Luận văn Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu ở Đắk Lắk

iệm và nhà lưới. Các chủng IISRBP 35 được định danhlà Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas EF568931), IISRBP 25 là P. putida (Pseudomonas EF568932), và IISRBP 17 là Bacillus megaterium (B. megaterium EU071712). Năm 2015, Nascimento và cộng sự đã phân lập được 28 chủng vi sinh vật nội sinh trên cây tiêu đen (Piper nigrum L.) thuộc 13 chi: Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Sinorhizobium, Agrobacterium, Ralstonia, Serratia, Cupriavidus, Mitsuaria, Pantoea, và Staphylococcus. Kết quả cho thấy, hai chủng vi sinh vât nội sinh Pt12 và Pt13, được xác định là Pseudomonas putida và Pseudomonas sp., tương ứng, 18 có thể ức chế F. solani f. sp piperis trong thử nghiệm in vitro. Trước đây, nhóm nghiên cứu này đã mô tả đặc tính phân tử của 23 vi sinh vật nội sinh từ hồ tiêu P. tuberculatum, trong đó có hai loài Pseudomonas có khả năng kiểm soát bệnh thối rễ của tiêu đen ở vùng Amazon. 1.2.3. Khả năng ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng chống nấm gây bệnh cây hồ tiêu Vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) là những vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển trong các mô của cây. Conn et al., (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm chủng Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana đã làm tăng sức đề kháng lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum, kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic và etylen. Mối liên hệ giữa VSV nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi VSV nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. Mujal et al., (2015) công bố chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ hồ tiêu Bacillus megaterium có hoạt tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hợp chất kháng nấm. Aravildet al., (2009, 2010), đã phân lập 71 chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ và thân cây hồ tiêu và tuyển chọn được 3 chủng có khả năng ức chế nấm thối rễ hồ tiêu Phytophthora capsici tới 70% trong điều kiện phòng thí nghiệm và mô hình trong nhà lưới. Ngoài ra, người ta cũng đã phát hiện nhiều loại vi nấm nội sinh trên thực vật và ký sinh trên tuyến trùng (nấm nội ký sinh): đây là các loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ thể tuyến trùng để ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng. Một số loài nấm như Nematoctonus spp, Meria coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định. 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM 1.3.1. Nghiên cứu bệnh gây hại trên cây hồ tiêu 19 Bẹ ̂nh hại nghiêm trọng nhất hiẹ ̂n nay đối với hồ tie ̂u là bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora và bệnh chết chạ ̂m có thể do sự cọ ̂ng hợp của các tác nhân nấm và tuyến trùng gây ra. a. Bệnh chết nhanh Bệnh chết nhanh ở Việt Nam được ghi nhận vào năm 1952, nhưng không được biết đến tác nhân gây bệnh. Tác giả Phạm Văn Biên et al. (1990) ghi nhận tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu là nấm Phytophthora palmivora và Diệp Đông Tùng et al. (1999) đã xác định tác nhân gây thối rễ chết cây hồ tiêu tại Phú Quốc là do nấm Phytophthora parasitica var. piperina. Theo Phan Quốc Sủng (2001) xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora spp. gây nên. Bằng phương pháp PCR, Trần Kim Loang et al.(2006) bước đầu đã xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu tại Tây Nguyên là nấm Phytophthora palmivora. Tác giả Nguyễn Vĩnh Trường (2008), dựa vào triệu chứng gây bệnh, đặc điểm hình thái của các chủng phân lập được từ 4 tỉnh: Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Bình Phước và Quảng Trị, đã xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu là do nấm Phytophthora capsici. Kết quả này đã được kiểm tra lại bằng phương pháp PCR-RFLP của vùng ITS, sử dụng primer ITS4 và ITS6. Tác giả Phạm Ngọc Dung et al. (2010) xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Đăk Nông là do nấm Phytophthora tropicalis một loài mới được phân tách từ loài Phytophthora capsici bằng kết quả chạy PCR và phân tích chuỗi Internal Transcribed Spacer (ITS). Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng trong đó có chế phẩm sinh học đa chức năng SH1 của Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora sp., chế phẩm Trichoderma spp. phòng trừ bệnh thối quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên, Trần Kim Loang et al.(2008). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng và chống bệnh nấm gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu. 20 b. Bệnh vàng lá chết chậm Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1991) cho biết ở tất cả các vùng trồng tiêu của Việt Nam đều có hiện tượng một số cây hoặc toàn bộ vườn chết toàn bộ, chỉ còn trơ lại cây nọc, gây thiệt hại rất lớn. Bệnh làm chết cả tiêu kiến thiết cơ bản và tiêu kinh doanh. Thông thường, bệnh chết chậm dẫn tới 10 - 30 % diện tích tiêu bị hại nặng không có khả năng cho thu hoạch. Một số vùng trồng tiêu lâu năm ở Phú Quốc và Quảng Trị, Quảng Bình bệnh này phát triển mạnh tạo thành dịch lớn, gây thiệt hại nặng nề và đe dọa ngành sản xuất tiêu ở đây. Ở Bình Long, Lộc Ninh tỷ lệ tiêu chết và bệnh là 30%, xã Bình Giã, Châu Thành, Đồng Nai có tới 90 % tiêu bị chết (Phạm Văn Biên, 1989). Theo tác giả Nguyễn Ngọc Châu (1995), đã ghi nhận cây hồ tiêu không chỉ bị bệnh do nhiều loại tuyến trùng ký sinh trên rễ như: Meloidogyne, Radophonus, Rotylencholus mà còn có một số nấm như: Fusarium, Rhizoctoniacùng tác động gây hại lên bộ rễ của cây tiêu. Những thao tác trong khi bón phân, xới xáo đất và đặc biệt trong mùa mưa nếu tạo ra các vết thương cho bộ rễ là điều kiện cho nấm bệnh xâm nhiễm và gây hại bộ rễ và cuối cùng cây bị chết. Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1993), các loài tuyến trùng Meloidogyne sp.tuy khác nhau về ký chủ song giống nhau về quá trình phát triển. Tốc độ và thời gian phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ, ánh sáng, ký chủ mà chúng gây hại. Theo Nguyễn Ngọc Châu (2003), các loài tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn, nấm, Rickettsia Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng. 1.3.2. Biện pháp phòng trừ bệnh cây hồ tiêu bằng biện pháp sinh học Ở Việt Nam, các nhà khoa học chỉ ra rằng sự chuyển dịch phần lớn nền nông nghiệp sang phương thức canh tác hữu cơ thì mới có thể vừa hạn chế tình trạng đói nghèo trên thế giới, vừa góp phần cải thiện môi trường và biến 21 đổi khí hậu. Hiện nông nghiệp hữu cơ đang được áp dụng trên toàn thế giới. Ở nước ta nông nghiệp hữu cơ đang ở giai đoạn đầu phát triển. Nông nghiệp hữu cơ nhằm tạo ra các sản phẩm hữu cơ có chất lượng cao, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, góp phẩn bảo vệ sức khỏe con người, bảo vệ môi trường sinh thái cộng đồng, giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu, đáp ứng với yêu cầu hội nhập kinh tế quốc tế. Với định hướng như vậy, trong thời gian gần đây, các hướng nghiên cứu về cây hồ tiêu chỉ tập trung vào các giải pháp khoa học công nghệ và thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu (Phạm Văn Biên, 2005), giải pháp quản lý tổng hợp dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu (Nguyễn Tăng Tôn, 2009), biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong sản xuất cây tiêu theo hướng bền vững (Đỗ Trung Bình, 2012 Phạm Thị Thùy, 2013), biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu (Nguyễn Văn Tuất, 2012), xây dựng mô hình ứng dụng tổng hợp một số sản phẩm phân bón sinh học-hoá học và thuốc bảo vệ thực vật sinh học-hoá học trong canh tác cây hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại Tây Nguyên (Nguyễn Thị Thu (2016) v.v Sử dụng vi sinh vật đối kháng sẽ khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây bệnh đây chính là hiệu quả của việc quản lý dịch hại dựa trên co ̛ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất. Biện pháp phòng trừ sinh học bằng các vi sinh vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có khả năng kháng nấm là việc làm cần thiết nhằm hạn chế sử dụng thuốc hóa học, phát triển phong phú quần thể vi sinh vật có lợi sẽ giúp cho cây trồng phát triển, tăng sức đề kháng sâu bệnh. Như vậy, ở Việt Nam chưa quan tâm nhiều đến nhóm vi sinh vật, đặc biệt là các vi sinh vật nội sinh đối kháng trong việc phòng chống bệnh cho cây hồ tiêu mà mới chỉ dừng lại ở việc sử dụng biện pháp hóa học cũng như các chế phẩm sinh học từ nấm rễ đã hiệu quả mang lại chưa cao. Đây là vấn đề nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát triển ổn định và bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam. 22 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Các mẫu cây hồ tiêu và chủng giống vi sinh vật kiểm định 1. Các mẫu cây hồ tiêu thu thập từ Đắk Lắk Mẫu cây hồ tiêu (3 mẫu rễ, 3 mẫu thân và 3 mẫu lá cây) được thu thập tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk tại 3 địa điểm với tọa độ như sau: 12°35’18’’B;108°11’7’’Đ, 12°35’19’’B; 108°11’8’’Đ, 12°35’24’’B;108°11’5’’Đ vào tháng 07/2017. 2. Chủng giống vi sinh vật kiểm định Ba chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum CNLM, Phytophthora capsici CNLM và Rhizoctonia solani CNLM được nhận từ Bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 1. Hóa chất: Cao malt Himedia, Ấn Độ; Cao nấm men Himedia, Ấn Độ; Cao thịt Himedia, Ấn Độ; Casein, Sigma, Mỹ; Thạch Agar Fluka, Đức; Pepton Fermentas, Mỹ; Glycerol; MgSO4.7H2O; K2HPO4: Merck, Đức. 2. Thiết bị nghiên cứu: Tủ cấy vô trùng Nunre, Mỹ Nồi hấp khử trùng ALP, Nhật Bản Tủ lạnh Panasonic, Nhật Bản Cân phân tích SMIC, Trung Quốc Tủ sấy Sanyo, Nhật Bản 23 Máy ly tâm lạnh Sorvall RC5B, Mỹ Máy ổn nhiệt N-Biotek, Mỹ Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ Máy đo pH Thermo Scientific, Mỹ Tủ cấy an toàn sinh học 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 1. Môi trường MPA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH7. 2. Môi trường NA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7. 3. Môi trường TSA (g/l): NaCl: 5; casein thủy phân: 15; peptone: 5; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7. 4. Môi trường KB (g/l): Casein thủy phân: 20; K2HPO4: 1,5; MgSO4.7H2O: 1,2; glyxerol khử trùng: 20ml; thạch: 18; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7. 5. Môi trường PDA (g/l): Glucose: 20; khoai tây: 300; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7. 6. Môi trường MPA + CMC (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5; CMC: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Živković Set al., 2010). 7. Môi trường MPA + Casein (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5; Casein: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kateka Det al., 2009). 8. Môi trường MPA + Chitin (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5; Chitin: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kasana RC et al., 2008). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu mẫu: Theo TCVN 8551: 2010 về cây trồng Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu, có thể tóm tắt như sau: Các mẫu cây hồ tiêu (hồ tiêu khỏe và hồ tiêu bị bệnh) trong mùa khô và mùa mưa được lấy bằng dao đã khử trùng và lưu giữ trong các túi nilon sạch. Mỗi mẫu cây hồ tiêu được chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilông sạch có 24 ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lý và phân tích trong vòng 48 giờ. 2.2.2. Khử trùng bề mặt và phân lập vi sinh vật nội sinh VSVNS được tiến hành phân lập từ các mẫu rễ, thân, lá của cây hồ tiêu theo phương pháp của Aravind và cộng sự, năm 2009. Mẫu rễ, thân, lá được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu. Các mẫu được khử trùng trong dung dịch 5% NaClO, 5 phút, rửa lại mẫu bằng dụng dịch 2% (w/v) Na2S2O3 trong 2 phút để loại bỏ clo dư. Tiếp tục xử lý mẫu trong ethanol 70% (v/v) trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng để loại bỏ ethanol và nhúng mẫu trong trong dung dịch 10% (w/v) NaHCO3 trong 5 phút để ức chế nấm cộng sinh. Sau khi khử trùng mẫu xong tiến hành phân lập mẫu trên môi trường dinh dưỡng phân lập vi sinh vật bằng cách rắc mẫu trên bề mặt môi trường phân lập và ủ ở 30oC trong 2-3 ngày. Theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng vi khuẩn có trong đĩa Petri. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi sinh vật khác nhau ra các đĩa Petri có chứa môi trường MPA. Bước đầu nhận dạng các loại vi sinh vật khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc (Aravind R. et al. 2009). 2.2.3. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật nội sinh với nấm bệnh Hoạt tính đối kháng được xác định theo Gong M et al., 2006 như sau: Sử dụng phương pháp thử nghiệm kép, nấm bệnh và vi sinh vật nội sinh được nuôi cách nhau 3 cm trên đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm) ở 27oC trong 6 ngày. Nếu vi sinh vật nội sinh có có khả năng ức chế nấm bệnh sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi sinh vật nội sinh, sợi nấm bệnh không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu. Còn nếu vi sinh vật nội sinh không có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh sẽ thấy nấm bệnh phát triển bình thường. Từ đó sơ bộ lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh. 2.2.4. Xác định khả năng ức chế nấm bệnh của dịch lọc vi sinh vật nội sinh 25 Xác định khả năng ức chế nấm bệnh được tiến hành bằng phương pháp đục lỗ như sau: Dịch nuôi cấy các chủng vi sinh được lọc loại bỏ sinh khối và nhỏ dịch lọc vào các lỗ thạch trên môi trường PDA đã cấy nấm gây bệnh (Lê Gia Hy, 2012). Sau 48-72 giờ nuôi trong tủ ấm 30oC, xác định vòng ức chế sinh trưởng của nấm. Từ đó lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh. 2.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh được mô tả theo phương pháp của Živković cùng cộng sự năm 2010 và Jeyaseelanet năm 2012. Tổng số VSVNS được cấy vệt trên môi trường thạch PDA, khoảng cách vệt cấy xấp xỉ 1cm với mép đĩa petri. Nấm gây bệnh được cắt khoảng 1cm2 và đặt đối diện với vệt cấy VKNS, đĩa không có vệt VKNS là đối chứng. Các mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3-5 ngày. Phần trăm ức chế tăng trưởng nấm sợi (RI%) được tính như sau: RI (%) = 𝐷1−𝐷2 𝐷1 x 100% D1: Chiều dài nấm sợi trên đĩa đối chứng. D2: Chiều dài nấm sợi trên đĩa có VKNS. Tỷ lệ ức chế tăng trưởng nấm sợi được đánh giá như sau: ˂ 30% = hoạt động kháng nấm thấp; 30 - 50% = hoạt động kháng nấm vừa phải; 50 - 70% = hoạt động kháng nấm cao; ≥ 70% = hoạt động kháng nấm rất cao. Những VSVNS có kết quả tỷ lệ kháng nấm gây bệnh lớn hơn 30% được lựa chọn và lưu giữ để nghiên cứu tiếp. 2.2.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng lựa chọn (theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey, 1989) Quan sát hình thái khuẩn lạc: Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không). Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn được quan sát, so sánh trên môi trường MPA ở nhiệt độ 35-37°C. Sau 26 24-48 giờ lấy mẫu quan sát kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường. Nhuộm Gram: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau theo Trần Thanh Thủy, 1999. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey, 1989: - Thử khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng vi sinh vật được thể hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn carbon (1,0 %, w/v): D-glucose, D-maltose, Myo-inositol, D-mannitol, Saccharose, Cellobiose, D-fructose, tinh bột tan. Sau 24 nuôi cấy, tiến hành đo OD dịch nuôi vi khuẩn. - Thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của chủng vi sinh vật được thể hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn nitơ (1,0 %, w/v): L-arginin, L-lysin, Methionin, Leusin, L-tryptophan, L-valine, L-alanine và glycine. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh với môi trường đối chứng âm (môi trường MPA). Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên môi trường MPA lỏng có pH môi trường trong khoảng từ pH 4,0 đến pH 8,0. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh kết quả từ đó chọn ra pH tối ưu nhất. Xác định nhiệt độ, nồng độ NaCl thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên môi trường MPA thạch ở các nhiệt độ khác nhau (20; 25; 30; 35; 45 và 45°C) và trên môi trường MPA thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 0,5 - 2,0% (w/v) ở 37°C, sau 24 giờ tiến hành quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật. 2.2.7. Phân loại vi sinh vật dựa trên phân tích trình tự gen Trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R đối với vi khuẩn có trình tự như trong bảng 2.1. 27 DNA tổng số của vi sinh vật và nấm được tách theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001). Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb Thermo scientific, Mỹ. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification Invitrogen, Mỹ và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST. Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA Tên đoạn mồi Trình tự mồi 27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’ 1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’ Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất. 2.2.8. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào Phương pháp cấy chấm điểm trên thạch theo Mohd và các cộng sự (2015) được tiến hành như sau: Cấy chấm điểm VKNS trên môi trường có 1% cơ chất tương ứng. Ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC trong 18-24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng thủy phân trên đĩa thạch môi trường. Môi trường thử khả năng sinh protease; MPA + cơ chất (1% cazein), thuốc nhuộm HgCl2 (5%) (Kateka et al., 2009). Môi trường thử khả năng sinh cellulase: MPA + cơ chất (1% CMC), thuốc nhuộm lugol (5%) Kasana et al., 2008). 28 Môi trường thử khả năng sinh chitinase: MPA + cơ chất (1% chitin), thuốc nhuộm lugol (5%) (Usharani et al., 2011). Đánh giá khả năng sinh enzyme: Hoạt tính enzyme = D-d (cm), trong đó: D: Đường kính vòng phân giải; d: Đường kính khuẩn lạc. 2.2.9. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp - Các môi trường được sử dụng để lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp: MPA, NA, TSA và. KB (xem thành phần môi trường) - Nghiên cứu thay đổi nguồn cacbon và ni tơ của môi trường được tuyển chọn: Nguồn (glucose, rỉ đường, saccaroza, dextriose, tinh bột tan và manitol), nguồn nitơ (bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt, cao thịt). - Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp: Chủng được nuôi trên môi trường tuyển chọn với thay đổi điều kiện lên men: các nhiệt độ khác nhau 20C; 25C; 30C; 35C; 40C; pH môi trường trong khoảng từ pH 5,0 đến pH 8,0; tỷ lệ tiếp giống 1, 3, 5, 7 và 9%; độ thông khí 5; 10; 15; 20; 25%. Sau 72 giờ tiến hành quan sát mức độ sinh trưởng và hoạt tính kháng nấm. 2.2.10. Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici CNLM trên cây hồ tiêu của chủng được tuyển chọn quy mô phòng thí nghiệm được tiến hành như sau: Phun dịch tế bào của vi sinh vật (108 tế bào/ml), dịch bào tử nấm (105 bào tử/ml) và nước vô trùng lên lá hồ tiêu trong 30’, lá hồ tiêu đặt trên giấy lọc ẩm trong đĩa Petri đã được vô trùng. Dịch huyền phù bào tử của nấm P. capsici chứa khoảng 105 bào tử/ml đã được chuẩn bị và phun lên lá đã được phun vi sinh vật tuyển chọn. Ủ ở 20ᵒC trong 12 giờ sáng/tối trong 10 ngày. Mức độ của mầm bệnh được đánh giá dựa trên mức độ từ 0 đến 4: 0 là không hiện tượng; 1:1-12% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 2: 13-25% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 3: 26-50% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 4: 51-100% vùng lá bị bao phủ bởi mầm bệnh màu nâu đen. Mỗi chủng nghiên cứu bao gồm 5 lá cắt rời thực hiện 3 lần lặp lại (Lee và Hwang, 1996). 29 2.2.11. Xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel năm 2017. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên công thức thống kê: Giá trị trung bình(X): X = 1 𝑛 ∑ X𝑛𝑖=1 I; Độ lệch chuẩn (δ): δ = √ ∑ (𝑋𝑖−𝑋)2𝑛𝑖=1 𝑛−1 ; Sai số (m): 𝑚 = ± δ 𝑚 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK 3.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ các mẫu cây hồ tiêu Từ 9 mẫu cây hồ tiêu được khử trùng bề mặt theo phương pháp của Aravind và cộng sự, 2009 và phân lập vi sinh vật nội sinh theo phương pháp của theo Gazis và cộng sự, 2012 trên 4 loại môi trường MPA, TSA, NA và KB. Sau thời gian nuôi cấy từ 1-3 ngày, đã phân lập và thuần khiết được 36 chủng vi sinh vật nội sinh được trình bày trên bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ các mẫu rễ, thân, lá trên hồ tiêu tại Đắk Lắk TT Ký hiệu chủng Vị trí phân lập Môi trường phân lập TT Ký hiệu chủng Vị trí phân lập Môi trường phân lập 1 HDL01 Rễ TSA 19 HDL19 Thân MPA 2 HDL02 Thân MPA 20 HDL20 Rễ NA 3 HDL03 Lá NA 21 HDL21 Rễ TSA 4 HDL04 Thân MPA 22 HDL22 Rễ NA 5 HDL05 Rễ MPA 23 HDL23 Thân MPA 6 HDL06 Thân TSA 24 HDL24 Rễ TSA 7 HDL07 Rễ MPA 25 HDL25 Rễ MPA 8 HDL08 Rễ KB 26 HDL26 Thân MPA 9 HDL09 Lá NA 27 HDL27 Rễ NA 10 HDL10 Rễ KB 28 HDL28 Thân KB 11 HDL11 Thân MPA 29 HDL29 Lá KB 12 HDL12 Thân NA 30 HDL30 Thân KB 13 HDL13 Lá MPA 31 HDL31 Lá MPA 14 HDL14 Rễ NA 32 HDL32 Thân TSA 15 HDL15 Rễ NA 33 HDL33 Thân MPA 31 16 HDL16 Thân KB 34 HDL34 Rễ TSA 17 HDL17 Lá TSA 35 HDL35 Thân KB 18 HDL18 Rễ MPA 36 HDL36 Rễ TSA Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy, số lượng các chủng vi sinh vật nôi sinh trên cây hồ tiêu khá phong phú, đa dạng và thu thập được cả 3 bộ phận của cây. So sánh với kết quả nghiên cứu của Nascimento và cộng sự năm 2015, nhóm nghiên cứu phân lập được 28 chủng VKNS từ các mẫu rễ, thân, lá trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.), của Vijay và cộng sự, 2011, đã phân lập được 17 chủng VKNS từ rễ, thân, lá của 10 cây tiêu lốt (Piper Longum L.) cùng thuộc họ Piperaceae . Tuy nhiên so sánh với kết quả của Toh và cộng sự, 2016 đã phân lập được 126 chủng VKNS từ rễ của các cây tiêu đen (Piper nigrum L.) hoặc Aravind và cộng sự, 2008, đã phân lập được 74 chủng VKNS từ 10 mẫu cây tiêu đen Ấn Độ (Piper nigrum L.) trong đó có 66 chủng phân lập từ rễ và 8 chủng phân lập từ thân, thì cho thấy tỷ lệ các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây hồ tiêu ở Cư Kuin, Đắk Lắk ở mức trung bình. Điều này chứng tỏ, mức độ đa dạng của các chủng vi sinh vật trên mẫu phụ thuộc vào phương pháp phân lập và vị trí địa lý vùng phân lập như khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH môi trường (Bảng 3.1). 3.1.2. Sơ bộ phân nhóm vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu phân lập được Trên cơ sở 36 chủng vi sinh vật đã thu nhận được, chúng tôi tiến hành phân tích, đánh giá mức độ phân bố theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu, được thể hiện qua hình 3.1. Hình 3.1: Vi sinh vật nội sinh theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu. 32 Kết quả Hình 3.2 cho thấy, vi sinh vật có mặt ở tất cả các bộ phận của cây, trong đó vi sinh vật nội sinh từ rễ chiếm số lượng cao nhất với 16 chủng (44,44%), tiếp theo là thân với 14 chủng (38,89%), số lượng được phân lập ít nhất ở lá với 6 chủng chiếm 16,67%. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới, ví dụ như Ko