Luận văn Nghiên cứu vi sinh vật chịu mặn, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật trên đất trồng cây bưởi da xanh và cây sầu riêng tại tỉnh Bến Tre

ng phân giải lân cao. Trong khi đó, đối với chủng ĐT1 thì NH4Cl là nguồn cung cấp nitơ tốt nhất. Ngoài tác dụng phân giải lân, các chủng vi sinh vật này còn có khả năng sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật hoặc các chất kháng sinh giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài. Tác giả Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Mộng Huyền (2015) đã phân lập được 36 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI từ các mẫu rễ cây khoai lang trồng ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang. Tất cả các dòng vi khuẩn này đều có dạng hình que và có khả năng chuyển động. Thực hiện các 16 phép thử sinh hóa đã xác định được các dòng KL9, KL11, KL39a, KL39b là các vi khuẩn nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt là cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA. Khi giải trình tự đoạn gen 16S-DNA của 4 dòng vi khuẩn này, nhận diện được dòng KL9 có tỷ lệ đồng hình của đoạn gen 16S-DNA với loài Burkholderia sprentiae và Burkholderia vietnamiensis là 99%; tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16S-DNA của dòng KL39a với loài Burkholderia ambifaria và Burkholderia vietnamiensis là 99%; tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16S-rDNA của dòng KL39b với loài Enterobacter ludwigii và Enterobacter cloacae là 99%; tỷ lệ đồng hình đoạn gen 16SDNA của dòng KL11 với loài loài Klebsiella pneumoniae là 99%. Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Thị Việt (2015) nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Ashby dịch thể bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,2‰, 6‰, 12‰, 18‰, 24‰ và 30‰. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ muối NaCl có ảnh hưởng khá rõ rệt đến sự tích lũy sinh khối và cố định N-NH4 + của 2 chủng vi khuẩn. Đối với chủng P. pseudoalcaligenes V94, nồng độ NaCl thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là 12‰. Đối với chủng K. pneumonia V204, nồng độ NaCl thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là 6‰. Cả 2 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh trưởng phát triển trong phạm vi pH khá rộng (4-8), có khả năng chịu muối NaCl và có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật. Đây là ưu điểm nổi trội của chủng giống khi sử dụng làm chế phẩm sinh học dùng cho đất bị nhiễm mặn. Kết quả đánh giá của Lăng Ngọc Dậu và cs. (2007) về khả năng tạo IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum khi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường NFb có bổ sung tryptophan và theo dõi tại những thời điểm khác nhau cho thấy, tại thời điểm 10 ngày sau khi nuôi cấy thì khả năng tạo IAA là cao nhất. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phốt phát vô cơ khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium spp. nhận thấy, chủng vi khuẩn này có khả năng tổng hợp 2 - 10 µg IAA/ml môi trường nuôi cấy. Các chủng vi sinh vật kích thích sinh trưởng nội sinh nuôi trong môi trường không chứa tryptophan (môi trường Baz), có khả năng sinh IAA cao nhất ở ngày thứ 2, 17 đạt 2,98 µg/ml. Còn trên môi trường NFb, khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu đạt cao nhất ở ngày thứ 4 (3,16 µg IAA/ml). Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất phân hữu cơ vi sinh cho cây chè ở Yên Bái đã lựa chọn được 3 chủng ST1, ST8 và ST18 có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật cao. Sau 3 ngày nuôi cấy, hoạt tính của các chủng vi khuẩn đạt 42,28 - 105,90 IAA µg/ml IAA thô. Theo phương pháp phân loại sinh học phân tử, 03 chủng vi khuẩn nói trên có quan hệ gần gũi với các loài Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus polyfermenticus. 