU .10
2.1. Đi ều ki ện tự nhiên khu vực nghiên cứu .10
2.2. Đị a hình, thổ nhưỡng. .10
2.3. Khí hậu thuỷ văn.10
2.4. Đi ều ki ện kinh tế - xã hộ i.11
2.4.1. Đi ều ki ện kinh tế. . 11
2.4.2. Đi ều ki ện xã hộ i. 13
Chương 3. MỤC TIÊU - ĐỐI TưỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐI ỂM - NỘI
DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.14
3.1. M ục tiêu nghiên c ứu 14
3.2. Đị a đi ểm nghiên cứu 14
3.2.2. Thời gian nghiên c ứu 14
3.2.3. Đối tượng nghiên cứu 14
3.3. Nội dung nghiên c ứu 15
3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
hưởng của bệnh đối v ới keo lai tại khu vực nghiên cứu. 15
3.3.2. Phân l ập các chủng vi khuẩn nội sin h ở cây keo lai theo các c ấ p bệnh.15
3.3.3. Thử hi ệu l ực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được. . .15
3.3.4. Đánh giá mố i quan hệ gi ữa vi khuẩn nộ i sinh vớ i cây chủ ở các cấp bị
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế. 15
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai. 15
3.4. Phương pháp nghiên c ứu. 16
3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
hưởng của bệnh đối v ới keo lai tại khu vực nghiên cứu. 16
3.4.2. Phân l ập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các c ấp bệnh .23
3.4.3. Thử hi ệu l ực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được. .25
3.4.4. Đánh giá mố i quan hệ gi ữa vi khuẩn nộ i sinh vớ i cây chủ ở các cấp bị
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế. 26
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai. . 27
Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.31
4.1. Xác đị nh nấm gây bệnh khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hưởng của
bệnh đối v ới keo lai tại khu vực nghiên cứu.31
4.1.1. Tri ệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai. 31
4.1.2. Kết quả phân l ập nấm bệnh .32
4.1.3. Kết quả thí nghi ệm gây bệnh nhân tạo .33
4.1.4. Giám đ ịnh nguyên nhân gây b ệnh. 34
4.1.5. Sự sinh trưở ng của hệ sợi n ấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi
trường dinh dưỡng PDA. .36
4.1.6. Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối v ớ i keo lai t ại khu vực nghiên cứu.3 6
4.2. Phân l ập các chủng vi khuẩn nộ i sinh ở cây keo lai theo các c ấp hại 38
4.3. Thử hiệu l ực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được .40
4.3.1. Xác đị nh cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật đ ộ vi khuẩn nội sinh .40
4.3.2. M ật đ ộ tế bào của các chủng vi khuẩn có hi ệu l ực cao .42
4.3.3. Một số đặc đi ểm sinh học của các chủng vi khuẩn có hi ệu l ực cao .42
4.4. Đánh giá mố i quan hệ gi ữa vi khuẩn nội sinh vớ i cây chủ ở các cấp bị bệnh
khác nhau để tìm hiểu về cơ chế 47
4.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai .48
4.5.1. Nhân sinh khố i s ản xuất c hế phẩm .48
4.5.2. Hi ệu lực kháng nấm bệnh của khuẩn nộ i sinh trong phòng thí nghi ệm .49
4.5.3. Thử nghi ệm hi ệu lực của vi khuẩn nộ i sinh trong giai đo ạn vườn ươm .52
4.5.4. Ảnh hưở ng của vi khuẩn nội sinh đ ến cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1 tuổi). .56
Chương 5. K ẾT LUẬN - TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 60
5.1. Kết luận 60
5.2. Tồn tại và kiến nghị .62
TÀI LI ỆU THAM KHẢO.63
86 trang |
Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 1854 | Lượt tải: 4
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai (Acacia auri culiformis x Acacia mangium ) do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại Lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm
Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh
Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh
Cấp 2: > 10 - 20% diện tích lá bị bệnh
Cấp 3: > 20 - 30% diện tích lá bị bệnh
Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh.
