Luận văn Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây arabidopsis thaliana

ferase (GSTF) là GSTF9 và GSTF23 có dấu hiệu giảm rõ rệt trong điều kiện cực đoan [45]. Mặc dù việc oxy hóa và khử gốc oxy hóa ở các gốc Met trong calmodulin và các protein truyền tín hiệu canxi khác đã được chứng minh là tham gia vào việc điều hòa chức năng protein [26, 28, 78], tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ [26, 45, 84]. Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu 22 về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn trùng chích hút nhựa cây có mức độ phá hoại được đánh giá là nguy hiểm đối với nhiều cây trồng họ Fabaceae [1]. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam [3]. Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay, vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của Msr trên thực vật. Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam. 23 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt Arabidopsis thaliana kiểu dại chủng Columbia (Col-0) được sử dụng cho các thí nghiệm. Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dòng FOX, cDNA hoàn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa. Dòng cây chuyển gen biểu hiện quá mức gen At3G55240 đã được nghiên cứu bởi Ichikawa và cs (2006) [43]. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu. STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích 1 Murashige & Skoog medium chứa các vitamin Duchefa (Hà Lan) Môi trường nảy mầm hạt và thử mức độ nhạy cảm với điều kiện bất lợi 2 Hygromycin B Sigma (Mỹ) 3 Natri clorua Merck (Mỹ) 4 Paraquat diclorua Syngenta (Indonesia) 5 Cadmium clorua Himedia (Ấn Độ) 24 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị và máy móc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp sử dụng trong nghiên cứu đươc̣ thống kê trong Bảng 2.2. Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị Hãng sản xuất 1 Cân phân tích Sartorius (Đức) 2 Cân kỹ thuật Sartorius (Đức) 3 Máy cất nước Hamilton (Anh) 4 Nồi hấp tiệt trùng tự động Tomy (Nhật Bản) 5 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ) 6 Tủ lạnh –20C và 4C Panasonic (Nhật Bản) 7 Tủ sấy Memmert (Đức) 2.2. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1. 2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học 2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp. Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java. Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN ( [85] và phần mềm Blast2go Basic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen 25 thành 3 nhóm: tham gia vào các quá trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành phần của tế bào. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu Dự đoán vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào. Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ chức cao nên chức năng của protein trong các quá trình sinh học có mối liên hệ chặt chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào. Trong những năm gần đây, nhiều công Danh sách các gen mã hóa MRP Chú giải chức năng các gen mã hóa MRP Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter gen mã hóa MRP Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter gen mã hóa MRP Cây Arabidopsis biểu hiện quá mức hoặc bị đột biến gen ứng viên Đánh giá hình thái Thử nghiệm điều kiện bất lợi Thử kháng mặn Thử kim loại nặng Cadmium Thử paraquat TIN SINH HỌC THỰC NGHIỆM 26 cụ dự đoán được phát triển. Phần lớn các công cụ này dựa vào thuật toán nội suy, xác định vị trí cư trú của protein thông qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự đặc hiệu của các protein đã biết [58]. Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác. Cụ thể, TargetP chỉ tập trung xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory pathway signal peptide). Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein nằm trong lục lạp. pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58]. Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP ( [27], pSORT ( [41], và CELLO ( [92]. Trong đó, vị trí cư trú nằm trên lục lạp được dự đoán bằng ChloroP và pSORT. Vị trí cư trú nằm trên ty thể được dự đoán bằng pSORT và CELLO. 2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65]. Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau: Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon ). Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới nước đầy đủ trong tuần đầu tiên. Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ được ngừng tưới nước trong vòng 10 ngày. Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích microarray. Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là 27 GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247 [65]. Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon). Cây 10 ngày tuổi trên môi trường GM đã được chuyển sang môi trường ½ MS đặc không có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200 mM NaCl và được giữ trong vòng 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần). Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen. Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514 [64]. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP. Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết như Bảng 2.3. Trình tự 1- kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4 [82]. Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [90] Yếu tố cis Trình tự nhận biết ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYBR (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C MYCR CACATG ICEr2 ACTCCG RSRE CGCGTT 28 2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm 2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240 Hạt giống Arabidopsis chuyển gen và hạt đối chứng được xử lý sơ bộ bằng ethanol 70% trong 5 phút, sau đó được khử trùng tiếp bằng dung dịch NaClO nồng độ 1% trong thời gian 1 phút. Tiếp theo rửa hạt 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ các phần dư thừa của hóa chất vô trùng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây con sau này. Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 24±2oC. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau. 2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7. Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750 µM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91] có cải biến. Gieo hạt cây chuyển gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh Hygromycin. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong 29 dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu của lá sau 24 giờ. 30 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP 3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp (Phụ lục). Trong số toàn bộ AtMRP, hàm lượng Met lớn 7 % được tìm thấy ở 47 gen (chiếm 38,8 % tổng số gen mã hóa cho MRP), đặc biệt có 2 gen AT4G16980 và AT1G33820 mã hóa cho phân tử protein có kích thước tương ứng là 164 và 182 axit amin, chứa 15,95 % và 16,02 % Met. MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Theo Thimm và cs (2004), MAPMAN xác định chức năng của gen có thể tham gia vào một phần của quá trình trao đổi chất, hoặc có chức năng cụ thể (như tổng hợp protein), đáp ứng sinh học (như gen tham gia vào trao đổi chất và/ hoặc đáp ứng với hormone), hoặc mã hóa cho các họ enzyme mà chức năng của chúng chưa rõ [85]. Kết quả phân tích cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong tế bào. Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP. Bên cạnh đó, một số MRP cũng phân bố rải rác trong các chu trình quan trọng khác như liên kết và vận chuyển kim loại, tương tác với yếu tố bất lợi, xử lý RNA sau phiên mã, chu kỳ tế bào, liên quan đến sự phát triển của tế bào. Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào thực vật. 31 Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN Nhóm chức năng gen AtMRP Kiểm soát ion kim loại 2 Phản ứng điều kiện bất lợi 1 Xử lý RNA 4 Điều hòa phiên mã RNA 20 Biến đổi protein 12 Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) 6 Chu trình tế bào 3 Sự phát triển 1 Vận chuyển (kim loại) 6 Chưa biết chức năng 56 (Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của Arabidopsis 32 Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học (Hình 3.2), thành phần của tế bào (Hình 3.3) và chức năng phân tử (Hình 3.4). Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào. Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) 33 Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) 34 Lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ra ROS ở mức độ cao. Như vậy, việc xác định vị trí hoạt động của MRP trong bào quan có thể góp phần làm sáng tỏ về chức năng của chúng. Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tôi đã sử dụng 3 công cụ bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đoán dựa trên trình tự polypeptide của 121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đoán có đích đến ở lục lạp bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự đoán là cư trú trong ty thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Bảng 3.2 và Hình 3.5). Trong đó, chỉ có 2 protein cùng được dự đoán là nằm trên lục lạp bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1 protein cũng được dự đoán ở ty thể bởi pSORT và CELLO (Hình 3.5). Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO Việc có ít trùng lặp trong kết quả dự đoán giữa các phương pháp tin sinh học về vị trí lưu trú của các protein đặc hiệu đã được nhóm tác giả Liu và cs nêu rõ, cụ thể là do sự khác nhau trong thuật toán và cơ sở dữ liệu mẫu của mỗi phương pháp nên thường các công cụ dự đoán khác nhau cho ra những kết quả cũng khá là khác nhau [58]. Do đó, chúng tôi quan tâm nhiều hơn đến tổng số lượng dự đoán của MRP có kết quả là đích đến là lục lạp và ty thể từ cả 2 phần mềm, bởi kết quả này có thể bổ trợ cho nhau. 10 92 ChloroP pSORT A. Lục lạp 21 2 61 CELLO pSORT B. Ty thể 9 35 Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp TT Tên protein Chloro P WoLF PSORT CELLO Lục lạp Lục lạp Ty thể Ty thể 1 At1G06960.3 Y 2 At1G10590.3 Y 3 At1G22590.1 Y Y 4 At1G32560.1 Y 5 At1G33860.1 Y 6 At1G49800.1 Y 7 At1G68160.1 Y 8 At2G07708.1 Y Y 9 At2G26975.1 Y 10 At2G46600.1 Y 11 At3G07560.1 Y 12 At3G11160.1 Y 13 At3G28190.1 Y 14 At3G28990.1 Y 15 At3G29070.1 Y 16 At3G43410.1 Y 17 At3G46900.1 Y 18 At3G59900.1 Y 19 At4G08395.1 Y 20 At4G32470.2 Y Y 21 At4G34590.1 Y 22 At5G26673.1 Y 23 At5G41170.1 Y 24 At5G59030.1 Y 25 At5G59040.1 Y Y 26 At5G61710.1 Y Y 27 ATMG00500.1 Y 28 ATMG00650.1 Y Tổng số 12 11 3 7 Y: được dự đoán là có mặt trong bào quan tương ứng 36 Để tăng mức độ tin cậy của kết quả, chúng tôi đã kiểm chứng lại vị trí bào quan mà 121 AtMRP cư trú bằng phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0. Sử dụng công cụ Graphs, lựa chọn mục Cellular Component trong GO Category, đã đếm được 9 trình tự AtMRP trên ty thể (Hình 3.6). Điều này làm tăng mức độ tin cậy từ kết quả dự đoán về đích đến của MRP trong tế bào. Như đã biết, lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ROS [31], chính điều này làm các MRP cư trú trong đó dễ dàng bị oxy hóa khi dư lượng ROS tăng cao do yếu tố bất lợi tác động. Như vậy, kết quả dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào bước đầu có thể nhận định được vai trò của chúng tham gia trong các bào quan. Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm Blast2GO Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động quá trình oxy hóa và khử Met trong thực vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan trọng trong tế bào như kiểm soát quá trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+. Sản phẩm của các gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp phần làm sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào. 37 3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi Ban đầu, dữ liệu microarray của gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis kiểu dại ở điều kiện bình thường so với điều kiện chịu mặn và hạn hán [54, 64] được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Trong tổng số 121 gen AtMRP, dữ liệu biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26 %) được ghi nhận số liệu (Phụ lục). Tất cả các gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ 2 lần được coi là có biểu hiện đáp ứng với điều kiện bất lợi. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ phiên mã thay đổi trong điều kiện chịu mặn và/hoặc điều kiện hạn. Trong điều kiện chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và giảm ít nhất 2 lần. Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương ứng là cao hơn và thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng tăng gấp hơn 2 lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực đoan trong thí nghiệm (Hình 3.7). Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện chịu hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được chỉ ra ở Bảng 3.3. Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán 38 Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao TT Tên gen Met (%) Chiều dài (axit amin) Số lần thay đổi ở mức độ biểu hiện Mô tả gen Xử lý hạn Xử lý mặn 1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA nhóm I 2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết 3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9 Biểu hiện quá mức dẫn đến sự “giả vàng úa dưới ánh sáng” 4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết 5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến yếu tố MYC 6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0 Gen giả mã hóa cho protein trong họ chuỗi truyền điện tử P450 7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết 8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11 9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài 10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết 39 Gen At4G33467, mã hóa cho protein chưa biết đến chức năng và là gen có biểu hiện tăng mạnh nhất trong điều kiện hạn hán, mức độ thay đổi gấp hơn 330 lần so với nhóm đối chứng. Một gen khác như At1G32560, mã hóa cho protein chứa vùng domain LEA nhóm 1 liên quan đến sự cảm ứng với điều kiện mất nước, gen này tăng mức biểu hiện gấp khoảng 135 lần trong điều kiện hạn. Gen mã hóa cho protein LEA như At1G32560 có vai trò trong quá trình phát triển muộn của phôi. LEA thường xuất hiện nhiều trong hạt và các mẫu mô thực vật trong điều kiện bất lợi như khô hạn, chịu mặn, nhiệt độ căng thẳng. Họ protein LEA được chứng minh rằng khi tăng cường biểu hiện sẽ giúp thực vật có khả năng chống chịu tốt hơn trong điều kiện chịu mặn [64]. Bên cạnh đó, gen At3G62090 mã hóa cho yếu tố phiên mã bHLH (helix loop helix-HLH) được đặc trưng bởi cấu trúc xoắn-vòng-xoắn cơ bản, có mức độ biểu hiện được tăng cường gấp 64 và 2 lần trong khi xử lý hạn và mặn. Ngược lại, trong số các gen có biểu hiện giảm, At3G55240 bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất, mức độ biểu hiện của gen này bị giảm tương ứng khoảng 60 và 26 lần trong điều kiện hạn và mặn. Ichikawa và cs (2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng “giả vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp). Các trình tự tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ lúa nhưng không được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen mã hóa cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật [43]. Tuy nhiên, chưa có bất kỳ một công bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn At3G55240 là gen ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với cây trồng trong các điều kiện cực đoan. Trong Arabidopsis, có đến 50% gen mã hóa MRP có biểu hiện thay đổi trong điều kiện bất lợi đều thuộc nhóm protein chưa biết được chức năng (Bảng 3.4). Số còn lại được dự đoán là giữ các chức năng khác nhau trong tế bào, quan trọng nhất là MRP có vai trò truyền dẫn tín hiệu liên quan đến Ca2+ và là nhân tố 40 phiên mã RNA protein giúp thực vật phản ứng với điều kiện bất lợi. Trong 6 AtMRP mã hóa cho protein tham gia vào quá trình tín hiệu Ca2+, 3 gen có biểu hiện đáp ứng trong điều kiện mặn hoặc hạn hán: 1 gen có đáp ứng tăng cường biểu hiện và 2 gen có biểu hiện đáp ứng giảm biểu hiện (Bảng 3.4). Điều đó cho thấy rằng tín hiệu Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát tín hiệu khi thực vật chịu điều kiện bất lợi phi sinh học. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó về vai trò của calmodulin trong quá trình cân bằng ROS ở thực vật [4, 78, 81]. Hoạt tính xúc tác của catalase điều hòa nồng độ H2O2 trong Arabidopsis, bị kích thích bởi phức hệ Ca2+/calmodulin để duy trì mức độ cân bằng nội môi H2O2 [4]. Bên cạnh đó, có đến 13/20 AtMRP đóng vai trò là các nhân tố điều hòa phiên mã RNA, gồm 7 gen mã hóa MRP được tăng cường biểu hiện và 6 gen mã hóa MRP bị giảm biểu hiện với điều kiện hạn hán và/hoặc điều kiện chịu mặn. At3G62090, At5G42325 và At4G34590 đều là những nhân tố phiên mã được tăng cường biểu hiện trong cả điều kiện hạn hán và chịu mặn. At3G62090 thuộc họ protein có cấu trúc cơ bản xoắn vòng xoắn (bHLH) hay còn gọi là nhân tố tương tác với phytochrome (PIF). Penfield và cs đã chỉ ra rằng PIF đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các tín hiệu từ môi trường tác động đến thực vật, đặc biệt là phản ứng với ánh sáng trong quá trình này mầm của hạt. Gen At3G62090 mã hóa cho PIF6. Trong điều kiện ánh sáng đỏ mạnh, PIF6 làm cho trụ dưới lá mầm ngắn hơn, trong khi dưới điều kiện ánh sáng xanh thì trụ dưới lá mầm lại có hình thái bình thường hay khác biệt không đáng kể [67]. At4G34590 hay cò