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LOÀI VI KHUẨN Achromobacter CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Vi khuẩn thuộc chi Achromobacter được tìm thấy trong đất, nước, có hình dạng que ngắn, nhuộm gram âm. Về phân loại: Giới: Bacteria Phân giới: Proteobacteria Lớp: Betaproteobacteria Bộ: Burkholderiales Họ: Alcaligenaceae Chi: Achromobacter Loài điển hình: Achromobacter xylosoxidans Nhiều loài thuộc chi Achromobacter có hoạt tính sinh học quý như phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật (Ermakova et al., 2017), hoạt tính hủy hydrocarbon thơm đa vòng (polycyclic aromatic hydrocarbons - PAHs) (Tiwari et al., 2010). Loài Achromobacter piechaudii ARV8 có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật được phân lập trên đất trồng cây cà chua tại cùng Arava, Israel (Mayak et al., 2004) . 18 Ở Việt Nam, một số nghiên cứu công bố vi khuẩn Achromobacter sp. có khả năng phân hủy dibenzofuran, hydrocarbon thơm đa vòng, lên men cồn từ bã mía, kích thích sinh trưởng thực vật (Trần Thị Giang và cs., 2014; Dương Đức Hoàng Sinh và cs., 2018). 19 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn có khả năng chịu muối NaCl ≥ 1% và có hoạt tính sinh học (kích thích sinh trưởng thực vật). 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp. Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2019 - tháng 4 năm 2020. 2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Các mẫu đất trồng cây sầu riêng và bưởi Da xanh thu thập tại tỉnh Bến Tre và một số tỉnh lân cận năm 2017 được lưu trữ tại Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp. - Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, máy li tâm để bàn, cân điện tử, bể nhiệt, tủ cấy vi sinh. - Dụng cụ nghiên cứu: Ống đong, bình thuỷ tinh, giấy thấm, . Dụng cụ khác như găng tay, bút viết, sổ ghi chép, .... - Hóa chất dùng trong phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction, PCR): 10x Taq buffer, dNTPs, Taq polymerase (5U/l), nước cất vô trùng (Invitrogen). - Đệm CTAB để tách chiết DNA tổng số: 5M NaCl; 0,5M EDTA (pH 8,0); 1M Tris-HCl (pH 8,0); polyvinyl pyrrolidone (MW 40.000); 0,8% CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide). - Đệm TE 1x để hòa tan cặn chứa DNA tổng số: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) và 1 mM EDTA (pH 8,0). 20 - Đệm TAE 1x để chạy điện di: 10 mM Tris-acetate và 0,5 mM EDTA (pH 7,8). - Ethidium bromide (EtBr) dùng để nhuộm bản gel: 2 l EtBr (10 mg/ml) trong 100 ml đệm TAE lX. + Hóa chất: Agar, pepton, glucose, MgSO4.7H2O, K2HPO4.7H2O, KH2PO4.7H2O, cao nấm men, Ca3(PO4)2,, (NH4)2SO4, KCl, MnSO4, FeSO4, mật rỉ đường, tinh bột tan, KNO3, NaCl. - Một số dụng cụ trang thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp.  Môi trường nghiên cứu: - Môi trường Ashby: Mannitol : 20,0 g K2HPO4 : 0,2 g MgSO4.7H2O : 0,2 g NaCl : 0,2 g K2SO4 : 0,1 g CaCO3 : 5,0 g Agar : 20,0 g Nước cất : 1.000 ml - Môi trường Hansen: Glucose : 5,0 g Peptone : 3,0 g MgSO4.7H2O : 3,0 g 21 K2HPO4.7H2O : 3,0 g KH2PO4.7H2O : 3,0 g Cao nấm men : 1,0 g Agar : 20,0 g Nước cất : 1.000 ml - Môi trường Gause-1: Tinh bột tan : 20,0 g Peptone : 20,0 g MgSO4.7H2O : 0,5 g K2HPO4.7H2O : 0,5 g KNO3 : 1,0 g NaCl : 0,5 g FeSO4.7H2O : 0,01g Agar : 20,0 g Nước cất : 1.000 ml - Môi trường SX1: Rỉ đường : 10,0 ml Nấm men : 5,0 g Agar : 20,0 g Nước cất : 1.000 ml 22 2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật. - Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật: + Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật truyền thống. + Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Xác định một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn chịu mặn được NaCl ≥ 1%, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật đã tuyển chọn: + Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. + Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy. + Ảnh hưởng của pH môi trường. 