Luận văn Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao

ạt cực đại tại từ trƣờng lớn), từ dƣ (từ độ còn dƣ sau khi ngừng tác động của từ trƣờng ngoài), lực kháng từ (từ trƣờng ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hòa từ, bị khử từ). Nếu kích thƣớc của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thƣờng từ vài cho đến vài chục nm), phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể, tính sắt từ và ferri từ biến mất, chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ. Đối với vật liệu siêu thuận từ, từ dƣ và lực kháng từ bằng không. Điều đó có nghĩa là, khi ngừng tác động của từ trƣờng ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa, đây là một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học [5]. Hạt nano từ tính có thể đƣợc chế tạo theo các phƣơng pháp thông dụng nhƣ phƣơng pháp nghiền, phƣơng pháp đồng kết tủa, phƣơng pháp vi nhũ tƣơngMỗi phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng, tuy nhiên khi đƣợc dùng trong y sinh học thì chúng cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau: - Tính đồng nhất của các hạt cao. - Từ độ bão hòa lớn. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 - Vật liệu có tính tƣơng hợp sinh học cao (không có độc tính). Hình 1.4. Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe3O4 [37] Tính đồng nhất về kích thƣớc và tính chất liên quan nhiều đến phƣơng pháp chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tƣơng hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu. Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tại nhiệt độ phòng (25 o C), sắt không độc đối với cơ thể ngƣời và tính ổn định khi làm việc trong môi trƣờng không khí nên các vật liệu nhƣ ô-xít sắt đƣợc nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh học. Hạt nano từ dùng trong y sinh học thƣờng ở dạng dung dịch nên còn gọi là chất lỏng từ. Một dung dịch gồm ba thành phần: lõi là hạt Fe3O4 có kích thƣớc nano, chất chức năng hóa bề mặt (chất hoạt hóa bề mặt) và dung môi. Trong đó: i) lõi Fe3O4 có kích thƣớc nano là thành phần duy nhất quyết định đến tính chất từ của dung dịch từ; ii) chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano từ phân tán trong dung môi, tránh kết tụ với nhau, ngoài ra nó còn có tác dụng “che chở’’ hạt nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể và tạo các mối liên kết hóa học với các phân tử khác trong điều kiện phù hợp. Dung môi là chất lỏng mang toàn bộ hệ [4, 15]. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 1.2.3. Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học Các ứng dụng đều liên quan đến những tính chất khác biệt của hạt nano. Những ứng dụng đầu tiên nhƣ chúng ta đã biết là liên quan đến tính chất quang của chúng. Ngƣời ta trộn hạt nano vàng, bạc vào thủy tinh để chúng có các màu sắc khác nhau. Gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra rất nhiều ứng dụng khả dĩ của hạt nano vàng để tiêu diệt tế bào ung thƣ. Trong đó, hạt nano vàng đƣợc kích thích bằng ánh sáng laser xung, do hiện tƣợng hấp thụ cộng hƣởng Plasmon mà hạt nano dao động có nhiệt độ tăng dần, có khi lên đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của vàng. Quá trình tăng nhiệt này gây ra một sóng xung kích tiêu diệt tế bào ung thƣ trong bán kính hàng mm. Hạt nano vàng bọc bởi các nguyên tử Gd (có mô men từ nguyên tử lớn nhất) còn đƣợc dùng để làm tăng độ tƣơng phản trong cộng hƣởng từ hạt nhân [5, 24, 32]. Hạt nano vàng, bạc đƣợc sử dụng trong y sinh học để đánh dấu tế bào. Nhờ kích thƣớc của hạt nano nhỏ hơn nhiều bƣớc sóng ánh sáng chiếu vào mà xuất hiện hiện tƣợng cộng hƣởng Plasmon bề mặt làm cho khả năng tán xạ ánh sáng của các hạt nano kim loại rất mạnh [32]. Các ứng dụng của hạt nano từ đƣợc chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể và trong cơ thể. Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác. Các ứng dụng hạt nano từ trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ [27]. 1.3. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO 1.3.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ Hạt nano từ tính có kích thƣớc 10 nm – 20 nm đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa hai ion Fe3+ và Fe2+ bằng OH- tại nhiệt độ phòng hoặc tại 90oC trong môi trƣờng khí N2 để tránh oxi hóa. Phép đo quang phổ kế hồng ngoại cho thấy trên bề mặt hạt nano từ tính trong nƣớc có bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho các ứng dụng sinh học [14, 15] Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải đƣợc chức năng hóa bề mặt để gắn kết với các đối tƣợng sinh học nhƣ ADN, kháng thể, enzyme. Các nhóm chức thƣờng gặp là nhóm amine, biotin, streptavidin, carboxyl, thiol. Để có đƣợc các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, ngƣời ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo ra một lớp polymer trên bề mặt hạt nano [6, 32]. Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với các đối tƣợng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano. Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã đƣợc thƣơng mại hóa. Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm hydroxyl tự do trên bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững. Điều kiện của môi trƣờng phản ứng có ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ nhƣ ethanol thì thƣờng làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cƣờng quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro. Có rất nhiều các nhóm chức khác nhau đƣợc tạo ra tùy theo mục đích thực nghiệm và trong số đó thì nhóm amine đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng sinh học. Hạt nano từ tính có nhóm amine (NP-NH2) thƣờng đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) [15, 34] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 Hình 1.5. Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amine sử dụng APTS [34] 1.3.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao Phức hợp hạt nano từ với kháng thể đặc hiệu có thể đƣợc tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau. Theo các nhà nghiên cứu về lĩnh vực công nghệ nano thì hiện nay có nhiều cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine – carboxyl; sử dụng SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane - 1- carboxylate) làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbohydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết không hóa trị của hạt nano silica đƣợc bọc streptavidin với các kháng thể đƣợc biotin hóa... Mỗi kiểu gắn kết có những ƣu điểm và hạn chế riêng. Nhƣng nhìn chung, nếu có từ 1 đến 3 cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano từ thì càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn [10, 20]. Trong các cách tạo liên kết kể trên thì có thể nói việc gắn trực tiếp thông qua liên kết amine – carboxyl là đơn giản nhƣng cũng đem lại hiệu quả khá cao. Hạt từ amine ban đầu có thể kết hợp với một số hợp chất nhƣ các hợp chất chứa aldehyde, các glycoprotein đã bị oxy hóa hay các hợp chất hoạt hóa este nhóm N-hydroxysuccinimide (NHS) hoặc các hợp chất biến đổi từ Iodoacetyl. Tuy nhiên hiện nay cách mà có nhiều ƣu điểm hơn cả đó là việc sử dụng gắn trực tiếp hạt từ amine với hợp chất chứa nhóm carboxyl thông qua cầu nối trung gian 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride hay EDC hoặc EDAC là hợp chất carbodiimide phổ biến nhất đƣợc sử dụng để tạo cầu nối giữa nhóm amine và nhóm carboxyl. EDC là một chất tan trong nƣớc, hoạt động