- Tính mức độ bị bệnh chung cho mỗi chủng khuẩn.
R = 1
.
.
i
ni vi
N V
x100% [3.02]
Trong đó: R: Là mức độ bị bệnh (Severity of attack)
ni: Là số cây bị bệnh theo cấp bệnh i.
vi: Là chỉ số của cấp bệnh i.
n: Là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn.
V = 4.
- Mức độ bị bệnh của toàn khu vực điều tra được tính theo công thức:
Rtb = Ri
n
[3.03]
Trong đó: Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra.
Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn.
n là tổng số ô tiêu chuẩn.
- Chỉ số tổn thất được xác định thông qua công thức sau:
DI (%) = R% x P% [3.04]
Trong đó:
R (%) mức độ bị bệnh
P (%) tỷ lệ bị bệnh
Căn cứ vào trị số DI xác định được biện pháp phòng trừ:
DI < 0,1 không cần phun thuốc phòng trừ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
0,1 ≤ DI < 0,25 cần loại bỏ lá, thân cành bệnh và phun
thuốc phòng trừ
0,25 ≤ DI < 0,5 cần cắt bỏ lá và thân cành bệnh, loại bỏ
cây bệnh nặng và phun thuốc phòng trừ
DI ≥ 0,5 chặt bỏ cây bệnh
3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh
Trên các khu rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Thanh Sơn,
Phú Thọ tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4.
Ở mỗi cấp bệnh khác nhau cần phải chọn ra 3 cây đặc trưng và tiêu biểu,
mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1 - 1,5 cm. Các cành được chọn
có vị trí cành ít được chiếu sáng và đánh ký hiệu riêng cho từng cành.
Phƣơng pháp phân lập
Bƣớc 1: Chuẩn bị dụng cụ
Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khô bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi
hấp khử trùng ở 121
0
C tương đương với áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút.
Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 110
0
C để qua đêm.
Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng
Để phân lập vi khuẩn nội sinh cần chuẩn bị một số loại môi trường sau:
Môi trƣờng PBS:
NaCl : 8,5 gam
KH2PO4 : 6,8 gam
NaOH : 1,16 gam
Nước cất : 1000 ml
Điều chỉnh pH : 7
Sau khi pha được môi trường cho vào các ống nghiệm, các ống nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống
nghiệm là 9ml: hấp khử trùng ở 121
0
C trong thời gian 30 phút .
Môi trƣờng PDA:
Khoai tây : 200 gam
D-Glucose : 20 gam
Agar : 15-18 gam
Nước cất :1000ml
Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi
và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau
đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác
500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử
trùng ở môi trường 121
0
C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Môi trƣờng nƣớc cất
Rửa sạch các ống nghệm cho 9 ml nước vào các ống nghiệm nút bông vào
miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy. Cho vào nồi hấp khử trùng ở môi
trường 121
0
C (tương đương với 1atm) trong 30 phút.
Bƣớc 3: Cắt mẫu
Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử
trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành
các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí : phần vỏ (Bark) ký hiệu là
B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X.
Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa
môi trường PBS nút bông và b ịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm. Nếu
phần tượng tầng của mẫu bệnh quá ít ta có thể lấy 0,5 gam của phần tượng tầng
cho vào ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
Bƣớc 4: Phân lập vi khuẩn nội sinh
Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn. Dùng pipet lấy
0,1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt
thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy vi khuẩn
trong tủ định ôn với nhiệt độ 28
0
C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm
số lượng vi khuẩn có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc
điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha
loãng đến 10
5
, 10
6
. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi khuẩn khác nhau rồi cho
ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại vi khuẩn),
mỗi chủng cấy 2 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt.
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và đánh giá khả năng sinh trưởng của
vi khuẩn, mô tả đặc điểm của vi khuẩn khi nó được tách ra.
Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại vi khuẩn khác
nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm.
3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân
lập đƣợc
3.4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi
khuẩn nội sinh
- Xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh
Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh ở 3
góc của hộp lồng và cuốn kín hộp lồng rồi ghi rõ ngày tháng trên nắp hộp lồng
giữ mẫu ở tủ định ôn.
Sau 5 - 7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm
gây bệnh trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế.
Công thức đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh
được tính bằng công thức:
V (mm) = D (mm) - d (mm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26
Trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế.
D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng
đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh.
d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai
chiều vuông góc.
Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm
gây bệnh loét thân cành keo lai. Trị số V càng lớn, chủng vi khuẩn càng có hiệu
lực mạnh. Những chủng khuẩn có hiệu lực đường kính trung bình vòng ức chế
(V ≥ 20 mm).
- Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao
Lấy 1ml dung d ịch khuẩn của các chủng có hiệu lực kháng nấm cao pha
loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Lấy 0,1 ml d ịch khuẩn đã pha loãng trang trên các hộp lồng chứa môi
trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28
0
C
trong 48 giờ.
Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml. Từ
đó làm cơ sở cho việc xác định mật độ tối ưu để phòng trừ bệnh.
3.4.3.2. Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực
Mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước, các chủng khuẩn (bào tử và các thể
quả). Khả năng sinh trưởng, phát triển của từng loại khuẩn trên môi trường
PDA, khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn có hiệu lực.
3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế
Thu thập mẫu bệnh theo các cấp độ bị bệnh khác nhau.
Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội
sinh.
So sánh và đánh giá hiệu lực các chủng khuẩn, mật độ khuẩn đối với các
cây ở các cấp độ bệnh khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô
cành ngọn keo lai
3.4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm
Chuẩn bị môi trường PD để nhân sinh khối vi khuẩn sản xuất chế phẩm
theo Nguyễn Lân Dũng (2002) [7].
Thành phần gồm:
Khoai tây: 200 gam
D- Glucose: 20 gam
Nước : 1000 ml
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho
vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho
thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho
vào mỗi bình tam giác nút bông và quấn giấy ở miệng bình. Hấp khử trùng ở
121
o
C trong thời gian 20 phút.
Sau khi hấp khử trùng để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng
các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn.
Lấy từng loại chủng có hiệu lực, dùng que cấy khuẩn khử trùng lấy từng
loại khuẩn cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 3 - 5 lần để đảm bảo
lượng khuẩn đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông lại và ghi rõ ký hiệu
của từng loại.
Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 28
o
C trong 24
giờ, 48 giờ và 72 giờ.
Sau khi lấy các bình đã lắc, lấy ở mỗi loại ra một ít làm mẫu đếm số bào
tử hữu hiệu bằng cách: lấy 1ml dịch khuẩn pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp
khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Lấy 1ml d ịch khuẩn đã pha loãng trên các hộp lồng chứa môi trường
PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28
0
C
trong 48 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ ml.
Từ đó biết được loại khuẩn nào sinh trưởng nhanh trên môi trường nuôi cấy
thuần khiết.
3.4.5.2. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh trong phòng thí nghiệm
Phương pháp thí nghiệm: Lấy cành, lá non không bị bệnh lần lượt nhúng
vào các cốc đựng dung dịch khuẩn trong vòng 30 phút, công thức đối chứng
không nhúng mỗi một công thức có 3 hộp lồng.
Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA
bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc
nước vô trùng tới khi mật độ đạt khoảng 1.10
6
tế bào/ml. Rồi tiến hành nhúng
các mẫu lá keo nhiễm khuẩn vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp
lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi và
đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức.
Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm
Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh
Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh
Cấp 2: >10 - 20% diện tích lá bị bệnh
Cấp 3: >20 - 30% diện tích lá bị bệnh
Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh.
- Tính mức độ bị bệnh trung bình cho mỗi chủng khuẩn theo công thức
Rtb =
n
Ri
[3.05]
Ri là tổng các cấp hại của một chủng khuẩn
n là số mẫu thí nghiệm
3.4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ngoài vƣờn ƣơm
Thử nghiệm với 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao trong phòng thí nghiệm,
mỗi chủng khuẩn được tiến hành với 4 công thức ở các nồng độ khác nhau và 1
công thức đối chứng, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp.
Công thức 1: tiêm 05 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
Công thức 2: tiêm 10 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 3: tiêm 15 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 4: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 5: tiêm 10 ml nước cất vô trùng
Sau 2 tuần phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung
dịch nấm gây bệnh có mật độ 10
5
tế bào/1 ml. Theo dõi sau một thời gian đánh
giá mức độ bị bệnh theo công thức [3.02] và sinh trưởng của cây keo lai như
chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính cổ rễ (Dg) ...
3.4.5.4. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ở rừng non keo lai 1 tuổi
Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm nghiệp
Việt Nam với 5 công thức, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi
trong vòng 60 ngày.
Công thức 1: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 2: tiêm 30 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 3: tiêm 40 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 4: tiêm 50 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10
5
tế bào/1ml
Công thức 5: tiêm 20 ml nước cất vô trùng
Sau 4 tuần nhiễm vi khuẩn nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở
các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 10
5
tế bào/1ml. Sau 4
tuần đánh giá mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm.
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng
tươi, khối lượng khô) của cây keo lai ở các công thức thí nghiệm.
3.4.5.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở
vƣờn ƣơm
Tiến hành đo Hvn, Dg ở tất cả các cây có trong công thức sau đó tính
toán và xử lý số liệu trên Excel để lấy các giá trị trung bình của lần lượt từng
công thức và so sánh với công thức đối chứng. Tìm ra những chủng khuẩn có tác
dụng cho sự sinh trưởng của cây keo lai trong giai đoạn vườn ươm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30
3.4.6.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở
giai đoạn rừng non (1 tuổi)
Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm Nghiệp
Việt Nam (Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội) với số lượng 30 cây cho mỗi công
thức.
- Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 cây có
trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Exel 7.0.
- Thu 30 cây keo lai một năm tuổi gồm (rễ, thân, cành, lá) ở lần lượt từng
công thức đem cân các bộ phận ngay tại chỗ được sinh khối tươi.
Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 75
0
C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ.
Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu
sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô
của mẫu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
Chương 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành
ngọn keo lai
Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai mới đầu trên lá keo thấy xuất hiện những vết
đốm nhỏ màu nâu hoặc đen trên lá sau đó chúng lan dần ra gây khô cành ngọn
những cây bị nặng dẫn đến chết. Trên mặt vỏ xuất hiện các đoạn đen nứt dọc. Chỗ
vết bệnh thường xuất hiện các sợi nấm dọc tạo ra các vân đen. Cành bị bệnh
thường có màu sắc không tươi như màu của cây khoẻ (Hình 4.01).
Hình 4.01: Thân cành keo lai bị bệnh
Khi bệnh nặng, vỏ khô dần, co thắt, nhăn nheo, mô vỏ bị bệnh thối mềm
làm lá và cả ngọn cây bị héo (Hình 4.02).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
32
Hình 4.02: Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành ngọn
4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh
Để ẩm cành bị bệnh từ 3 - 5 ngày và trên kính hiển vi quang học ta thấy
thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam.
Hình 4.03: Thể quả nấm gây bệnh
Dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên
cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi
trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản ở
nhiệt độ 28
0
C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc,
cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
Hình 4.04: Sự sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường PDA
4.1.3. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Để xác định chủng nấm phân lập được từ tổ chức bị bệnh có đúng là nấm
gây bệnh hay không tiến hành thí nghiệm gây bệnh nhân tạo bằng cách nhúng lá
non keo lai vào nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Theo dõi
trong vòng 7 ngày sau đó đánh giá mức độ bị bệnh ở các cấp nặng, nhẹ khác
nhau, phân cấp mức độ bị hại theo diện tích của lá bị bệnh. Kết quả thí nghiệm
gây bệnh nhân tạo được ghi ở Bảng 4.01.
Bảng 4.01: Kết quả gây bệnh nhân tạo lá keo lai
Thời gian quan sát Cấp bệnh (R%) Đối chứng
Sau 1 ngày 7,50 0
Sau 2 ngày 25,00 0
Sau 3 ngày 45,00 0
Sau 4 ngày 50,00 0
Sau 5 ngày 62,50 0
Sau 6 ngày 81,25 0
Sau 7 ngày 93,75 0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
Từ Bảng 4.01 cho thấy chủng nấm phân lập được gây bệnh cho lá, cành
non keo lai. Sau 7 ngày toàn bộ các lá keo ở công thức gây bệnh có mức độ bị
bệnh là 93,75% trong khi đó đối chứng không bị bệnh (Hình 4.05).
Hình 4.05: Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh
Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử
quan sát trên kính hiển vi tham khảo đối chiếu với các tài liệu phân loại nấm của
các tác giả Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. 1980, Nấm gây
bệnh cho keo lai được xác định là loài nấm Colletotrichum gloeosporioides
(Penz.) Sacc.
Nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai có hai giai đoạn sinh sản
trong vòng đời, giai đoạn hữu tính và giai đoạn vô tính.
Giai đoạn vô tính (Anamorph): Bào tử phân sinh hình bầu dục hay hình hạt
gạo thuôn dài đơn bào không mầu, sau khi thành thục có mầu nâu. Bào tử không có
vách ngăn nhưng đặc biệt là ở trước giai đoạn nẩy mầm bào tử thường có một vách
ngăn ngang hình thành hai tế bào có mầu nâu, bào tử có chiều dài từ 11,87 m -
16,38 m, chiều rộng 3,26 - 4,78 m. Vỏ bào tử dạng đĩa có mầu nâu nhạt, nằm rải
rác dưới vỏ cây, sau đó màng lộ ra ngoài mầu nâu đen khi chín nứt ra và bào tử bay
ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm thực hiện quá trình xâm nhiễm mới trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
mùa sinh trưởng, đĩa bào tử có kích thước chiều dài 121,5 - 182,7 m, và chiều rộng
2 - 53,6 m. Bên trong của đĩa bào tử có cuống bào tử mọc ra trên đó, cuống bào tử
không mầu đơn bào, có kích thước chiều dài 101,8 và chiều rộng 4,1 - 6,3 m.
Bào tử
Bào tử nẩy
mầm
Hinh 4.06: Bào tử vô tính của nấm gây bệnh
+ Giai đoạn vô tính (Anamorph)
Tên loài : Nấm đĩa gai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
Thuộc chi nấm bào tử đĩa gai: Colletotrichum
Họ nấm đĩa : Melanconiaceae
Bộ nấm đĩa: Melanconiales.
Ngành phụ nấm bất toàn: Deuteromycetes
Ngành nấm thật: Eumycota
+ Giai đoạn hữu tính (Teleomorph)
Giai đoạn hữu tính (Teleomorph), quan sát trên kính hiển vi cho thấy bào
tử túi đơn bào hình bầu dục. Vỏ bào tử dạng túi, vỏ túi hình cầu mọc đơn hoặc
cụm dưới vỏ cây. Bên trong vỏ túi có nhiều túi bào tử và sợi bên, túi bào tử
không mầu dạng que có đỉnh tròn. Đối chiếu với chuyên khảo nấm túi của
Richard T. Hanlin 1990, nấm túi được xác định là:
Tên loài : Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld.& Schrenk.
Chi: Glomerella Spald. & H. Schrenk.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
Họ: Phyllachoraceae
Bộ: Phyllachorales
Lớp: Sordariomycetes
Ngành phụ: Pezizomycotina
Ngành nấm túi: Ascomycota
4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm bệnh theo thời gian khi nuôi trên môi
truờng dinh dưỡng PDA được trình bày ở Bảng 4.02.
Bảng 4.02: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường PDA.
Chi tiêu
Thời gian
Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ
Đường kính khuẩn lạc
(mm)
8,35
18,30 23,19
Từ Bảng 4.02 cho thấy loài nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
Sacc. mọc khá nhanh trên môi trường dinh dưỡng PDA. Sau 24 giờ đầu nấm
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. sinh trưởng bình thường với tốc
độ sinh trưởng bình quân đạt 347,9 µm/giờ đến 48 giờ tiếp theo nấm sinh trưởng
rất nhanh (381,25 µm/giờ) tốc độ sinh trưởng bắt đầu giảm từ giờ 49 trở đi tốc
độ sinh trưởng bình quân của sợi nấm 322 µm/giờ.
4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai đã dẫn đến vỏ của thân cây bị thối,
mất dần khả năng dẫn truyền dinh dưỡng nuôi cây, làm tán cây bị héo dần và
chết từ ngọn xuống (Die Back). Bệnh gây hại trên nhiều loài keo ở các nước ôn
đới và nhiệt đới. Bệnh hại, gây cho cây bị đốm lá, khô cành ngọn làm giảm khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
năng sinh trưởng phát triển của cây. Ở nước ta bệnh phân bố chủ yếu ở các tỉnh
Tuyên Quang, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Vĩnh Phúc, Hà Tây (cũ), Sơn La,
Lâm Đồng, Kon Tum, Thừa Thiên Huế,…Bệnh hại đã gây tổn thất rất lớn về giá
trị kinh tế và môi trường sinh thái. Dịch bệnh có khả năng bùng phát gây chết
hàng loạt rừng trồng trên diện rộng, làm cho ngọn và lá cây bị biến mầu sau đó
khô héo, lá rụng, cành khô chết từ trên ngọn xuống, tạo điều kiện cho mối mọt
tấn công phá hại, làm giảm sinh trưởng của cây, gây cho cây có nhiều khuyết tật,
sản lượng thấp, phẩm chất kém, giá trị thành phẩm giảm.
Tại Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ, đã điều tra
đánh giá thực trạng tình hình bệnh tại 4 khu vực nghiên cứu. Kết quả về tỷ lệ bị
bệnh, mức độ bị bệnh và chỉ số tổn thất được trình bày ở Bảng 4.03.
Bảng 4.03: Ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai ở Lâm trường Tam Thắng
huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ
Chỉ tiêu
Địa điểm
Mức độ bị hại
(R%)
Tỷ lệ bị hại (P%)
Chỉ số tổn thất
(DI)
Xã Yên Sơn 38,41 55,85 0,215
Xã Tinh Nhuệ 16,70 31,03 0,052
Xã Tinh Nhuệ 47,20 63,71 0,301
Xã Lương Nha
14,10 26,08 0,037
Trung bình 29,10 44,17 0,129
Từ Bảng 4.03 ta thấy mức độ bị hại và tỷ lệ bị hại trung bình của rừng
trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng là 44,17%, mức độ bị hại trung bình
29,10%, chỉ số tổn thất là DI = 0,129 nằm trong khoảng (0,1 ≤ DI < 0,25) cần
loại bỏ lá, thân cành bị bệnh và phun thuốc phòng trừ.
Chứng tỏ diện tích rừng trồng keo lai của Lâm trường bị bệnh nặng dẫn
đến tổn thất rất lớn về mặt kinh tế.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp hại
Với 15 mẫu keo lai ở các cấp bị hại từ 0 đến 4, mỗi cấp 3 mẫu đã tiến
hành phân lập được 30 chủng vi khuẩn nội sinh khác nhau. Các chủng vi
khuẩn này được thống kê theo cấp bị hại và ở các vị trí phân lập, được trình
bày ở Bảng 4.04.
Bảng 4.04: Số lượng chủng khuẩn ở các mức độ bị bệnh
STT Mức độ bị bệnh Số lượng Chủng vi khuẩn
1
Cây khoẻ, không
bị bệnh
10
B01, B02, B03, B1.3
P01, P1.3, P2.2
X01, X02, X2.2
2 Hại nhẹ 9
B01, B03, B1.2, B1.3
P1.1, P1.3, P2.2
X1.1, X02
3 Hại trung bình 5
B1.3, B3.1
P2.1
X1.1, X02
4 Hại nặng 4
B1.3, B3.1
P3.1
X3.1
5 Hại rất nặng 2
B4.1
P4.1
Qua Bảng 4.04 ta thấy 15 mẫu cành keo lai được lấy ở các cây có các cấp bệnh
từ 0 đến 4 đã phân lập được tất cả 30 chủng khuẩn trong đó có 20 chủng vi khuẩn khác
nhau. Ký hiệu của các chủng vi khuẩn là: B01, B02, B03, B1.3, B4.1, B3.1, B1.2,
P01, P1.3, P2.2, P1.1, P3.1, P4.1, P2.1, X01, X02, X2.2, X1.1, X3.1, X1.3.
Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng vi khuẩn trong đó ở phần
vỏ phân lập được 4 chủng B01, B02, B03, B1.3. phần tượng tầng 3 chủng P01,
P1.3, P2.2 và phần gỗ phân lập được 3 chủng vi khuẩn X01, X02, X2.2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39
Cấp bị bệnh 1 (cây bị hại nhẹ): phân lập được 9 chủng khuẩn trong đó ở phần vỏ phân
lập được 4 chủng là B01, B03, B1.2, B1.3, phần tượng tầng 3 chủng P1.1, P1.3, P2.2 và
phần gỗ phân lập được 2 chủng X1.1, X02 vi khuẩn.
Cấp bị bệnh 2 (cây bị hại trung bình): phân lập được 5 chủng vi khuẩn trong đó ở
phần vỏ phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1
phần tượng tầng phân lập được 1 chủng P2.1 và phần gỗ phân lập được 2 chủng vi
khuẩn X1.1, X02
Cấp bị bệnh 3 (cây bị hại nặng): phân lập được 4 chủng vi khuẩn trong đó ở phần vỏ
phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1,
phần tượng tầng phân lập được 1 chủng và phần gỗ phân lập được 1 chủng vi
khuẩn.
- Cấp bị bệnh 4 (cây bị hại rất nặng): phân lập được 1 chủng vi khuẩn ở phần vỏ
và 1 chủng khuẩn ở phần tượng tầng.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy: Vi khuẩn phân bố trong cây chủ ở các bộ
phận của cây khác nhau: Các chủng vi khuẩn ở cây keo lai thường tập trung ở phần vỏ
và phần tượng tầng nhiều hơn so với phần gỗ cụ thể như sau: Ở vị trí vỏ phân lập được
13 chủng khuẩn chiếm 43,33%; ở phần tượng tầng phân lập được 9 chủng khuẩn chiếm
30%; ở phần gỗ phân lập được 8 chủng chiếm 26,67%. Số lượng các chủng vi khuẩn
phân lập được trên các vị trí khác nhau của cây chủ được thể hiện ở Hình 4.07:
43.33%
30%
26.67%
Vỏ Tượng tầng Gỗ
Hình 4.07: Tỷ lệ các chủng khuẩn phân lập được
trên các vị trí khác nhau của cây chủ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
40
4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập
đƣợc
4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn
nội sinh
Từ 30 chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành thử nghiệm hiệu lực của các
chủng này với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Kết quả thử
nghiệm hiệu lực kháng nấm gây bệnh và mật độ các chủng vi khuẩn được trình bày
ở Bảng 4.05.
Từ Bảng 4.05 cho thấy trong số 30 chủng vi khuẩn phân lập được thì có 7 chủng
khuẩn nội sinh (B01, B02, B03, P01, P02, X01, X02, X1.1) có khả năng kháng
nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
- Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng khuẩn có 6 chủng có
khả năng kháng nấm gây bệnh (B01, B02, B03, P01, X01, X02). Đặc biệt chủng vi
khuẩn B03 phân lập được từ phần vỏ của cây không bị bệnh (cây khoẻ) mọc rất
nhanh và làm cho nấm bệnh chậm phát triển tạo nê
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- LV08_NL_TT_VVD.pdf