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn, tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật Thu thập mẫu đất trồng cây sầu riêng, bưởi Da xanh ở tỉnh Bến Tre đã bị ảnh hưởng của xâm nhập mặn. Mẫu đất được lấy ở độ sâu tầng đất 0-30 cm, 0,5 kg đất/mẫu, cho vào lọ nhựa sạch, ghi thông tin mẫu thu thập. Cân 1 g đất rồi pha loãng với nước cất cho đến khi dung dịch có nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-6 rồi nhỏ 0,1 ml dung dịch sang đĩa petri chứa môi trường đặc hiệu là Ashby đã bổ sung thêm muối NaCl 1% vào trong môi trường phân lập. Dùng que cấy vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ 30°C từ 4 - 7 ngày. Sau đó, chủng vi sinh vật được cấy chuyển sang các đĩa petri chứa môi trường Ashby khác để làm thuần. 2.5.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật của vi khuẩn chịu mặn được nồng độ muối NaCl ≥ 1% Theo tiêu chuẩn TCVN 10784:2015 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2015). 23 2.5.2.1. Phương pháp xác định định tính Các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần được nuôi cấy trên môi trường LB (Luria-Bertani medium) không có agar, có bổ sung 0,1% tryptophan ở 28oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trên máy lắc ổn nhiệt trong thời gian 2 ngày. Sau 2 ngày nuôi cấy, ly tâm ống nghiệm nuôi dịch vi khuẩn ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn. Thu lấy dịch trên tủa. Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử Salkowski với hàm lượng 2 ml dịch với 8 ml thuốc thử Salkowski (Gordon & Weber, 1951). Chỉ tiêu đánh giá: +: phản ứng với thuốc thử Salkowski (có phản ứng tạo màu); – : không phản ứng với thuốc thử Salkowski (không phản ứng tạo màu). Nếu thấy dịch đổi màu đỏ, hồng, hồng nhạt do IAA thô đã được sinh ra trong môi trường nuôi cấy. 2.5.2.2. Phương pháp xác định định lượng IAA Các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần được nuôi cấy trên môi trường LB (Luria-Bertani medium) không có agar, có bổ sung 0,1% tryptophan. Nuôi lắc trên máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện nhiệt độ ở 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, ly tâm ống nghiệm nuôi lắc vi khuẩn ở trên bằng máy ly tâm để bàn tốc độ 5.000 vòng/phút trong 7 phút để loại bỏ cặn. Thu dịch trên tủa. Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử Salkowski với hàm lượng 2 ml dịch nuôi cấy đã li tâm với 8 ml thuốc thử Salkowski. Đối chứng là 2 ml dịch thể không nuôi cấy vi khuẩn đã ly tâm với 8 ml thuốc thử Salkowski. Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử hàm lượng (1 ml dịch với 4 ml thuốc thử Salkowski), đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy (Glickmann & Dessaux, 1995). 24 Thí nghiệm được lặp lại 3 ống nuôi cấy. Chỉ tiêu đánh giá: - Hàm lượng IAA thô có trong môi trường (µg/ml). 2.5.3. Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn 2.5.3.1. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật truyền thống Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của Bergey (Niall & Paul, 2009). a) Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalase, nhu cầu oxy, các đặc điểm sinh hoá được thực hiện theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thường. * Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: - Đo kích thước khuẩn lạc. - Mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc. * Mô tả một số đặc điểm tế bào: - Quan sát hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép (Nguyễn Thành Đạt, 2007). - Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame sạch. - Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. - Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame sạch. - Đậy lamen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. - Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 - 1.000 lần. 25 b) Xác định khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường cơ bản LB (dạng dịch thể) ở điều kiện 2, thay thế các nguồn hydrat cacbon khác nhau. Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dương tính hay âm tính. c) Khả năng thủy phân tinh bột của chủng vi sinh vật Thu enzym từ môi trường lỏng: chủng vi sinh vật sau khi được nuôi trên môi trường LB không có agar. Lắc ở tốc độ 110 vòng/phút trong vòng 2 ngày. Sau đó, dịch thể được ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô. 2.5.3.2. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử a) Phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu mặn được chiết bằng phương pháp CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). Các bước thực hiện như sau: - Bước 1: Ngay trước khi chiết, ủ đệm chiết CTAB có bổ sung -ME (mercapto ethanol) với tỷ lệ 1 ml đệm CTAB/10 μL -ME trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 30 phút; - Bước 2: Dùng tăm nhọn vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt đĩa nuôi cấy (phần ngoài rìa) và cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml. Lượng khuẩn lạc vi khuẩn lấy khoảng 100 mg; - Bước 3: Cho 0,5 ml đệm CTAB đã ủ ở trên vào ống eppendorf chứa khuẩn lạc của vi khuẩn. Dùng chày nhựa chuyên dụng nghiền nhuyễn mẫu. Ủ ống ở 65oC trong 10 - 30 phút ở bể nhiệt; - Bước 4: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (khoảng 450 μl) cho vào ống eppendorf mới; - Bước 5: Cho chloroform: isoamylalcolhol (24 :1) vào ống với tỷ lệ thể tích tương đương. Đảo đều ống; 26 - Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (400 μl); - Bước 7: Lặp lại các bước 5, 6 thêm một lần nữa và thu dịch trên tủa (khoảng 300 μl); - Bước 8: Cho thể tích tương đương (300 μl) 2-propanol lạnh vào ống. Đảo đều ống và để lạnh ( 20oC) trong 30 phút; - Bước 9: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn có chứa DNA tổng số; - Bước 10: Rửa cặn bằng ethanol 70% hai lần (mỗi lần từ 0,7-1 ml); - Bước 11: Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ở trong buồng cấy. DNA tổng số được hòa trong 50 μl đệm TE và bảo quản ở điều kiện  20°C trong tủ lạnh sâu. b) Cặp mồi sử dụng và phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi 27F (5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’ TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) để nhân gen mã hóa 16S DNA ribosome của vi khuẩn chịu được nồng độ muối NaCl ≥ 1%, có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật (Weisburg et al., 1991). Cho vào mỗi ống PCR loại 0,5 ml, tổng thể tích phản ứng là 25 µl, trong đó có chứa 2,5 µl đệm PCR; 0,5 µl DNA tổng số; 0,5 µl dNTPs; 1 µl mỗi loại mồi và 0,2 µl Taq polymerase. Cho các ống vào máy PCR và thực hiện phản ứng PCR với điều kiện phản ứng sau: Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu biến tính 94 4 phút 1 Các chu kỳ tổng hợp 94 35 giây 35 50 35 giây 72 1 phút Kết thúc 72 5 phút 1 27 Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 mg/ml ethidium bromide. c) Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự Sản phẩm PCR được tinh sạch dùng PureLinkTM quick gel extraction kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các bước thực hiện như sau: i) Sau khi chạy điện di, dùng dao cắt phần gel agarose chứa sản phẩm PCR. Lượng gel cắt được cân (thường xấp xỉ 200 mg); ii) Cho 600 µl đệm GS1 vào tuýp đựng gel chứa DNA, ủ tuýp ở 50oC trong thời gian 10 phút trong bể nhiệt. Lắc tuýp để đảm bảo tan gel; iii) Cho toàn bộ dịch vào cột chứa màng liên kết DNA. Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột; iv) Cho 600 µl đệm GS1 vào cột để hoà tan gel còn sót. Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột; v) Cho 700 µl đệm rửa GS2 đã vào cột và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột. Ly tâm lại một lần nữa trong 2 phút để đảm bảo loại bỏ hết cồn; vi) Cho cột sang 1 tuýp mới. Cho 30-50 µl nước cất sạch vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ cột và thu dịch DNA tinh khiết trong tuýp. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được ước lượng nồng độ trên bản điện di agarose và được giải trình tự trực tiếp với bộ mồi dùng trong phản ứng PCR. Gửi mẫu giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc). d) Phương pháp phân tích trình tự sản phẩm PCR 28 Trình tự nucleotide của các mẫu vi khuẩn được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene). Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng Gen (GenBank) bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (National Center for Biotechnology Information, Hoa Kỳ). Phân tích trình tự và phân tích phả hệ được thực hiện với các phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX 1.83 và MEGA 6.0. e) Phương pháp phân tích phả hệ Trình tự nucleotide vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn có khả năng chịu mặn, có hoạt tính sinh học sẵn có trên Ngân hàng Gen cũng được sử dụng trong phân tích làm mẫu tham khảo (mẫu phân tích phả hệ ở trong phần phụ lục). Trước khi phân tích phả hệ, các trình tự nucleotide được căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm BioEdit 7.0 (Hall, 1999), ClustalW2 (McWilliam et al., 2013) và dùng chương trình trực tuyến (BLAST) để tìm kiếm các chuỗi nucleotide tương đồng có sẵn trên Ngân hàng Gen (GenBank) của Trung tâm Thông tin công nghệ quốc gia Hoa Kỳ. Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền giữa các chuỗi được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura 2 tham số, giá trị thống kê bằng kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011). 2.5.4. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn 2.5.4.1. Phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn của chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính sinh học được nuôi cấy trên môi trường Ashby ở các ngưỡng pH khác nhau và được đặt ở ngưỡng nhiệt độ 30oC ± 2oC. Các công thức thí nghiệm bao gồm: 29 CT1: môi trường Ashby bổ sung NaCl 1%; CT2: môi trường Ashby bổ sung NaCl 3%; CT3: môi trường Ashby bổ sung NaCl 5%. Mỗi một công thức lặp lại 3 đĩa petri. Chỉ tiêu theo dõi: - Đường kính khuẩn lạc (mm) sau cấy 7 ngày. - Đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc. 2.5.4.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính sinh học được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau và được đặt ở ngưỡng nhiệt độ 30oC ± 2. Các công thức thí nghiệm gồm: CT1: Ashby; CT2: Hansen; CT3: Gause-1; CT4: SX1. Chỉ tiêu theo dõi: Kích thước (mm) và hình thái khuẩn lạc. 2.5.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ Chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính sinh học được nuôi cấy trên môi trường Ashby ở ngưỡng nhiệt độ khác nhau. Các công thức thí nghiệm gồm: CT1: 25oC; CT2: 30oC; CT3: 35oC; CT4: 40oC. Chỉ tiêu theo dõi: Kích thước (mm) và hình thái khuẩn lạc. 30 2.5.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH Chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính sinh học được nuôi cấy trên môi trường Ashby ở các ngưỡng pH khác nhau. Các công thức thí nghiệm bao gồm: - CT1: pH 4; - CT2: pH 5; - CT3: pH 6; - CT4: pH 7. Chỉ tiêu theo dõi: Kích thước (mm) và hình thái khuẩn lạc. Mật độ vi sinh vật được xác định dựa trên phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, tính số lượng vi sinh vật trên mẫu thông qua số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa môi trường. Mật độ vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml, theo công thức: N =  21 1,0 nnd C   Trong đó: N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra CFU/ml; C là tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại; n1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; n2 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. 2.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu thí nghiệm được thu thập và xử lý bằng Microsoft Office Excel. 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT Trong nghiên cứu này, môi trường Ashby có bổ sung thêm muối NaCl 1% được sử dụng nhằm phân lập được vi sinh vật có hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật từ các mẫu đất trồng bưởi Da xanh và đất trồng sầu riêng bị ảnh hưởng của nhiễm mặn thu thập tại tỉnh Bến Tre và một số tỉnh lân cận. Kết quả thí nghiệm phân lập được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật từ mẫu thu thập tại Bến Tre và một số tỉnh lân cận TT Địa điểm thu thập Số mẫu phân lập Số chủng vi sinh vật có hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật 1 Bến Tre 14 7 2 Tiền Giang 6 2 3 Vĩnh Long 7 2 4 Trà Vinh 7 2 Tổng cộng 34 13 32 Hình 3.1. Tỷ lệ chủng vi khuẩn có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật trên các mẫu thu thập tại 4 tỉnh Kết quả phân lập cho thấy, từ 34 mẫu đất, đã có 13 chủng vi sinh vật có hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật được phân lập trên môi trường Ashby có bổ sung thêm muối NaCl 1%. Trong đó có 7 chủng vi sinh vật được phân lập trên các mẫu thu thập tại tỉnh Bến Tre (chiếm tỷ lệ 53,9%). Các chủng vi sinh vật phân lập được đều có khuẩn lạc dạng nhầy, chảy xệ, màu sắc trắng đục, trắng sữa hay vàng nhạt. A) B) 33 C) D) E) F) G) H) Hình 3.2. Một số hình thái khuẩn lạc của chủng vi sinh vật có khả năng chịu muối NaCl ≥ 1%, có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật A) T0326; B) T07010; C) T08030; D) T09005; E) T09008; F) T1009; G) T1103; H) T1402 34 3.2. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT CỦA VI KHUẨN CHỊU MẶN ĐƯỢC NỒNG ĐỘ MUỐI NaCl ≥ 1% 3.2.1. Đánh giá khả năng tổng hợp IAA của chủng vi khuẩn 3.2.1.1. Định tính với thuốc thử Salkowski Trong nghiên cứu này, môi trường Luria Bertani có bổ sung L - tryptophan được sử dụng đánh giá khả năng tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) bằng phương pháp so màu của vi sinh vật chịu mặn được nồng độ muối NaCl ≥ 1% từ các mẫu thu thập (bảng 3.2). Bảng 3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA của vi khuẩn chịu mặn bằng phương pháp so màu TT Mã chủng Phản ứng màu với thuốc thử Salkawski Đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA 1 T0818 Màu đỏ Có 2 T0707 Màu vàng nhạt Không 3 T0910 Màu vàng nhạt Không 4 T0817 Màu vàng nhạt Không 5 T2603 Màu vàng cam Có 6 T3402 Màu vàng nhạt Không 7 T3406 Màu vàng cam Có 8 T3407 Màu đỏ Có 9 T1003 Màu vàng cam Có 10 T0808 Màu vàng nhạt Không 35 11 T0810 Màu đỏ Có 12 T0906 Màu vàng cam Có 13 T0905 Màu vàng cam Có 14 Đối chứng (+) Màu đỏ Có 15 Đối chứng (-) Màu vàng nhạt Không Kết quả cho thấy, có 8/13 chủng vi sinh vật có khả năng làm thay đổi màu thuốc thử Salkowski trong dịch nuôi cấy, màu đỏ, hồng hay hồng nhạt. Điều này chứng có các chủng vi sinh vật này có khả năng tổng hợp IAA, trong khi đó có 5 chủng không có khả năng làm thay đổi màu thuốc thử Salkowski trong môi trường nuôi cấy (hình 3.3). 36 Hình 3.3. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA của chủng vi khuẩn bằng phương pháp so màu 37 Như vậy, bằng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski đã xác định được một số chủng vi khuẩn chịu mặn được nồng độ muối NaCl ≥ 1% và có khả năng tổng hợp IAA. 3.2.1.2. Đánh giá khả năng tổng hợp IAA của chủng vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang IAA là hợp chất có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh dưỡng của tế bào thực vật, có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển ở thực vật. Hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi khuẩn được xác định thông qua khả năng sinh tổng hợp IAA trong dịch nuôi cấy. Định lượng IAA bằng cách xây dựng đồ thị chuẩn IAA. Dựa vào chỉ số mật độ quang (optical density, OD) và nồng độ IAA trong dung dịch để xây dựng đồ thị đường chuẩn IAA tinh khiết. Lấy dịch đã ly tâm pha với thuốc thử hàm lượng (2 ml dịch với 8 ml thuốc thử Salkowski), so màu trên máy so màu ở bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết (Glickmann et al., 1995). Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA của chủng vi khuẩn chịu mặn bằng đo mật độ quang TT Mã chủng Hàm lượng IAA (µg IAA/ml)* 1 T0818 25,60 2 T0707 3,20 3 T0910 0,00 4 T0817 1,43 5 T2603 20,97 6 T3402 4,51 7 T3406 21,49 8 T3407 19,30 9 T1003 24,46 10 T0808 1,94 11 T0810 25,78 12 T0906 38,71 13 T0905 26,40 Ghi chú: đo ở bước sóng 530 nm 38 Hình 3.4. Hàm lượng IAA của các chủng vi khuẩn Kết quả cho thấy, có 4 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp IAA có hàm lượng ≥ 25 µg IAA/ml gồm T0818 (25,60 µg IAA/ml), T0810 (25,78 µg IAA/ml), T0906 (38,71 mg IAA/ml) và T0905 (26,40 µg IAA/ml), trong đó, chủng vi khuẩn T0906 có hàm lượng IAA thô trong dịch nuôi cấy đạt cao nhất. Một số chủng vi khuẩn mặc dù không nhuộm màu rõ rệt với thuốc thử Salk