tốt trong khoảng pH 4,5 và pH 7,5. EDC cũng thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với NHS hoặc sulfo-NHS để tăng hiệu qủa gắn kết hoặc tạo ra một sản phẩm amine phản ứng ổn định [20]. Việc gắn kết giữa hạt từ amin với kháng thể thông qua cầu nối trung gian EDC đƣợc thực hiện qua hai bƣớc nhƣ mô tả tại hình 1.6. Hạt từ amine sẽ phản ứng với EDC tạo ra một chất trung gian không bền (A), hợp chất này ngay lập tức sẽ gắn kết với kháng thể thông qua liên kết giữa nhóm amine với carboxyl tạo thành sản phẩm bền vững và phản ứng ổn định (B). Hình 1.6. Quy trình gắn kết hạt nano đƣợc chức năng hóa với kháng thể [20] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 1.3.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trƣờng Nhóm chức đƣợc chức năng hóa trên bề mặt không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ. Giống nhƣ trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ đƣợc các kháng thể hoặc các phân tử khác nhƣ các hormone, acid folic nhận biết. Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính đƣợc bao phủ bởi các chất hoạt hóa tƣơng tự các phân tử trong hệ miễn dịch nên có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thƣ phổi, vi khuẩn, tế bào ung thƣ đƣờng tiết niệu và thể golgi. Đối với các tế bào lớn, kích thƣớc của các hạt từ đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thƣớc vài trăm nm [27]. Quá trình chọn lọc và làm giàu tế bào đƣợc thực hiện nhờ một gradient từ trƣờng ngoài. Từ trƣờng ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào đƣợc đánh dấu. Các tế bào không đƣợc đánh dấu sẽ không đƣợc giữ lại và thoát ra ngoài. Hình 1.7. Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trƣờng [6] (a) Nam châm được đặt bên ngoài để hút các tế bào đã được đánh dấu và loại bỏ các tế bào không được đánh dấu; (b) Nam châm có thể đặt vào một dòng chảy có chứa tế bào cần chọn lọc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu đờm lao và vaccine BCG Các mẫu đờm lao của bệnh nhân bị bệnh lao đƣợc nhận từ Viện Quân Y 103. Trƣớc đó tất cả các mẫu đờm này đã đƣợc kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn bằng phƣơng pháp soi trực tiếp. Dựa trên phƣơng pháp của Kubica và cộng sự [22], Các mẫu đờm sau đó đƣợc khử nhiễm bằng một thể tích hỗn hợp gồm NaOH 1 M, Sodium citrate 0,1 M và N-acetyl-L-cystein 30 mM. Lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, chia vào các ống falcon và sau đó ly tâm tách cặn, 12000 vòng/phút x 10 phút và cuối cùng bảo quản trong ống eppendorf. Vaccine BCG (Bacillus Calmette Guerin) do Việt Nam sản xuất đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng. Vaccine đƣợc cung cấp là chế phẩm dạng đông khô (chứa 0,5 mg BCG và 3,0 mg Glutamate natri trong 1 ống) của chủng Calmette - Guerin giảm độc lực, có nguồn gốc từ vi khuẩn Mycobacterium bovis. Hình 2.1. Vaccine BCG sản xuất tại Việt Nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 2.1.2. Hạt nano kim loại có từ tính Hạt nano kim loại có từ tính Fe3O4 có tính chất khá đồng nhất, ít bị kết tụ, đƣợc bao bọc bởi lớp màng silica có gắn nhóm amine (NP-NH2) có khả năng liên kết bền vững với kháng thể đặc hiệu trong điều kiện thích hợp. Loại hạt mà nhóm chúng tôi sử dụng có kích thƣớc khoảng 20 nm, đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa hai ion Fe3+ và Fe2+ bằng OH- trong môi trƣờng khí N2 tại nhiệt độ 90 o C. Đây là kết quả nghiên cứu chế tạo của nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.3. Mồi đặc hiệu Đoạn mồi (primer) IS6110 đƣợc thiết kế để phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu vaccine BCG hay trong mẫu đờm lao bằng kỹ thuật PCR thông thƣờng dựa trên các trình tự bảo thủ đặc hiệu cho vi khuẩn lao và đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ). Trình tự cặp mồi IS6110 đƣợc thiết kế nhƣ sau: Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR Mồi Trình tự Tài liệu tham khảo Kích thƣớc đoạn nhân lên Mồi xuôi 5'-GAACCGTGAGGGCATCGAGG-3' [23] 249 bp Mồi ngƣợc 5'-GCG TAGGCGTCGGTGACAAA-3' 2.1.4. Các loại đệm Dung dịch đệm MES pH 4,5; pH 5,5 và pH 6,5. Dung dịch đệm Phosphate PBS pH 6,5 và pH 7,4. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 Dung dịch đệm Tris-HCl – EDTA (TE: 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) pH 7,4. Dung dịch đệm Tris-HCl – EDTA – Triton X-100 (TET: 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100) pH 7,4. Dung dịch bảo quản PBS-TBN (Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01 % Tween 20; 0,1 % BSA và 0,05 M NaN3). 2.1.5. Các hóa chất và nguyên liệu khác Kháng thể đa dòng kháng vi khuẩn lao (anti-TB) của hãng Abcam, Mỹ. Chất trung gian tạo phức EDC của hãng Sigma, Mỹ. Màng Polyvinylidene fluoride (PVDF) của hãnh Bio-Rad, Mỹ. ADN Taq polymerase, ADN Dream Taq TM polymerase và thang chuẩn ADN đƣợc mua từ hãng Fermentas, các dNTP của hãng Promega. Các hóa chất khác đạt độ tinh khiết dành cho nghiên cứu sinh học phân tử. 2.1.6. Máy móc và thiết bị Máy PCR của Bio-Rad, bộ điện di agarose, giá hút từ của Promega, máy phá mẫu bằng sóng siêu âm Sonicator Các máy còn lại đều đạt độ chính xác dùng trong thí nghiệm sinh học phân tử. Ngoài ra, trong nghiên cứu cũng sử dụng phần mềm phân tích độ sáng của ảnh Image J. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch Nguyên tắc của phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch (Dot blot) là dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể sơ cấp sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ SƠ CẤP – KHÁNG THỂ THỨ CẤP đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thƣờng. Nồng độ của protein cũng nhƣ của dịch nuôi tế bào có thể đƣợc định lƣợng không hoàn toàn thông qua sử dụng phƣơng pháp Dot blot. Quy trình tiến hành : - Màng đƣợc cắt với kích thƣớc thích hợp, các ô vuông trên màng đƣợc kẻ bằng bút chì có kích thƣớc 1x1 cm. Sau đó màng đƣợc ngâm trong methanol khoảng 3 – 4 phút, rửa methanol bằng nƣớc cất, để trên giấy thấm và mẫu đƣợc chấm lên bề mặt đƣợc đánh dấu của màng. - Đầu côn đƣợc dùng để lấy và chấm 2µ mỗi mẫu lên bề mặt màng tại trung tâm của ô kẻ. Dung dịch mẫu thẩm thấu xuống màng thƣờng có đƣờng kính 3 – 4 mm. - Màng sau khi sấy khô sẽ đƣợc cố định bởi dung dịch BSA 5% trong PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng. - Màng đƣợc rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 để loại bỏ BSA thừa. Màng sau đó đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng. - Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa 3 lần trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn enzyme photphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20. - Tiếp đó, cân bằng màng bằng đệm AP (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9,5). - Các vết chấm đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p-nitro blue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm AP. - Phản ứng đƣợc làm ngƣng trong nƣớc cất khi vết chấm hiện rõ. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 2.2.2. Phƣơng pháp gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao Mục đích: gắn kết kháng thể anti -TB lên trên bề măṭ của haṭ nano tƣ̀ có gắn nhóm amine (NP-NH2) để thử nghiệm trong việc chẩn đoán bệnh lao . Quy trình bao gồm hai bƣớc chính là : hoạt hóa kháng thể sử dụng cầu nối EDC và gắn kháng thể đa ̃hoaṭ hóa lên trên bề mặt hạt NP-NH2. Hình 2.2. Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao Chi tiết các bƣớc thực hiện đƣơc̣ trình bày dƣới đây. - Lắc nhẹ dung dịch chứa hạt NP-NH2 trong 5 – 10 phút để tạo nên một hỗn hợp đồng nhất. - Lấy 50 µl hạt NP-NH2 vào 1 ống eppendorf. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 phút và hút bỏ dịch trong. - Hạt đƣợc rửa hai lần bằng đệm và hút bỏ dịch trong. - Bổ sung dung dịch đệm, kháng thể anti–TB (7 mg/ml) và EDC (250 mg/ml). Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 22oC trong một khoảng thời gian. - Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 – 2 phút và hút bỏ dịch trong. Phức hệ hạt đƣợc sử dụng ngay cho các thí nghiệm tiếp theo. - Lƣu ý : EDC là chất dễ bị thủy phân trong dung dịch vì vậy nên pha mới ngay trƣớc khi sử dụng. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR Mục đích : Thu nhâṇ vi khuẩn lao dƣạ trên liê n kết kháng nguyên và kháng thể. Sau đó tiến hành ly giải và nhận biết sự có mặt của vi khuẩn lao bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn lao cho kích thƣớc 249 bp. Chi tiết các bƣớc của quy trì nh “Sử duṇg haṭ từ để thu nhâṇ vi khuẩn lao từ BCG” đƣơc̣ trình bày dƣới đây : 1. Tâp̣ trung phƣ́c hê ̣haṭ tƣ̀ đa ̃chuẩn bi ̣ theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.2 trên giá nam châm và hút bỏ dic̣h trong . 2. Bổ sung 25µl mẫu vaccine BCG hoặc mẫu đờm lao, trôṇ đều và ủ hỗn hợp trong 45 phút ở nhiêṭ đô ̣phòng. 3. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm và hút dịch BCG hoặc mẫu đờm lao sang một ống eppendorf khác, bổ sung 25µl đệm ly giải thích hợp. 2.2.4. Phƣơng pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN Đối với các kỹ thuật sinh học phân tử có liên quan tới acid nucleic thì các ứng dụng phụ thuộc rất nhiều vào số lƣợng và chất lƣợng ADN/ARN đƣợc tách chiết. Điều mà bị ảnh hƣởng bởi số tế bào ly giải, lƣợng ADN/ARN phục hồi và sự dƣ thừa của một số chất phản ứng hoặc thuốc thử. Thành tế bào vi khuẩn lao là một trong những thành tế bào vi sinh vật có cấu trúc phức tạp, điều mà làm cho việc phá vỡ thành tế bào trở lên khó khăn. Nhiều phƣơng pháp ly giải dựa trên việc sử dụng enzyme, sự va đập vào mẫu do tác động của sóng siêu âm tạo ra, hay do sự tác động của nhiệt độ tới tế bàocho kết quả tách chiết ADN khá tốt nhƣng những phƣơng pháp này lại phụ thuộc khá nhiều vào loại mẫu sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp ly giải tế bào khác nhau để thu đƣợc lƣợng ADN cần thiết làm khuôn cho phản ứng PCR. Các phƣơng pháp ly giải đƣợc trình bày ở dƣới đây: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 Phƣơng pháp 1: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung thêm 25 µl nƣớc cất và trộn đều, sau đó đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Tiếp theo, hỗn hợp hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm và hút dịch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC. Phƣơng pháp 2: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó hỗn hợp đƣợc làm đông ở -20oC trong 20 phút. Tiếp đó, hỗn hợp đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châm và hút dịch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC. Phƣơng pháp 3: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châm và hút dic̣h trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC. Phƣơng pháp 4: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung thêm 25 µl đệm TET (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA và 1% Triton X-100, pH 7,4) và trộn đều, hỗn hợp đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châ m và hút dic̣h trong sang m ột ống eppendorf, bảo quản ở 4oC. 5 µl mẫu từ mỗi phƣơng pháp ly giải đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp ngay sau đó. 2.2.5. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao Mục đích: Thử nghiệm độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể anti-TB nhằm rút ngắn thời gian của quy trình phát hiện vi khuẩn lao và sản xuất phức hệ gắn giữa hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao. Chi tiết các bƣớc quy trình đƣợc trình bày dƣới đây : Bước 1 : Tổng hợp phức hệ 10 phản ứng 1. Lắc nhẹ dung dịch chứa hạt NP-NH2 trong 5 – 10 phút để tạo nên một hỗn hợp đồng nhất. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 2. Lấy 500 µl hạt NP-NH2 vào 1 ống eppendorf. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 phút và hút bỏ dịch trong. 3. Bổ sung dung dịch đệm, kháng thể anti–TB (7 mg/ml) và EDC ( 250mg/ml). 4. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 22oC trong một khoảng thời gian. 5. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 – 2 phút, hút bỏ dịch trong và bổ sung 750 µl dung dịch đệm bảo quản PBS-TBN. Bước 2 : Thử nghiệm khả năng làm giàu của phức hệ theo thời gian Các mốc thời gian thử nghiệm : 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày. Tại mỗi mốc thời gian, hút 75 µl dung dịch bảo quản có chứa hạt từ (lắc đều trƣớc khi sử dụng), tập trung hạt từ trên giá nam châm, hút bỏ dịch trong, bổ sung mẫu rồi tiến hành các bƣớc tiếp theo nhƣ đã trình bày ở 2.2.3 2.2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR PCR là phƣơng pháp đơn giản với giá thành không cao thƣờng đƣợc ứng dụng trong các phép đo nhanh, thử lần một để có câu trả lời dƣơng tính hay âm tính đối với một mẫu bệnh phẩm. Bằng việc sử dụng các đoạn ADN mồi đặt hiệu, các quá trình nhiệt của phản ứng nhân đôi ADN đƣợc tối ƣu hóa và cho tiến hành trong thời gian từ 2 giờ đến 3 giờ. Các mẫu sau khi kết thúc phản ứng PCR đƣợc tra vào các giếng điện di để xác định sự có mặt của ADN vi khuẩn gây bệnh. Do trong quá trình chạy PCR đã sử dụng mồi IS6110 của hãng Invitrogen đối với ADN của vi khuẩn lao nên tính đặc hiệu rất cao. Nếu trong vaccine BCG hay trong mẫu bệnh phẩm mà cụ thể ở đây là mẫu đờm lao có chứa ADN của vi khuẩn lao, chúng sẽ đƣợc nhân lên nhiều lần và sẽ biểu hiện dƣơng tính ở trên gel điện di. Ngƣợc lại, nếu không có ADN của vi khuẩn lao trong mẫu sẽ không hiện phổ vạch trên bản điện di agarose. Nhằm đánh giá độ chính xác đồng thời kiểm tra hiệu quả của quy trình gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng lao, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với khuôn là sản phẩm ly giải trong quy trình gắn kết từ mẫu ban đầu là vaccine BCG và mẫu đờm lao. Với mẫu ban đầu là vaccine BCG thì Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 enzyme sử dụng là Taq ADN polymerase, còn với mẫu bệnh phẩm ban đầu là mẫu đờm lao thì enzyme đƣợc sử dụng là ADN Dream taqTM polymerase của hãng Fermentas. Sử dụng nƣớc cất hai lần làm đối chứng âm. Mỗi phản ứng gồm các thành phần sau : Bảng 2.2. Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG Thành phần Thể tích (µl) H2O cất khử trùng, khử ion 12,5 µl Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl Mồi xuôi (25 ng/µl) 1 µl Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl ADN Taq polymerase (5 unit/µl) 0,5 µl ADN khuôn 5 µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao Thành phần Thể tích (µl) H2O cất khử trùng, khử ion 12,8 µl Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl Mồi xuôi (25 ng/µl) 1 µl Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl ADN Dream taq TM polymerase (5 unit/µl) 0,2 µl ADN khuôn 5 µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh cẩn thận về nhiệt độ ủ, thời gian ủ và thời gian kéo dài nhƣ ở bảng 2.4 dƣới đây. Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 40 chu trình Giai đoạn biến tính 94oC – 1 phút Giai đoạn gắn mồi 65oC – 45 giây Giai đoạn kéo dài 72oC – 1 phút Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiể